Luận văn thạc sĩ công nghệ hóa học ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nấm men yarrowia lipolytica po1g có khả năng sinh tổng hợp chất béo

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica PO1G để sinh tổng hợp chất béo hiệu quả.

• Tác giả: Trương Thị Cẩm Tú
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Quốc Phong
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Hóa học
• Đề tài: Ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica PO1G sinh tổng hợp chất béo
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng bã mía thủy phân để nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica PO1G nhằm sinh tổng hợp chất béo. Bã mía, một phế phẩm nông nghiệp phong phú, được thủy phân bằng axit loãng để tạo ra nguồn carbon cho quá trình lên men. Yarrowia lipolytica PO1G là một loại nấm men có khả năng tích lũy chất béo cao, được sử dụng để sản xuất dầu vi sinh vật (SCO), một nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất biodiesel. Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa quá trình thủy phân bã mía và nuôi cấy nấm men để đạt được hiệu suất sinh tổng hợp chất béo cao nhất.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân bã mía bằng axit loãng và nuôi cấy Yarrowia lipolytica PO1G để sinh tổng hợp chất béo. Cụ thể, nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như thời gian, nồng độ axit, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit, và nhiệt độ. Đồng thời, nghiên cứu cũng tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy như nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ, và thời gian để tối ưu hóa sự phát triển và tích lũy chất béo của nấm men.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc tận dụng bã mía, một phế phẩm nông nghiệp dồi dào, để sản xuất dầu vi sinh vật. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn mở ra hướng đi mới trong sản xuất biodiesel từ nguồn nguyên liệu tái tạo. Yarrowia lipolytica PO1G được chọn vì khả năng tích lũy chất béo cao và khả năng sử dụng các nguồn carbon giá rẻ như bã mía thủy phân. Kết quả nghiên cứu có thể áp dụng trong công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, góp phần giải quyết vấn đề năng lượng và môi trường.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện qua hai giai đoạn chính: thủy phân bã mía và nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica PO1G. Quá trình thủy phân được thực hiện bằng axit sulfuric loãng với các điều kiện khác nhau về thời gian, nồng độ axit, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit, và nhiệt độ. Dung dịch thủy phân sau đó được khử độc bằng Ca(OH)2 để loại bỏ các chất ức chế ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong môi trường bã mía thủy phân đã khử độc, với các điều kiện khác nhau về nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ, và thời gian.

2.1. Quá trình thủy phân bã mía

Quá trình thủy phân bã mía được thực hiện bằng axit sulfuric loãng với các điều kiện khác nhau. Các yếu tố được khảo sát bao gồm thời gian (từ 1 đến 6 giờ), nồng độ axit (từ 1% đến 5%), tỷ lệ bã mía/dung dịch axit (từ 1/10 đến 1/30 g/mL), và nhiệt độ (từ 70°C đến 90°C). Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là thủy phân với 3% H2SO4 trong 6 giờ ở 90°C, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit 1/25 g/mL, đạt nồng độ đường tổng cao nhất là 22,45 g/L.

2.2. Quá trình nuôi cấy nấm men

Quá trình nuôi cấy Yarrowia lipolytica PO1G được thực hiện trong môi trường bã mía thủy phân đã khử độc. Các yếu tố được khảo sát bao gồm nguồn carbon (glucose, bã mía thủy phân), nguồn nitơ (pepton, ammonium sulfate), nhiệt độ (từ 24°C đến 30°C), và thời gian (từ 1 đến 7 ngày). Kết quả cho thấy nấm men phát triển tốt nhất trong môi trường bã mía thủy phân với nồng độ đường tổng 30 g/L, nhiệt độ 26°C, thời gian 4 ngày, và pepton là nguồn nitơ. Nồng độ sinh khối và chất béo cao nhất thu được lần lượt là 13,67 g/L và 46,68%.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy bã mía thủy phân là nguồn carbon tiềm năng cho Yarrowia lipolytica PO1G để sinh tổng hợp chất béo. Quá trình thủy phân tối ưu đạt được với 3% H2SO4 trong 6 giờ ở 90°C, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit 1/25 g/mL, đạt nồng độ đường tổng 22,45 g/L. Quá trình nuôi cấy tối ưu đạt được với nồng độ đường tổng 30 g/L, nhiệt độ 26°C, thời gian 4 ngày, và pepton là nguồn nitơ. Phân tích bằng GC cho thấy thành phần dầu thu được tương tự dầu thực vật, chứng tỏ bã mía thủy phân có thể được sử dụng như một nguồn carbon thay thế tiềm năng.

