Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong công nghệ sinh học hiện đại, enzyme thương mại giữ vai trò thiết yếu trong nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi và y tế. Theo số liệu tổng quan được tác giả dẫn giải, sản lượng enzyme toàn cầu đạt khoảng 300 nghìn tấn mỗi năm với giá trị thương mại vượt trên 500 triệu USD, trong đó enzyme thủy phân (hydrolase) chiếm khoảng 75% tổng lượng chế phẩm phục vụ phân giải cơ chất tự nhiên. Trong số này, protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất (chiếm lĩnh thị phần trong chế biến sữa, làm mềm thịt, sản xuất bia, chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da). Tuy nhiên, các nguồn chế phẩm protease truyền thống từ động vật hoặc thực vật thường chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase và chỉ chiếm 20–30% độ tinh khiết trong dịch nuôi cấy thô. Ngược lại, vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp đồng thời cả hai dạng enzyme trên với khả năng thủy phân tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.

Nhằm khắc phục nhược điểm mất hoạt tính của enzyme thông thường ở điều kiện nhiệt độ cao hoặc pH khắc nghiệt, việc khai thác các enzyme chịu nhiệt (thermostable enzymes) từ các vi sinh vật cổ (Archaea) sống tại sinh cảnh cực đoan mở ra hướng đi quan trọng. Cổ khuẩn hyperthermophiles có thể tồn tại và phát triển ở nhiệt độ trên 130°C và môi trường acid cao, cung cấp nguồn xúc tác sinh học bền nhiệt cho các quy trình công nghiệp và hạn chế hiện tượng biến tính sinh chuyển hóa in vitro. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, tác giả Lê Thị Trà Mi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp nhằm nghiên cứu và nhân dòng đoạn gene mã hóa enzyme aminopeptidase chịu nhiệt từ chủng cổ khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1.

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Nghiên cứu gene Tk 1284 và enzyme peptidase do gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.
  2. Nhân nhanh gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

Nhiệm vụ / Nội dung nghiên cứu (được đánh số theo văn bản):

  • Nội dung 1: Nhân gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng kỹ thuật PCR.
  • Nội dung 2: So sánh trình tự gene của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 bằng phần mềm tin sinh học.
  • Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ưu cho phản ứng khuếch đại gene Tk 1284 của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Đoạn gene TK 1284 mã hóa enzyme aminopeptidase có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 (mẫu ADN khuôn do TS. Phạm Bằng Phương cung cấp).
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ ngày 14/11/2015 đến ngày 14/05/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và đối tượng vi sinh vật

Đề tài dựa trên cơ sở sinh học phân tử và hóa sinh học protein của vi khuẩn cổ siêu chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. Chủng này thuộc giới Archaea, ngành Euryarchaeota, lớp Thermococci, bộ Thermococcales, họ Thermococcaceae, chi Thermococcus, ban đầu được phân lập tại một miệng núi lửa chứa lưu huỳnh trên đảo Kodakara (Nhật Bản) và từng mang tên Pyrococcus sp. KOD1. Vi khuẩn có dạng cầu không đều kích thước 1–2 µm, di chuyển bằng lông roi, thành tế bào cấu tạo từ lớp lipid di-ether, tetra-ether và màng glycoprotein ngoài cùng. Đây là sinh vật kỵ khí bắt buộc, dị dưỡng lưu huỳnh, có nhiệt độ sinh trưởng từ 60°C đến 100°C (tối ưu ở 95°C), nồng độ muối NaCl thích hợp 3%, pH sinh trưởng trung tính khoảng 7 và chu kỳ nhân đôi khoảng 40 phút trong điều kiện tối ưu. Hệ gen của chủng này là một nhiễm sắc thể vòng đơn kích thước 2.088.737 bp, tỷ lệ G+C đạt 52%, bao gồm 2.306 trình tự mã hóa protein (CDS) chiếm 92,1% bộ gen và 46 gen tRNA; sinh vật này có cấu trúc bộ gen đa bội chứa từ 7 đến 19 bản sao nhiễm sắc thể tùy giai đoạn phát triển.

