Đặt vấn đề Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) là một trong những hợp chất thơm quan trọng nhất được sử dụng nhiều trong các ngành thực phẩm, mĩ phẩm, dược phẩm (Ranadive 1994)…Sản lượng tiêu thụ ước tính trên toàn thế giới hàng năm trên 12.000 tấn (Lee, Yoon et al. Vanillin tự nhiên, chiết xuất từ quả của loài lan có tên khoa học Vanilla planifolia chỉ đáp ứng được khoảng 1% nhu cầu thương mại, còn lại chủ yếu là vanillin tổng hợp hóa học nhân tạo (Li and Rosazza 2000). Trên thực tế, giá thành của 1 kg vanillin tự nhiên dao động trong khoảng 1200 – 4000 USD, trong khi đó giá của 1 kg vanillin nhân tạo chỉ khoảng 15 USD (Lomascolo, Stentelaire et al. Tuy nhiên, theo quy định của Mỹ và châu Âu thì vanillin tổng hợp hóa học không được coi như tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim and Lerch 1999).
Do đó mà vanillin không thể được cung cấp bằng cách chiết xuất từ quả vanilla tự nhiên hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học đã được nghiên cứu như là một quá trình thay thế (Krings and Berger 1998). Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp sản phẩm vanillin tự nhiên thay thế đang được sự quan tâm ngày càng tăng trong những năm gần đây (Lesage- Meessen, Stentelaire et al. Hơn nữa, quá trình sản xuất vanillin sinh học cho chi phí rẻ hơn do tận dụng được các phế phụ phẩm sẵn có rẻ tiền, tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn ít hơn và chủ yếu là được thực hiện điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ít nguy hiểm, sử dụng ít năng lượng hơn và ít gây ô nhiễm môi trường (Dal Bello 2013). Nghiên cứu sinh tổng hợp vanillin sử dụng các vi sinh vật và enzyme chuyển hóa tiền chất như glucose, ligin, isoeugenol, eugenol, axit ferulic… được thực hiện và công bố (Lomascolo, Stentelaire et al.
Trong đó biến đổi sinh học để tạo vanillin từ axit ferulic được chú ý quan tâm và nghiên cứu. Một số vi sinh vật, chẳng hạn như chủng Amycolatopsis sp. HR167 (Achterholt, Priefert et al. 2000), Bacillus subtilis (Peng, Misawa et al.
2003), Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al. 2003), Delftia acidovorans (Plaggenborg, Steinbuchel et al. 2001), Sphingomonas (Masai, Harada et al. 2002), Streptomyces setonii (Muheim and Lerch 1999)… đã được dùng để sản xuất vanillin từ axit ferulic.
Tuy nhiên, vanillin được sản xuất từ các sinh vật trên cho năng suất thấp n 2 hoặc sản phẩm tạo thành nhanh chóng bị chuyển đổi sang các sản phẩm khác hoặc bị vi sinh vật sử dụng như một nguồn carbon cung cấp năng lượng cho các vi sinh vật phát triển. Các nghiên cứu gần đây cho thấy E. coli là một hứa hẹn tiềm năng sản xuất vanillin bởi vì nó có một quá trình lên men phát triển tốt và không có con đường suy thoái vanillin (Priefert, Rabenhorst et al. coli là một loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ.
Quá trình tổng hợp vanillin từ axit ferulic ở trong vi khuẩn E. coli nhờ enzyme feruloyl –CoA synthetase (mã hóa bởi gene fcs) và enoyl –CoA hydratase/ aldolase (mã hóa bởi gene ech). Đồng thời, các acetyl –CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic có thể được chuyển đổi thành CoA bởi gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase. Như vậy sự khuếch đại của gltA trong E.
coli sẽ làm tăng chuyển đổi của acetyl –CoA , mà có thể mang lại sự tăng cường sản xuất vanillin qua feruloyl –CoA. Ở Việt Nam, việc trồng trọt, tách chiết và sản xuất vanillin còn là một thách thức lớn, để đáp ứng nhu cầu sử dụng chủ yếu phải nhập khẩu vanillin từ nước ngoài với số lượng lớn và giá thành cao đã gây khó khăn cho sản xuất và phát triển kinh tế. Tuy nhiên với sự phát triển của công nghệ sinh học và khoa học kĩ thuật hiện nay hoàn toàn có thể chủ động nghiên cứu và sản xuất vanillin thay thế từ con đường sinh tổng hợp mới. Việc phân lập và tách dòng các gene mã hóa cho các enzyme trong con đường sinh tổng hợp vanillin là cơ sở cho các nghiên cứu về các hợp chất thơm nói chung và cung cấp vật liệu nhằm tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin có năng suất cao nói riêng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài: “Tách dòng và xác định trình tự gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E. coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin, trước mắt là tạo chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin. Mục tiêu của đề tài - Tách dòng gene gltA của vi khuẩn E.
coli DH5α - Xác định trình tự gene gltA đã tách dòng và so sánh với trình tự trên ngân hàng gene (Gene bank). Yêu cầu của đề tài - Nắm được các nguyên lí, kĩ thuật và các phương pháp thực hiện trong quá trình tách dòng gene. n 3 - Giải được trình tự gene đã tách dòng, phân tích và so sánh được với trình tự trên ngân hàng gene đã công bố. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.
Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học. Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gene gltA là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất vanillin sau này. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của quá trình tách dòng gene gltA sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp vanillin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Nguồn gốc thực vật của vanilla Vanilla là một loài phong lan leo nhiêt đới thuộc họ Orchidaceae. Họ này bao gồm 788 chi và 18500 loài, là một trong những họ lớn nhất của thực vật có hoa trên thế giới, chi chính của nó chứa hơn 110 loài (Mabberley, 1997). Trong tổng số 110 loài, chỉ có 3 loài có giá trị kinh tế đó là Vanilla planifolia, Vanilla pompona và Vanilla tahitensis. Tuy nhiên, Vanilla planifolia là loài có tiềm năng kinh tế lớn nhất bởi nó là nguồn gốc chính của mùi hương vanillin - hương vị chủ yếu được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, thực phẩm, mĩ phẩm và nước hoa.
Hình 1: Hình dạng và đặc điểm ba loài hoa Vanilla Lịch sử phát hiện của vanillin bắt đầu ở Trung Mỹ trong năm 1300. Ở Mexico người Aztec đã sử dụng chúng trong các đồ uống của họ được gọi là n 5 “Tlixochitl” – được coi như là tổ tiên của chocolate. Năm 1520, người Tây Ban Nha đã mang nó đến châu Âu và từ đó nó trở nên phổ biến và được yêu thích hơn. Loài cây này đã được giới thiệu đến Blandford và trồng thành công bởi Charles Greville tại Paddington ở Anh vào năm 1807.
Sau đó, Greville cung cấp cành hom đến Paris Antwerp, Bogor, Java để trồng. Cây vanilla đã được đưa tới Reunion và từ Reunion đến Mauritius năm 1827. Vanilla được phát hiện ở Cộng hòa Malagasy vào năm 1840. Mặc dù cây ra hoa, nhưng không đậu quả nếu không được côn trùng thụ phấn tự nhiên.
Ngoài ra, hoa của lan vanilla rất chóng tàn, hoa nở chỉ kéo dài trong vòng 24 giờ, nên việc thụ phấn gặp rất nhiều khó khăn. Đến năm 1841, Edmond Albius một cựu nô lệ tại Reunion đã tìm ra một phương pháp thụ phấn nhân tạo bằng cách sử dụng gậy tre vót nhọn để lấy phấn hoa, tách môi hoa đưa phấn vào tiếp xúc với bầu noãn. Phương pháp thủ công này hiện vẫn được áp dụng tại những đồn điền trồng vanilla ở nhiều nơi trên thế giới. Vào năm 1890, vanilla đã được trồng phổ biến ở Mauritius, Reunion, Seychelles, Madagascar, Tahiti, Jamaica và một số nước nhiệt đới khác (Cunningham,1920); (Ranadive 1994); (Reineccius,1994).
Kĩ thuật trồng vanilla đã được giới thiệu năm 1846 ở Java bởi Teysmann, tại Seychelles năm 1866, ở Tahiti vào năm 1848 bởi Hamelin, ở quần đảo Comoro vào năm 1893, ở Tây Ấn và Guadelope vào năm 1938. Hiện nay, vanilla được trồng nhiều tại những đồn điền ở Châu Phi như Reunion, Mauritius, Madagascar, Seychelles, Tanzania; ở Châu Á như Java, Indonesia; ở Nam Mỹ như Brazil; ở các đảo trong khu vực Caribbea như Jamaica. n 6 Bảng 1: Danh sách vùng trồng và diện tích vanillin chủ yếu trên thế giới Đơn vị tính: hecta Năm Năm Năm Năm Năm Năm Địa điểm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Madagascar 25750 25880 26050 26220 63764 63764 Indonesia 8539 8903 9216 9216 9216 9216 China 1200 1200 1200 1200 1300 1400 Mexico 1046 6567 826 575 681 582 Tonga 290 290 290 268 255 NA Uganda 100 140 140 136 138 138 Comoros 700 700 650 700 700 700 French 400 450 450 460 470 NA Polynesia Reunion 350 351 290 290 290 290 Malawi 80 80 80 80 80 80 Keynia 40 40 40 40 40 40 Guadeloupe 40 40 40 40 40 40 Zimbabwe 45 45 45 30 23 23 (Nguồn FAO năm 2009) 2. Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia Vanilla planifolia loài cây thuộc loại dây leo, thân mọng, mọc bám nhờ rễ cuốn vào cây chống, đường kính thân 1 - 2 cm, có thể mọc dài đến 10 - 15 m, màu lục xậm, chia thành những đốt, khoảng cách giữa 2 đốt từ 5 - 15 cm.
Rễ dài, màu trắng nhạt, khí sinh, đường kính chừng 2 mm, mọc đối diện với lá. Lá phẳng, mọng, mọc cách, hình thuôn - mũi giáo, dài 8 - 25 cm x 2-8 cm, mũi lá tuy nhọn nhưng cùn, phiến có nhiều gân song song nổi rõ, cuống ngắn. Hoa lớn có mùi thơm, màu xanh hoặc vàng nhạt, đường kính khoảng 10 cm, rất chóng tàn. Cuống hoa rất ngắn.
Bầu noãn hình trụ cong, dài khoảng 4 - 7 cm, rộng 1 - 1,5 cm. Hai cánh hoa phía trên dạng tương tự như cánh đài, cánh hoa phía dưới biến dạng thành cánh môi hình loa kèn. Quả dạng nang, hình trụ dài 10 - 25 cm, đường kính 5 - 15 mm, khi khô có mùi thơm, chứa nhiều hạt li ti nhỏ cỡ 0.3 mm, hạt được phóng thích khi quả nứt làm đôi. Hoa thường chỉ trổ hoa mỗi năm một đợt, tại Mexico trong các tháng 4 - 5 và n 7 các đảo Châu Phi như Madagascar, Reunion vào các tháng 11 đến tháng giêng năm sau.