3.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân bã mía được tối ưu hóa với các điều kiện khác nhau. Kết quả cho thấy thời gian thủy phân 6 giờ, nồng độ axit 3%, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit 1/25 g/mL, và nhiệt độ 90°C là điều kiện tối ưu, đạt nồng độ đường tổng cao nhất là 22,45 g/L. Các yếu tố này ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thủy phân, với thời gian và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng nhất.

3.2. Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy

Quá trình nuôi cấy Yarrowia lipolytica PO1G được tối ưu hóa với các điều kiện khác nhau. Kết quả cho thấy nấm men phát triển tốt nhất trong môi trường bã mía thủy phân với nồng độ đường tổng 30 g/L, nhiệt độ 26°C, thời gian 4 ngày, và pepton là nguồn nitơ. Nồng độ sinh khối và chất béo cao nhất thu được lần lượt là 13,67 g/L và 46,68%. Phân tích bằng GC cho thấy thành phần dầu thu được tương tự dầu thực vật, chứng tỏ bã mía thủy phân có thể được sử dụng như một nguồn carbon thay thế tiềm năng.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chứng minh rằng bã mía thủy phân là nguồn carbon tiềm năng cho Yarrowia lipolytica PO1G để sinh tổng hợp chất béo. Quá trình thủy phân tối ưu đạt được với 3% H2SO4 trong 6 giờ ở 90°C, tỷ lệ bã mía/dung dịch axit 1/25 g/mL, đạt nồng độ đường tổng 22,45 g/L. Quá trình nuôi cấy tối ưu đạt được với nồng độ đường tổng 30 g/L, nhiệt độ 26°C, thời gian 4 ngày, và pepton là nguồn nitơ. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất dầu vi sinh vật từ phế phẩm nông nghiệp, góp phần giải quyết vấn đề năng lượng và môi trường.

4.1. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu hóa quá trình thủy phân bã mía và nuôi cấy Yarrowia lipolytica PO1G để sinh tổng hợp chất béo. Bã mía thủy phân đã được chứng minh là nguồn carbon tiềm năng, giúp giảm chi phí sản xuất dầu vi sinh vật. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển biodiesel từ nguồn nguyên liệu tái tạo.

4.2. Kiến nghị

Để phát triển hơn nữa nghiên cứu này, cần tiếp tục khảo sát các điều kiện nuôi cấy trên quy mô lớn hơn, đồng thời nghiên cứu thêm về các loại phế phẩm nông nghiệp khác có thể được sử dụng làm nguồn carbon. Ngoài ra, cần tối ưu hóa quá trình chiết xuất và tinh chế dầu vi sinh vật để nâng cao hiệu quả sản xuất biodiesel.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, thế giới đang phải đối mặt với hiện tượng biến đổi khí hậu và khủng hoảng năng lượng. Hơn thế nữa, nguồn dự trữ dầu mỏ đang cạn kiệt, giá thành cao gây bất ôn về an ninh năng lượng và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Vì vậy, các nhà khoa học đã nỗ lực không ngừng tìm kiếm các giải pháp thay thế các dạng năng lượng đi từ nguyên liệu hóa thạch bằng các dạng năng lượng mới xanh hơn, sạch hơn, thân thiện với môi trường và đặc biệt có thể tái tạo được. Trong đó, nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học là một hướng đi tiềm năng giúp giải quyết một phần nào vấn đề nan giải này của thế giới, vừa đảm bảo an ninh năng lượng vừa đáp ứng nhu cầu năng lượng của từng quốc gia [1].

Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại nhiều lợi ích như giảm thiểu sự phụ thuộc vào dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm. Do trong quá trình sử dụng, nhiên liệu sinh học ít phát sinh các chất độc hại gây ô nhiễm môi trường như lưu huỳnh, carbon monoxit, polyaromatic. Mặt khác, nhiên liệu sinh học có tốc độ phân hủy sinh học cao, nhanh hơn so với nhiên liệu hóa thạch. Chính vì thế dẫn đến sự bùng nổ sản xuất nhiên liệu sinh hoc [3],[4].

Biodiesel là nhiên liệu sinh học có thành phần hóa học chủ yếu là methyl este của các axit béo. Biodiesel được sản xuất từ quá trình chuyển hóa este giữa các triglyceride (đây là thành phần chính có trong dầu thực vật hoặc mỡ động vật) và methanol với xúc tác axit hoặc bazơ [2]. Nguyên liệu truyền thống để sản xuất biodiesel bao gồm dầu hạt cải, dầu hạt hướng dương, dầu đậu nành, dầu cọ, dầu chiên đã qua sử dụng, mỡ động vật [I],[Š]. Tuy nhiên, nếu sử dụng dầu động thực vật làm nguyên liệu để tổng hợp biodiesel sẽ cho chí phí cao và có thể ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lượng thực [6].