Về hệ thống enzyme phân giải protein, protease (EC 3.4) thuộc nhóm hydrolase, gồm exopeptidase (phân cắt đầu mạch: aminopeptidase giải phóng acid amin ở đầu N; carboxypeptidase cắt ở đầu C) và endopeptidase (phân cắt liên kết nội mạch: serine, cysteine, aspartic và metallo proteinase). Khóa luận tập trung vào enzyme aminopeptidase nội bào không phụ thuộc ATP (ATP-independent intracellular protease) được mã hóa bởi gene TK 1284, thuộc họ protein PfpI và nhóm enzyme glutamine amidotransferase loại 1 (GATase1).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và tin sinh học

Nghiên cứu kết hợp phương pháp phân tích tin sinh học in silico với các kỹ thuật sinh học phân tử in vitro:

  1. Phương pháp tin sinh học: Khai thác cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng thuật toán RUNBLAST để xác định mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid; dùng phần mềm BioEdit để gióng hàng đa chuỗi (multiple sequence alignment) so sánh protein TK1284 với 4 chủng vi khuẩn cổ họ hàng (Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Thermococcus peptonophilus strain OG-1, Thermococcus nautili strain 30-1 và Thermococcus sp. AM4).
  2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số: Thực hiện bằng quy trình ly giải tế bào sử dụng đệm TE, dung dịch chất tẩy biến tính SDS 10%, xử lý phân giải protein bằng enzyme Proteinase K (20 mg/ml) ở 37°C trong 1 giờ; loại bỏ tạp chất bằng hỗn hợp Phenol:Chloroform (tỷ lệ 1:1); tủa acid nucleic bằng NaCl 5M và ethanol 95%; xử lý ARN bằng enzyme RNase (5 mg/ml, 37°C trong 30 phút); thu hồi và tinh sạch bằng NaOAc 3M và isopropanol, rửa cặn qua ethanol 70% và hòa tan trong đệm TE; nồng độ ADN được xác định bằng đo mật độ quang học ở bước sóng 260 nm.
  3. Phương pháp điện di trên gel agarose: Kiểm tra độ tinh sạch và kích thước ADN tổng số trên gel agarose 0,8%; kiểm tra sản phẩm PCR và dải nhiệt độ gắn mồi trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE (0,5X hoặc 1X); nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium bromide (EtBr) 0,01% trong 10–15 phút và chụp ảnh bản gel dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV).
  4. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Sử dụng cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu được thiết kế bổ sung trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn:
    • Mồi xuôi TK1284F: 5'-GCGGCCGCTACCATATGCATCATCATCATCAT-3'
    • Mồi ngược TK1284R: 5'-GAATTCTACCTCGAGTCACCTAAGAACCTT-3'
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl)
Đệm phản ứng (Buffer 10X) 10
Hỗn hợp dNTPs 4
Mồi xuôi (TK1284F) 2
Mồi ngược (TK1284R) 2
Enzyme Taq DNA polymerase 0,5
Nước khử ion ($H_2O$) 30
Tổng thể tích phản ứng 50

Chu trình nhiệt luân nhiệt PCR được thiết lập gồm 32 chu kỳ với các pha nhiệt độ: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; lặp lại 32 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C trong 60 giây, gắn mồi ở 66°C trong 40 giây, kéo dài ở 72°C trong 50 giây; kết thúc bằng pha kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10 phút và ủ bảo quản ở 4°C.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Chương này làm rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm các enzyme thủy phân có nguồn gốc tự nhiên sở hữu độ bền cơ học và hóa sinh vượt trội. Tác giả chỉ ra vai trò then chốt của protease trong công nghiệp và những hạn chế của enzyme thông thường khi vận hành ở quy mô công nghiệp do nhạy cảm với nhiệt độ và hóa chất. Luận điểm trọng tâm khẳng định các vi khuẩn cổ siêu chịu nhiệt sống tại miệng núi lửa như Thermococcus kodakarensis KOD1 là kho tàng gen quý giá cung cấp enzyme xúc tác bền nhiệt. Tác giả xác định rõ ràng mục đích, đối tượng, 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm và ý nghĩa khoa học - thực tiễn làm tiền đề cho việc tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme tái tổ hợp.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu quốc tế và trong nước về cổ khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1. Các nội dung bao gồm:

  • Lịch sử phân lập từ miệng núi lửa ngầm tại đảo Kodakara (Nhật Bản), phân loại học sinh vật thuộc chi Thermococcus, các đặc trưng sinh lý tế bào (kỵ khí bắt buộc, sinh trưởng tối ưu ở 95°C, phụ thuộc lưu huỳnh tạo $H_2S$).
  • Phân tích chi tiết hệ gen dựa trên công trình giải mã toàn bộ trình tự bộ gen của Đại học Kyoto (công bố năm 2005): nhiễm sắc thể vòng kích thước 2.088.737 bp, mật độ vùng mã hóa 92,1%, tỷ lệ G+C đạt 52%, chứa 2.306 CDS, sự hiện diện của hai hệ thống peptidase nội bào phụ thuộc ATP là protease FtsH và proteasome ClpP.
  • Phân loại học enzyme protease (hydrolase EC 3.4), đối chiếu cơ chế cắt liên kết peptide của exopeptidase (aminopeptidase, carboxypeptidase) và 4 nhóm endopeptidase (serine, cysteine, aspartic, metallo protease).
  • Tổng hợp các ứng dụng công nghiệp của protease trong chế biến thịt, sản xuất dịch đạm keratin từ da lông vũ, công nghệ chế biến nước mắm ngắn ngày bằng enzyme, sản xuất phô mai và công nghiệp bánh mì.
  • Phân tích đặc tính sinh học của protein TK1284: enzyme aminopeptidase kích thước khoảng 50 kDa hoặc dạng monomer 160 acid amin, thuộc nhóm serine peptidase hoạt động trong dải pH rộng, bền vững ở nhiệt độ phòng mà không mất hoạt tính.
  • Tổng quan lịch sử nghiên cứu: Khẳng định trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sâu về cấu trúc tinh thể, hệ gen và các enzyme của T. kodakarensis KOD1 (như DNA polymerase, chitinase, cyclodextrinase, lysophospholipase), nhưng tại Việt Nam thời điểm năm 2016 chưa có công trình hay bài báo khoa học nào công bố về việc nghiên cứu và nhân dòng gene TK 1284 từ chủng này.

Phần III: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị chuyên dụng và quy trình thao tác kỹ thuật:

  • Mẫu ADN khuôn sạch của T. kodakarensis KOD1 do giảng viên hướng dẫn cung cấp.
  • Liệt kê toàn bộ hệ thống trang thiết bị tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật: máy PCR, bộ nguồn và bể điện di, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, máy đo mật độ quang học OD, hệ thống máy soi chụp ảnh gel UV, cân phân tích, lò vi sóng.
  • Trình bày công thức thành phần môi trường nuôi cấy kỵ khí bổ sung bột lưu huỳnh và $Na_2S\cdot 9H_2O$, sục khí nitơ ($N_2$).
  • Quy trình chuẩn hóa 13 bước tách chiết ADN tổng số vi khuẩn bằng phương pháp hóa lý cổ điển Phenol - Chloroform kết hợp enzyme phân giải Proteinase K và RNase.
  • Bản đồ enzyme cắt giới hạn không cắt trên chuỗi gene TK 1284 (phục vụ chọn enzyme tạo dòng sau này).
  • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu TK1284F và TK1284R tích hợp đuôi nhận biết enzyme giới hạn, thiết lập công thức phản ứng PCR thể tích 50 µl và quy trình luân nhiệt 32 chu kỳ.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương này phản ánh toàn bộ số liệu và kết quả thu được qua 4 nội dung thí nghiệm:

  1. Kết quả phân tích tin sinh học gene TK1284: Đoạn gen TK 1284 có chiều dài 500 bp (chính xác 501 bp), mã hóa chuỗi polypeptide gồm 160 acid amin. Phân tích miền chức năng (conserved domain) xác định protein chứa:
    • Miền GATase1 (Type 1 glutamine amidotransferase): Enzyme nội bào không phụ thuộc ATP, có khả năng phân cắt các peptide ngắn tạo nguồn dinh dưỡng; trung tâm hoạt động chứa gốc Cysteine xúc tác kết hợp với Histidine cùng monomer và Glutamate từ monomer kế cận.
    • Miền Intracellular protease họ PfpI: Tương đồng với protein PfpI của Pyrococcus furiosus và PH1704 của Pyrococcus horikoshii. Cấu trúc hoạt tính chỉ xuất hiện khi phân tử ở trạng thái oligomer (vòng hexamer 6 phân tử), trung tâm xúc tác hình thành từ bộ ba Cys-101, His-102 và gốc Glu lân cận. So sánh với 4 chủng vi khuẩn cổ họ hàng cho thấy độ tương đồng chuỗi bảo tồn đạt trên 80%.
  2. Kết quả tách chiết ADN tổng số: Điện di hai mẫu tách chiết (KOD1_1 và KOD1_2) trên gel agarose 0,8% đối chiếu thang chuẩn phân tử (Marker 10.000 bp). Cả hai mẫu đều hiển thị một băng vạch sáng rõ, kích thước lớn trên 20 kb, ít bị đứt gãy, không xuất hiện băng phụ hoặc vết kéo vệt (smear), khẳng định ADN đạt độ tinh sạch cao làm khuôn mẫu PCR.
  3. Kết quả khuếch đại gene TK1284 bằng phản ứng PCR: Sản phẩm nhân dòng bằng cặp mồi TK1284F/TK1284R khi điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy một băng ADN duy nhất, sáng rõ, kích thước đúng khoảng 500 bp tương ứng kích thước lý thuyết của gene TK 1284, chứng minh cặp mồi có tính đặc hiệu cao.
  4. Kết quả khảo sát dải nhiệt độ gắn mồi PCR: Tác giả tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR tại 10 mức nhiệt độ gắn mồi khác nhau trải dài từ 55°C đến 66°C nhằm tìm điểm tối ưu.
Thứ tự giếng mẫu Nhiệt độ gắn mồi ($T_m$ - °C) Đánh giá băng sản phẩm PCR (gel agarose 1,5%)
Mẫu 1 55,00 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 2 55,99 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 3 58,63 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 4 59,84 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 5 61,27 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 6 62,48 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 7 64,13 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 8 65,23 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 9 65,89 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp
Mẫu 10 66,00 Băng ADN sáng rõ, đặc hiệu, kích thước 500 bp

Kết quả điện di chứng minh ở toàn bộ dải nhiệt độ từ 55°C đến 66°C, hiệu quả nhân gen đều đồng nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ hay hiện tượng mất băng. Điều này khẳng định dải nhiệt độ bám mồi của cặp mồi thiết kế rất rộng, tạo độ linh hoạt cao khi thực hiện phản ứng khuếch đại.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết ngắn gọn 2 phát hiện cốt lõi: xác định cấu trúc miền chức năng protease nội bào không phụ thuộc ATP họ PfpI của gene TK 1284 qua tin sinh học và nhân bản thành công đoạn gene 500 bp bằng kỹ thuật PCR. Đề xuất 3 hướng đi tiếp theo về việc tạo dòng vào vector, biểu hiện tế bào chủ và tinh sạch kiểm tra hoạt tính enzyme.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu cụ thể

  • Tách chiết thành công ADN tổng số từ sinh khối vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1; kết quả điện di xác nhận phân tử ADN nguyên vẹn, kích thước lớn vượt 20 kb, không lẫn tạp chất hay bị thoái hóa phân đoạn.
  • Xác định đầy đủ đặc điểm phân tử của gene TK 1284: Chiều dài đoạn mã hóa là 500 bp, dịch mã thành chuỗi peptide gồm 160 acid amin. Phân tích tin sinh học làm rõ hai vùng bảo tồn đặc trưng: miền GATase1 và miền protease nội bào họ PfpI. Protein này hoạt động không phụ thuộc ATP, có trung tâm xúc tác cấu tạo từ bộ ba amino acid Cys-101, His-102 và một gốc Glu lân cận trên cấu trúc đa phân tử (oligomer), tương đồng trên 80% với các protease của các chủng vi khuẩn cổ siêu chịu nhiệt khác (Pyrococcus, Thermococcus).
  • Khuếch đại thành công đoạn gene mục tiêu TK 1284 bằng phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế đặc hiệu (TK1284F và TK1284R), sản phẩm khuếch đại đạt độ đồng nhất cao, hiển thị băng vạch duy nhất ở kích thước 500 bp trên gel agarose.
  • Thiết lập được dải nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR nhân gene TK 1284 trong khoảng nhiệt độ rộng từ 55°C đến 66°C thông qua thử nghiệm 10 mức nhiệt gradient.

