Luận văn thạc sĩ nghiên cứu và khuyếch đại gene tk 1284 mã hóa enzyme peptidase của vi khuẩn chịu nhiệt thermonococcus kodakarensis kod1

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu và khuyếch đại gene tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1.

• Tác giả: Lê Thị Trà Mi
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bằng Phương
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích và nội dung của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
• 2.2. Đặc điểm chung về hệ gen
• 2.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
• 2.4. Tổng quan về protein của TK 1284
• 2.4.1. Enzyme protease
• 2.4.2. Hệ thống phân loại enzyme protease
• 2.4.3. Ứng dụng
• 2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp so sánh trình tự protein
• 3.3.2. Phương pháp nuôi cấy
• 3.3.3. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
• 3.3.4. Phương pháp PCR
• 3.3.5. Phương pháp điện di
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ mồi ảnh hưởng đến phản ứng PCR
• 4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số
• 4.3. Nhân gene TK 1284 từ chủng vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR
• 4.4. Kết quả so sánh trình tự TK 1284 với các protein đã biết trên ngân hàng NCBI bằng phần mềm Runblast và bioedit
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu gene

Nghiên cứu gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermonococcus kodakarensis KOD1 là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Việc khuyếch đại gene này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, y tế và công nghiệp. Gene Tk 1284 có khả năng mã hóa enzyme có tính kháng nhiệt cao, điều này rất có ý nghĩa trong việc phát triển các sản phẩm enzyme có khả năng hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt. Việc nghiên cứu này cũng góp phần vào việc khám phá các gene mới và phát triển các công nghệ sinh học tiên tiến.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là khuyếch đại gene Tk 1284 và xác định các đặc tính của enzyme peptidase do gene này mã hóa. Nghiên cứu sẽ sử dụng kỹ thuật PCR để nhân nhanh gene Tk 1284 từ vi khuẩn Thermonococcus kodakarensis KOD1. Bên cạnh đó, việc so sánh trình tự gene với các protein đã biết trên ngân hàng NCBI sẽ giúp xác định tính tương đồng và đặc điểm của enzyme này. Điều này không chỉ giúp làm rõ vai trò của gene Tk 1284 mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển enzyme có khả năng chịu nhiệt cao.

II. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

Vi khuẩn Thermonococcus kodakarensis KOD1 là một loài cổ khuẩn ưa nhiệt, có khả năng phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ 60 đến 100 độ C. Việc phân lập và nghiên cứu vi khuẩn này đã chỉ ra rằng nó có khả năng sản xuất enzyme peptidase với hoạt tính cao. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn này cho thấy nó có thể phát triển mạnh trong môi trường có chứa lưu huỳnh, điều này rất quan trọng cho quá trình sản xuất enzyme. Việc nghiên cứu về hệ gen của Thermonococcus kodakarensis KOD1 cũng đã chỉ ra rằng gene Tk 1284 có vai trò quan trọng trong việc mã hóa enzyme có khả năng hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt.

2.1. Đặc điểm sinh học

Vi khuẩn Thermonococcus kodakarensis KOD1 có cấu trúc tế bào đặc biệt với lớp di-ether và tetra-ether lipids, giúp nó chịu được nhiệt độ cao. Thời gian thế hệ của vi khuẩn này là khoảng 40 phút, cho thấy khả năng sinh trưởng nhanh chóng trong điều kiện tối ưu. Việc nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi khuẩn này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về khả năng sinh sản mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong sản xuất enzyme có tính kháng nhiệt cao. Các enzyme này có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ chế biến thực phẩm đến sản xuất dược phẩm.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu gene Tk 1284 được thực hiện thông qua các phương pháp hiện đại như kỹ thuật PCR và phân tích trình tự gene. Kỹ thuật PCR cho phép nhân nhanh gene từ mẫu vi khuẩn, trong khi phân tích trình tự gene giúp xác định cấu trúc và chức năng của enzyme peptidase. Việc sử dụng phần mềm tin sinh học để so sánh trình tự gene với các protein đã biết trên ngân hàng NCBI là một bước quan trọng trong việc xác định tính tương đồng và đặc điểm của enzyme này. Các phương pháp này không chỉ giúp khuyếch đại gene mà còn cung cấp thông tin quý giá về hoạt tính và ứng dụng của enzyme trong thực tiễn.