Một số nghiên cứu đã sử dụng dầu ăn đã qua sử dụng như nguồn nguyên liệu. Đây là một cách hay để giảm chỉ phí [5],[7]. Tuy nhiên, những nguồn nguyên liệu này còn hạn chế, không đáp ứng được nhu cầu năng lượng [8]. Những bắt lợi nêu trên đã làm giá thành biodiesel còn cao nên việc sử dụng nhiên liệu này còn hạn chế.

Vì vậy, thế giới đã và đang tìm kiếm các nguồn dầu mới để sản xuất biodiesel. Trong số đó, dầu vi sinh vat hay dau don bao (single cell oil) đang thu hút sự quan tâm của thế giới [9],[10]. Vi sinh vật cho dầu có khả năng tích lũy chất béo trong tế bào từ sự trao đổi chất của các nguồn carbon khác nhau, với một số loài vi sinh vật có thê tích lũy chất béo khoảng 87% khối lượng tế bào khô. Đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng dé tổng hợp biodiesel.

Do chúng có một số thuận lợi như không bị ảnh hưởng theo mùa hay thời tiết, thành phần của chất béo tương tự như các loại dầu ăn được, có thể sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau với thời gian sản xuất ngắn, dễ dàng mở rộng quy mô công nghiệp [I I]. Nam men Yarrowia lipolytica c6 kha nang tích lũy một lượng lớn chất béo và có thể dùng để sản xuất dầu sinh học. Hàm lượng chất béo trong nắm men này tùy thuộc vào sự phát triển và điều kiện nuôi cấy. Nguồn carbon khác nhau sẽ cho kích cỡ và thành phần chất béo khác nhau.

Một số công trình nghiên cứu trên thế giới sử dụng glucose làm nguồn carbon để sản xuất chất béo [10],[12]. Tuy nhiên, do giá của ølucose khá cao sẽ ảnh hưởng đến giá thành sản phâm. Vì vậy, các nguồn carbon thay thế có giá mềm hơn đã được nghiên cứu như glycerol công nghiệp, pectin va lactose, thuy phân các chat bé di [12],[13]. Trong đó, đường thu được từ thủy phân nguyên liệu lignocellulose là nguồn carbon tiềm năng, rẻ tiền để sản xuất dau vi sinh vat [14].

Ba mia là một trong những nguồn lignocellulose khá phổ biến ở các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Thông thường, mía sau khi trải qua quá trình xay xát sẽ được dùng làm thức ăn cho trâu bò, cung cấp nhiệt, điện cho nhà máy mía đường hoặc kết hợp với các phụ gia khác dé sản xuất ván sàn ép, phân bón. Những biện pháp xử lý này chưa khai thác hết tiềm năng của bã mía, đôi khi sẽ gây ô nhiễm môi trường [15],[16]. Vì vậy, nếu chúng ta tìm được cách sử dụng bã mía một cách hợp lý sẽ đem lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường và nâng cao giá trị cây mía.

Việc nghiên cứu sử dụng nguồn lignocellulose giàu hợp chất carbonhydrate như bã mía làm nguyên liệu để sản xuất biodiesel với sự hỗ trợ của vi sinh vật là một hướng đi đúng đắn, đầy tiềm năng và có hiệu quả. Đó cũng là lý do mà đề tài “Ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nắm men Yørrowia lipolytica Polg có khả năng sinh tổng hợp chất béo” của chúng tôi muốn đóng góp một phần nhỏ vào bức tranh nhiên liệu sinh học của thế gidi. Mục tiêu Mục đích chung của đề tài: nghiên cứu khả năng tích lũy chất béo của nắm men Yarrowia lipolytica Polg trong môi trường bã mía thủy phân. Mục tiêu cần đạt được trong đề tài: — Nghiên cứu tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân bã mía bằng axit loãng để thu được dung dịch thủy phân có hàm lượng đường cao nhất.

— Nghiên cứu tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình lên men với khả năng tích lũy chất béo cao nhất. Nội dung nghiên cứu Các nội dung chính cần phải thực hiện để đạt được mục tiêu nêu trên Quá trình thủy phân — Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân. — Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit đến quá trình thủy phân. — Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã mía và dung dịch axit đến quá trình thủy phân.