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

  • Đóng góp khoa học: Cung cấp dẫn liệu phân tử và dữ liệu tin sinh học bước đầu tại Việt Nam về đoạn gene TK 1284 mã hóa aminopeptidase chịu nhiệt của chủng Thermococcus kodakarensis KOD1, bổ sung cơ sở lý luận về cấu trúc miền bảo tồn của họ protease nội bào PfpI ở sinh vật cổ.
  • Đóng góp thực tiễn: Chuẩn hóa quy trình PCR khuếch đại gene TK 1284 với cặp mồi gắn sẵn vị trí cắt enzyme giới hạn, cung cấp vật liệu di truyền tinh sạch để phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu tiếp theo về tạo dòng biểu hiện trên vector plasmid (pGEM-T Easy, pET-28a), hướng tới thu nhận enzyme tái tổ hợp chịu nhiệt ứng dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm và dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

Do giới hạn về thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp (6 tháng) và điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm chuyên ngành, nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở phạm vi phân tích dữ liệu tin sinh học in silico, tách chiết hệ gen và nhân bản đoạn gene mục tiêu TK 1284 qua kỹ thuật PCR. Tác giả chưa tiến hành biến nạp tạo dòng vào tế bào khả nạp, chưa tạo vector biểu hiện tái tổ hợp, chưa thực hiện biểu hiện protein trong hệ thống tế bào chủ (Escherichia coli) cũng như chưa tiến hành tinh sạch để đo đạc động học và hoạt tính phân giải cơ chất thực tế của enzyme aminopeptidase.

Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề xuất của tác giả)

  • Chèn đoạn gene TK 1284 thu được từ sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy để tạo cấu trúc tái tổ hợp pGEM-T Easy – Tk1284, tiến hành biến nạp và giải trình tự kiểm tra độ chính xác.
  • Chuyển đoạn gene sang vector biểu hiện pET-28a để tạo cấu trúc pET-28a – Tk1284, biến nạp vào tế bào chủ biểu hiện protein (E. coli BL21).
  • Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TK1284 bằng chất cảm ứng IPTG.
  • Thu nhận sinh khối tế bào, tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ái lực (dựa vào đuôi His-tag tích hợp sẵn trên đầu mồi) hoặc xử lý sốc nhiệt để loại bỏ protein nội sinh của tế bào chủ.
  • Kiểm tra, đánh giá hoạt tính thủy phân liên kết peptide, xác định nhiệt độ và pH tối ưu cũng như tính ổn định nhiệt của enzyme aminopeptidase tinh sạch.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các đối tượng và hoạt động nghiên cứu sau:

  • Sinh viên đại học và học viên cao học: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Công nghệ Thực phẩm, Hóa sinh học và Vi sinh vật học đang thực hiện các khóa luận, luận văn liên quan đến công nghệ gen và enzyme học.
  • Nghiên cứu viên làm việc về vi sinh vật chịu nhiệt: Cung cấp thông tin tổng hợp có hệ thống về đặc điểm sinh thái, nuôi cấy kỵ khí và cấu trúc bộ gen của cổ khuẩn siêu chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1.
  • Phần nội dung đáng tham khảo nhất trong văn bản:
    1. Quy trình chuẩn 13 bước tách chiết và tinh sạch ADN tổng số chất lượng cao từ vi khuẩn cổ có cấu trúc màng lipid phức tạp (sử dụng Phenol - Chloroform, Proteinase K và RNase).
    2. Kỹ thuật thiết kế mồi PCR nhân đoạn gene có tích hợp trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn phục vụ kỹ thuật tạo dòng định hướng.
    3. Phương pháp khảo sát và tối ưu hóa dải nhiệt độ gắn mồi gradient (gradient PCR) qua thực nghiệm điện di gel agarose.

