Luận văn thạc sĩ về gene glta và enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E. coli

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hường
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tách dòng và xác định trình tự gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Nguồn gốc thực vật của vanilla
• 2.2. Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia
• 2.3. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của vanillin
• 2.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng của vanillin
• 2.4.1. Hoạt tính sinh học của vanillin
• 2.4.2. Tác dụng của vanillin
• 2.5. Các phương pháp sản xuất vanillin
• 2.5.1. Vanillin chiết suất từ tự nhiên
• 2.5.2. Vanillin tổng hợp hóa học
• 2.5.3. Vanillin tổng hợp sinh học
• 2.5.3.1. Phương pháp sử dụng enzyme
• 2.5.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào
• 2.6. Ứng dụng công nghệ sinh học tổng hợp vanillin
• 2.6.1. coli và gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin
• 2.6.2. Vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin
• 2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Mồi phản ứng PCR. Vector tách dòng
• 3.3. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E.
• 3.5.2. Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc và phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến
• 3.5.3. Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn
• 3.5.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 3.5.5. Phương pháp PCR
• 3.5.6. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel
• 3.5.7. Phản ứng gắn nối trình tự gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTZ57R/T
• 3.5.8. Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả biến bằng sốc nhiệt
• 3.5.9. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
• 3.5.10. Phương pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt giới hạn
• 3.5.11. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
• 3.5.12. Phương pháp so sánh trình tự gene gltA đã tách dòng với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene thế giới
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E.
• 4.2. Kết quả nhân gene gltA từ vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp PCR
• 4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR từ gel điện di
• 4.4. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối
• 4.5. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn
• 4.6. Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thước plasmid
• 4.7. Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR
• 4.8. Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn
• 4.9. Kết quả cắt kiểm tra độc lập bằng enzyme NcoI
• 4.10. Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng hai enzyme SacI và HindIII
• 4.11. Kết quả giải trình tự gene
• 4.12. Kết quả so sánh trình tự gene giữa các dòng giải trình tự
• 4.13. Kết quả phân tích các thành phần thiết yếu của gene theo thiết kế insilico
• 4.14. Kết quả dịch mã của gene gltA
• 4.15. Kết quả so sánh trình tự gene đã xác định với trình tự gene đã công bố trên ngân hàng gene
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về nghiên cứu gene gltA và enzyme citrate synthase

Nghiên cứu này tập trung vào gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E. coli. Citrate synthase là một enzyme quan trọng trong chu trình acid citric (TCA), đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. Gene gltA được xác định là yếu tố then chốt trong việc điều hòa quá trình tổng hợp acetyl-CoA, một tiền chất thiết yếu cho nhiều con đường trao đổi chất. Nghiên cứu này nhằm tách dòng và xác định trình tự gene gltA, từ đó cung cấp cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về enzyme citrate synthase và ứng dụng trong công nghệ sinh học.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tách dòng gene gltA từ vi khuẩn E. coli và xác định trình tự nucleotide của gene này. Kết quả sẽ được so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene để đảm bảo độ chính xác. Nghiên cứu cũng hướng đến việc tạo ra các chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin thông qua việc điều chỉnh hoạt động của enzyme citrate synthase.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học lớn trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế mã hóa và điều hòa enzyme citrate synthase. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp vật liệu di truyền cho các ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là trong sản xuất vanillin từ các nguồn sinh học thay thế, giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả sản xuất.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để tách dòng và xác định trình tự gene gltA. Quy trình bao gồm các bước chính như tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E. coli, khuếch đại gene bằng phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR, và giải trình tự gene. Các vector tách dòng như pTZ57R/T được sử dụng để chứa gene đã khuếch đại, sau đó biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để tạo dòng khuẩn lạc.

2.1. Tách chiết DNA và khuếch đại gene

DNA tổng số được tách chiết từ vi khuẩn E. coli bằng phương pháp ly giải tế bào và tinh sạch DNA. Gene gltA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng gel điện di để loại bỏ các sản phẩm không mong muốn.

2.2. Biến nạp và tạo dòng khuẩn lạc

Sản phẩm PCR được gắn vào vector pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Các dòng khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh và kiểm tra bằng phản ứng PCR để xác nhận sự hiện diện của gene gltA.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy gene gltA đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn E. coli. Trình tự nucleotide của gene được xác định và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gene, cho thấy sự tương đồng cao. Điều này khẳng định tính chính xác của quy trình tách dòng và giải trình tự. Nghiên cứu cũng chỉ ra tiềm năng ứng dụng của gene gltA trong việc điều chỉnh quá trình tổng hợp vanillin thông qua việc tăng cường chuyển hóa acetyl-CoA.

3.1. Xác định trình tự gene gltA

Trình tự nucleotide của gene gltA được giải mã và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene. Kết quả cho thấy sự tương đồng lên đến 99%, khẳng định tính chính xác của quy trình tách dòng và giải trình tự.

3.2. Ứng dụng trong sản xuất vanillin

Nghiên cứu chỉ ra rằng việc điều chỉnh hoạt động của enzyme citrate synthase thông qua gene gltA có thể tăng cường sản xuất vanillin từ vi khuẩn E. coli. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin với hiệu suất cao.