3.1. Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân nhanh gene Tk 1284 từ vi khuẩn Thermonococcus kodakarensis KOD1. Phương pháp này cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của gene trong thời gian ngắn, giúp dễ dàng phân tích và nghiên cứu. Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR được xác định để đảm bảo hiệu quả khuyếch đại cao nhất. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất trong nghiên cứu. Kỹ thuật này không chỉ giúp khuyếch đại gene mà còn mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu sâu hơn về enzyme và ứng dụng của nó trong công nghiệp.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy gene Tk 1284 đã được khuyếch đại thành công và enzyme peptidase có hoạt tính cao đã được xác định. Việc so sánh trình tự gene với các protein đã biết cho thấy tính tương đồng cao, điều này chứng tỏ rằng enzyme này có thể có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các enzyme có khả năng chịu nhiệt cao từ vi khuẩn này có thể được sử dụng trong chế biến thực phẩm, sản xuất dược phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác. Nghiên cứu này không chỉ đóng góp vào kho tàng kiến thức về enzyme mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm enzyme có giá trị.

4.1. Ứng dụng thực tiễn

Enzyme peptidase từ gene Tk 1284 có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme này có thể được sử dụng để làm mềm thịt, cải thiện chất lượng sản phẩm và tăng hương vị. Trong ngành dược phẩm, enzyme có khả năng hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học. Việc nghiên cứu và phát triển enzyme từ vi khuẩn chịu nhiệt như Thermonococcus kodakarensis KOD1 không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực nhƣ: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…[1] Hàng năm lƣợng enzyme đƣợc sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300 nghìn tấn với giá trị trên 500 triệu USD, đƣợc phân phối trong các ngành khác nhau[1]. Phần lớn enzyme đƣợc sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy[2]. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân, đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Ngành sản xuất các hóa chất công nghiệp dựa trên xúc tác sinh học đã cho thấy có nhiều lợi thế so với tổng hợp hóa học, ví dụ nhƣ sản xu ất có chọn lọc các đồng phân quang học hay là sử dụng sinh khối, hỗn hợp phức tạp các phân tử hữu cơ, làm nguyên liệu[3].

Việc sử dụng enzyme chịu nhiệt nhƣ là chất xúc tác khi thiết kế quy trình chuyển hóa, chứa toàn bộ hệ thống enzyme chịu nhiệt, cấu tạo nên chuổi phản ứng mà chúng ta muốn, sẽ làm biến tính các enzyme nội sinh của tế bào và vì thế chúng ta chỉ cần một bƣớc chuẩn bị để có thể có một hỗn hợp các enzyme chịu nhiệt. Thêm vào đó, do đặc tính bền của enzyme chịu nhiệt nên chúng ta có thể hạn chế bất lợi cơ bản của sinh chuyển hóa in vitro, là không có khả năng tổng hợp và tái tạo protein. Protease là enzyme đƣợc sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất nhƣ: chế biến thực phẩm (làm đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lƣợng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế. Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhƣ là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều n 2 hơn.

Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở chế phẩm thu đƣợc sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chƣa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm từ 20-30 %[1]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao.

Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Đặc biệt là các vi khuẩn cổ sống môi trƣờng khắc nghiệt, có tính chống chịu với cả nhiệt hay axít và kiềm, là nguồn tạo ra các enzyme có thể hoạt động dƣới những điều kiện khắc nghiệt. Những enzyme phát hiện đƣợc tạo ra từ các vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt trên 130˚C, có thể tồn tại và phát triển ở những nơi có nồng độ acid cao…. [1]với những khả nhƣ vậy nó rất có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học, cho sự phát triển của các ngành sản xuất.

Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo enzyme từ vi khuẩn này là cấp thiết, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme protease trong nghiên cứu nói chung và công nghiệp xuất nói riêng là quan trọng và cấp thiết, xuất phát từ lý do trên, tôi xin tiến hành đề tài: “Nghiên cứu và khuyếch đại gene Tk 1284 mã hóa enzyme peptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” hy vọng sẽ khuyếch đại đƣợc dòng gene Tk 1284 mã hóa enzyme aminopeptidase của vi khuẩn T. Kodakarensis đáp ứng nhu cầu cần thiết. Mục đích và nội dung của đề tài 1. Mục đích  Nghiên cứu gene Tk 1284 và enzyme peptidase do gen Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.

 Nhân nhanh gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR. Nội dung Nội dung 1: Nhân gene Tk1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng kỹ thuật PCR Nội dung 2: so sánh trình tự gene của vi khuẩn T. kodakarensis KOD1 bằng phần mềm tin sinh học. Nội dung 3: Xác định nhiệt độ PCR tối ƣu, cho phản ứng khuyếch đại gene Tk1284 của vi khuẩn T.

kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học  Nghiên cứu gene Tk1284 và enzyme peptidase của gen Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 mã hóa.  Nhân nhanh gene Tk 1284 của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 bằng phản ứng PCR.

Ý nghĩa thực tiễn Đóng góp một phần vào việc nghiên cứu và tìm ra enzyme có khả năng chịu đƣợc điều kiện khắc nghiệt. Là tiền đề tạo dòng enzyme do gene Tk1284 mã hóa của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, từ đó tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme. n 4 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 2.

Nguồn gốc Thermococcus kodakaraensis là một loài cổ khuẩn ƣa nhiệt, trong đó T.kodakarensis KOD1 là chủng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong các chủng của chi Thermococcus[4]. Thermococcus kodakaraensis KOD1, đã đƣợc phân lập tại một miệng núi lửa (khí lƣu huỳnh trào ra từ một lỗ thủng) trên hòn đảo Kadakara, Nhật Bản[5]. Lần đầu tiên phân lập ngƣời ta đặt tên là Pyrococcus sp. KOD1, với khả năng chịu đƣợc nhiệt độ và các điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng, tuy nhiên dựa vào hệ thống cây phân loại loài, thì nó thuộc giống Thermococcus, dựa trên trình tự chuỗi 16S RNA giữa các loài khác nhau và chủng KOD1 là đại diện mới của Thermococcus, đƣợc gọi là Thermococcus kodakaraensis KOD1[6].1: Nơi phân lập Tế bào T.

Kodakarensis có đƣờng kính cầu khuẩn không đều kích thƣớc 1-2µm và có khả năng di chuyển dễ dàng nhờ lông roi[7]. Cấu tạo thành tế bào bao gồm: một lớp di-ether, tetra-ether lipids, và lớp glycoprotein ngoài cùng[7]. Kodakarensis là vi khuẩn yếm khí bắt buộc, dị dƣỡng và phát triển mạnh trên môi trƣờng có sự hiện diện của nguyên tố lƣu huỳnh, tạo n 5 khí huydrogen sulfide[8]. Trong điều kiện tối ƣu thời gian thế hệ của vi khuẩn T.kodakarensis là 40 phút 1 thế hệ[9].

Các điều kiện về lƣu huỳnh cần cho sự tăng trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Trong trƣờng hợp không có lƣu huỳnh, hydrogen sẽ đƣợc sản xuất thay vì hydrogen sulfide. Phân loại Hình 2.3: Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus n 6 Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 đƣợc phân loại nhƣ sau: - Giới : Archaea - Ngành : Euyarchaeota - Lớp : Thermococci - Bộ : Thermococcales - Họ : Thermococcaceae - Chi : Thermococcus - Loài : Thermococus kodakarensis KOD1 2. Đặc điểm chung về hệ gen Kích thƣớc gene T.737 bp chứa khoảng 2358 gen, toàn bộ trình tự đã đƣợc Đại học Kyoto, Nhật Bản giải trình tự, phát hành trên tạp chí khoa học tháng 03 năm 2005, có duy nhất một NST dạng vòng, không có màng nhân, vùng mã hóa protein chiếm 92,1 %, tỉ lệ G-C là 52% với một cụm 16S-23S rRNA[10].