Câu hỏi thường gặp

1. Gene TK1284 từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 có kích thước bao nhiêu và mã hóa sản phẩm gì?

Gene TK 1284 có kích thước 500 bp (chính xác trong chuỗi nucleotide phụ lục là 501 bp), mã hóa cho một chuỗi polypeptide gồm 160 acid amin. Sản phẩm protein được dự đoán có chức năng là enzyme aminopeptidase/peptidase nội bào không phụ thuộc ATP (ATP-independent intracellular protease), thuộc họ protein PfpI và nhóm enzyme glutamine amidotransferase loại 1 (GATase1).

2. Cặp mồi được tác giả thiết kế để nhân gene TK1284 có trình tự như thế nào?

Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong phản ứng PCR gồm:

  • Mồi xuôi (TK1284F): 5'-GCGGCCGCTACCATATGCATCATCATCATCAT-3'
  • Mồi ngược (TK1284R): 5'-GAATTCTACCTCGAGTCACCTAAGAACCTT-3' Hai mồi này được tích hợp thêm các đoạn trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn để phục vụ ghép nối vào vector tách dòng và vector biểu hiện ở các bước nghiên cứu tiếp theo.

3. Dải nhiệt độ gắn mồi tối ưu của phản ứng PCR nhân gene TK1284 được xác định là bao nhiêu?

Qua thực nghiệm kiểm tra gradient nhiệt độ trên 10 mẫu phản ứng với các mức nhiệt độ gắn mồi khác nhau gồm: 55,00°C; 55,99°C; 58,63°C; 59,84°C; 61,27°C; 62,48°C; 64,13°C; 65,23°C; 65,89°C và 66,00°C, kết quả điện di đều cho thấy băng sản phẩm 500 bp sáng rõ và đặc hiệu như nhau. Tác giả kết luận dải nhiệt độ gắn mồi thích hợp để chạy phản ứng PCR khuếch đại gene TK 1284 rất rộng, nằm trong khoảng từ 55°C đến 66°C.

4. Kết quả phân tích tin sinh học chỉ ra đặc điểm cấu trúc không gian và trung tâm xúc tác của enzyme do TK1284 mã hóa như thế nào?

So sánh trình tự với protein PH1704 từ Pyrococcus horikoshii và PfpI từ Pyrococcus furiosus, enzyme do TK 1284 mã hóa chỉ thể hiện hoạt tính protease khi tồn tại ở cấu trúc đa phân tử oligomer (vòng 6 phân tử/hexamer). Trung tâm xúc tác của enzyme được hình thành từ bộ ba gốc amino acid gồm Cysteine (Cys-101), Histidine (His-102) trên cùng một monomer và Glutamate (Glu) từ monomer kế cận. Trình tự chuỗi bảo tồn của protein TK1284 đạt độ tương đồng trên 80% so với 4 protein protease đã biết từ các loài thuộc chi Thermococcus và Pyrococcus.

5. Kết quả tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 được đánh giá ra sao trên gel điện di?

Mẫu ADN tổng số sau khi tách chiết bằng phương pháp Phenol - Chloroform được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (đối chứng với thang chuẩn phân tử Marker 10.000 bp). Cả hai mẫu kiểm tra đều cho một băng vạch sáng rõ có kích thước tương đương trên 20 kb, mạch ADN ít bị đứt gãy và không xuất hiện băng phụ, chứng minh phân tử ADN nguyên vẹn và đủ tiêu chuẩn làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Trà Mi đã hoàn thành việc phân tích đặc điểm phân tử và nhân dòng thành công gene TK 1284 từ cổ khuẩn siêu chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. Nghiên cứu xác định đoạn gen dài 500 bp mã hóa chuỗi protein 160 acid amin thuộc họ protease nội bào không phụ thuộc ATP PfpI, có mức độ tương đồng trên 80% với các protease sinh vật cổ chịu nhiệt đã công bố. Kết quả thực nghiệm đã chuẩn hóa thành công quy trình phản ứng PCR với dải nhiệt độ gắn mồi tối ưu linh hoạt từ 55°C đến 66°C, tạo ra sản phẩm gen tinh sạch làm tiền đề trực tiếp cho các nghiên cứu biểu hiện và sản xuất chế phẩm enzyme aminopeptidase bền nhiệt phục vụ công nghiệp.