—_ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân. Quá trình nuôi cấy — Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và tích lãy chất béo của nắm men. —_ Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nắm men. — Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nắm men.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nắm men. — Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường tông đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nắm men. CHƯƠNG 2 TỎNG QUAN 2. Dầu vi sinh vật Dầu vi sinh vật hay dầu đơn bào (single cell oil, SCO) được định nghĩa là các loại dầu có thể ăn được thu được từ vi sinh vật, có hình thái và thành phần tương tự như dầu thực vật hay mỡ động vật.

Hàm lượng dầu cao được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn, nắm men, nắm và vi tảo. Ngày nay, dau vi sinh vật được xem như sản phẩm công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp chính các axit béo không bão hòa đa (axit docosahexaenoic (DHA), axit arachidonic (AA) va axit y-linolenic (GLA),.) — đây là các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của con người [17]. Dầu vi sinh vật được sản xuất đầu tiên vào trước chiến tranh thế giới thứ hai, khi dầu và chất béo rất khan hiếm. Những năm sau đó, do thiếu các nguồn cung cấp axit béo không bão hòa từ thực động vật nên dầu đơn bào được xem như một mục tiêu thương mại.

Đối với vi sinh vật, chất béo được tích lũy trong những cơ quan tế bào đặc biệt được gọi là hạt chất béo. Nó bao gồm các triacylglycerol và steryl este (SE) mà chúng được bao quanh bởi một lớp phospholipid đơn với một vài protein lồng vào [17]. Do dầu vi sinh vật rất có tiềm năng trong tương lai vì có thể sản xuất dựa trên nguồn nguyên liệu là rơm, rạ, bã mía — đây được xem là phụ phế phẩm nông nghiệp có thể gây ảnh hưởng đến môi trường nếu không có hướng xử lý hiệu quả. Ngoài ra, do có tính chất tương tự nhau (Bảng 2.1) nên dầu vi sinh vật được xem như là một nguồn chất béo thay thế chất béo truyền thống như dầu động thực vật trong sản xuất biodiesel và là nguồn thức ăn nuôi trồng thủy sản [11],[18].1 Thành phần chất béo của vi sinh vật cho đầu và đầu động thực vật [19],[20] Loai Thanh phan chat béo : C16:0 C161 C18:0 CISI C182 C183 Khác Vi sinh vat Vi tao 12-21 55-57 1-2 58-60 4-20 14-30 — Nammen 11-37 1-6 1-10 28-66 3-24 1-3 — Nam 7-23 1-6 2-6 29-82 8-40 4-42 — Vi khuẩn 8-10 10-11 11-12 25-28 14-17 — — Dầu động vật Mỡ bò 24 4 19 43 3 1 6 Mỡ heo 26 3 14 44 10 — 3 Dầu thực vật Dầu oliu 13 1 3 71 10 1 1 Dau dau ul - 4 54 7 - - nanh Dau dau HH - 2 48 32 - 1 phong 2.

Chat béo Chất béo là những hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên và trong cơ thê động thực vật và vi sinh vật, thường là este của các axit béo và rượu. Chất béo có đặc tính không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ như cloroform, benzen, acetone, cồn [21],[22],[23]. Phan loai chat béo có thể đựa vào: tính chất vật lý ở nhiệt độ phòng (dầu ở dạng lỏng, mỡ ở dạng rắn), tính phân cực (chất béo phân cực và trung tính), sự cần thiết của chất béo đối với con người (axit béo thiết yếu và không thiết yếu), cấu trúc của chất béo. Tuy có nhiều cách phân loại nhưng phân loại dựa vào cấu trúc là hợp lý và thông dụng nhất [23].

Dựa vào cấu trúc, người ta chia chất béo thành hai loại chất béo đơn giản và phức tạp: — Đối với chất béo đơn giản trong phân tử chỉ chứa C, H và O; bao gồm axit béo, triacylglycerol, sterol, sterol este và sáp [23]. —_ Với chất béo phức tạp ngoài C, H và O trong phân tử còn chứa một số nguyên tố khác nhau P, § và N; bao gồm glycerophospholipid (phospholipid), glyceroglycolipid (glycolipid), sphingolipid [23]. Triacylglycerol và các hợp chất liên quan Triacylglycerol (triglyceride) là trieste của glycerol với 3 axit carboxylic dây dài. Khi thủy giải với dung dịch kiềm, triglyceride tạo ra glycerol và 3 axit béo.

Ba axit này không nhất thiết phải giống nhau. Gần như tất cả dầu thực vật và mỡ động vật thương mại thường là hỗn hợp của nhiều triacylglycerol (TAG). Diacylglyerol (DAG) va monoacylglyerol (MAG) là este của glycerol với hai hoặc một axit béo tương ứng.