Trong tất cả, 46 gen tRNA nằm rải rác trên hệ gen, trong đó tRNA Met và tRNA Trp đƣợc dự đoán là chứa trình tự intron[11].Bằng sự kết hợp của mã hóa dự đoán chức năng và so sánh tƣơng đồng, 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) với chiều dài trung bình của 833 bp, bao gồm 92% bộ gen tổng thể 77% protein của T. kodakarensis protein cho thấy sự tƣơng đồng cao nhất đối với các protein từ lớp Thermococci, bao gồm 240 loại protein đƣợc xác định là Thermococcales cụ thể[12]. So sánh với ba bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp. Tổng cộng có 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) đã đƣợc xác định[13].

Bộ gen chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus. Một trong số protein di truyền cho thấy sự tƣơng đồng cao với nhóm Pyrococcus spp. Sự sắp xếp Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204 của protein khác nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản, đƣợc chia sẻ giữa T. kodakaraensis và Pyrococcus spp., còn cho thấy nhiệm n 7 vụ của các protein khác nhƣ tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion Thermococcus kodakaraensis, một chủng của Thermococcales, kỵ khí dị dƣỡng bắt buộc, giống nhƣ hyperthermophiles khác phụ thuộc vào sulfur, T.

kodakaraensis có thể phân giải proteinaceous chất nền để thu đƣợc cacbon và các axit amin thiết yếu[14]. Để làm nhƣ vậy, nó sản xuất một số enzyme ngoại bào để thủy phân polypeptide bên ngoài tế bào Kích thƣớc bộ gen là là 2.737 base pair, với 92,1% vùng mã hóa. Năng lƣợng phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp nhanh chóng các protein điều hòa.Sự hiện diện của peptidase phụ thuộc ATP, đƣợc thấy trong tất cả các sinh vật nhân sơ: bao gồm hyperthermophiles, bộ gen đã đƣợc giải trình tự. Một số peptidase vi khuẩn đã đƣợc xác định.

Trình tự bộ gen của T. kodakaraensis chỉ ra sự hiện diện của hai loại peptidase nội bào phụ thuộc vào ATP là protease và proteasome[13]. Các gen tƣơng ứng với protease là FtsH và CLP.4: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 n 8 Chú thích: -Vòng tròn ngoài cùng: bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở. - Vòng tròn thứ 2: dự đoán các vùng mã hóa protein theo chiều kim đồng hồ.

- Vòng tròn thứ 3: dự đoán các vùng mã hóa protein ngƣợc chiều kim đồng hồ.  Các gen biểu thị đƣợc phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ thể: + Màu hồng: phiên mã + Màu hồng nhạt: sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa + Xanh lá cây: vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể + Vàng nhạt: lớp bên ngoài tế bào + Xanh da trời: thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa + Xanh nhạt: tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất + Xanh lam: cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme + Màu tím: sản xuất năng lƣợng + Tím nhạt: chuyển hóa lipide + Màu xám: chức năng chỉ mới đƣợc đề xuất + Màu đen: không rõ chức năng - Vòng tròn thứ 4: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ trong vòng thứ 4). - Vòng tròn thứ 5: dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngƣợc chiều kim đồng hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5). - Vòng tròn thứ 6: dự báo các yêu tố di động theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ vòng thứ 6).

- Vòng tròn thứ 7: dự báo các yếu tố di động theo chiều ngƣợc kim đồng hồ (màu xanh vòng thứ 7).