CHƯƠNG 1 : TONG QUAN TÀI LIEU 1. NƯỚC DỪA GIÀ Cây dừa có tên khoa học là Cocos nucifera L., là một loại cây lâu năm được trồng pho biến trên toàn thé giới, đặc biệt là các nước nhiệt đới. Việt Nam có điều kiện khí hậu và tho như ng rất phù hợp cho cây dừa phát triển. Hiện nay, cây dừa được trồng rộng rãi các tỉnh Đông bằng sông Cửu Long và khu vực duyên hải miền Trung.
Theo thống kê của các tổ chức khác nhau, điện tích trồng dừa của Việt Nam tuy không lớn nhưng sản lượng lại cao và tăng dần đều theo các năm. Theo niên giám Thống kê của Hiệp hội Dừa Châu Á - Thái Bình Dương, đến năm 2012, diện tích trồng dừa của Việt Nam là 157 nghìn hecta va sản lượng hang năm là 1,015,141 triệu quả tương đương 253,785 tan dừa khô. Theo thống kê của ETC Group năm 2013, sản lượng dầu dừa xuất khẩu của Việt Nam đứng thứ tư thế giới và Việt Nam cũng là nước xuất khâu cơm dừa nạo say và chỉ xơ dừa chủ yếu. Cây dừa là loại cây cho trái quanh năm nên có khả năng cung cấp sản phẩm rất dồi dào và ôn định.
Các sản phẩm tiêu thụ rất đa dạng như dừa trai, cơm dừa sây khô, bột sữa dừa, dầu dừa, than gáo dua, thạch dừa, chỉ xơ dừa. Các sản phẩm trên chủ yếu được chế biến từ quả dừa và có giá trị kinh tế cao đối với cả trong và ngoài nước. Quả dừa phục vụ trong quá trình chế biến và đa dạng hóa sản phẩm gồm hai loại: quả dừa non và quả dừa gia. Quả dừa non hay dừa trái với giá trị dinh dư ng cao phục vụ nhu cầu thức uống.
Quả dừa già bao gồm phần cơm dừa là thành phân chủ yếu để sản xuất cơm dừa, sữa dừa, dầu dừa. Ngoài ra, phan v dừa hay gáo dừa được tận dụng để sản xuất than gáo dừa và chi xơ dừa. Bên cạnh đó, phần c n lại là nước dừa già được ứng dụng dé sản xuất thạch dừa. Tuy nhiên, do sản lượng dừa rất lớn và mặt khác, thạch dừa c n được sản xuất từ mật rỉ đường nên lượng nước dừa già không được tận dụng hết và tôn đọng lại.
Vì thế, trên thị trường hiện nay, nước dừa già được xem là nguồn cơ chất có sản lượng lớn và rất ôn định. Quả dừa là một hệ kín vô trùng với đây đủ các thành phân dinh dư ng như đường, đạm, chất chống oxi hóa, các vitamin và khoáng chất. Quá trình chín quả bao gồm hai giai đoạn. Giai đoạn đầu, quả dừa c n non chủ yếu chứa thành phần đường khử là ølucose và fructose.
Giai đoạn sau, khi quả dừa đã chín, thành phần đường của nước dừa gia mới xuất hiện sucrose [15]. Một số thành phan dinh dư ng của nước dừa được trình bày trong bảng sau. Thành phần dinh dư ng của nước dừa Chất dinh dưỡng Giá trị (g/100g) Carbohydrate 3,71 Chat xo 1,10 Đường tông sô 2,61 Lipid tông sô 0,20 Nước 94,99 Protein 0.Thành phần vitamin của nước dừa Vitamin Giá tri (mg/100¢g) Acid pantothenic 0,043 B, (Thiamin) 0,030 Ba (Riboflavin) 0,057 Bs (Pyridoxin) 0,032 C (Acid ascorbic) 2 A400 Niacin 0,080 [16] Bang 3.Thanh phan khoáng chat của nước dừa Chat khoang Giá trị (mg/100¢g) Ca 24.000 Mg 25,000 Mn 0,142 Na 105,000 P 20.000 Se 1,000 Zn 0,100 [16] Bảng 4. Thành phần acid amin của nước dừa Acid amin Giá tri (g/100¢g) Acid aspartic 0,070 Acid glutamic 0,165 Alanine 0.037 Argine 0,118 Cystein 0,014 Glycine 0,034 Histidine 0,017 Isoleucine 0,028 Leucine 0,053 Lysine 0,032 Methionine 0,013 Phenylalanine 0,037 Proline 0.026 Tryptophan 0,008 Tyrosine 0,022 Valine 0,044 [16] Tu năm những năm 1960, nước dừa đã được biết đến và sử dụng để làm môi trường nuôi cây vi sinh [17].
Đặc biệt, nước dừa gia được xem là môi trường điển hình để nuôi cay vi khuẩn acetic [18,19]. Cho đến thời diém hiện nay, rất nhiều nghiên cứu và công bố cũng cho thay nước dừa già là một trong những môi trường thích hợp nhất cho nhóm vi khuẩn acetic phát triển [9]. Bên cạnh đó, thành phan đa dạng chất dinh dư ng của nước dừa già cũng phù hợp cho các nhóm vi khuẩn khác phát triển. Hiện nay, đã có một số công bố nhóm vi khuẩn lactic có khả năng sống và phát triển trên môi trường này.
Năm 2011, Kuswardani và cộng sự đã công bố vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus có khả năng sống và phát triển trên môi trường nước dừa [20]. Ngoài ra, Seesuriyachan (2011) cũng cho thay Lactobacillus bulgaricus TISTR 1498 có thé sử dụng các thành phan nước dừa mà không cần bố sung thêm chất dinh dư ng nào dé tạo thành các exopolysaccharide đơn giản [21]. Trong những năm gan đây, một sô nghiên cứu công bô khả năng lên men của nhóm vi khuân lactic trên môi trường nước dừa tạo sản phẩm có lợi cho sức kh e. Năm 2010, Yuliana và cộng sự nghiên cứu sản xuất thức uống lên men từ nước dừa bởi tô hợp vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus va Streptococcus thermophilus [22|.
Năm 2013, Lee và cộng su lên men hai giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus L10 va Lactobacillus casei L26 trên môi trường nước dừa tao thức uống probiotic [23]. Nói t6m lại, nước dừa gia có thể xem là nguồn cơ chất tự nhiên thích hợp cho các nhóm vi khuẩn acetic và lactic sống va phát triển. NHOM VI KHUÂN ACETIC 1. Tong quan về vi khuẩn acetic Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm vi khuẩn được ứng dụng rat rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là trong sản xuất thực phẩm.
Từ rất lâu, nhóm vi khuẩn acetic đã được ứng dụng dé lên men sản xuất giẫm ăn hằng ngày. Chúng cũng là nhóm vi khuẩn điển hình tong hợp cellulose. Gan đây, nhóm vi khuẩn acetic c n được quan tâm với khả năng sinh acid glucuronic, một acid có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ giải độc gan dé đào thải các chất độc hại ra ngoài cơ thể. Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm vi khuẩn hiện diện rất phong phú trong tự nhiên, chúng có thể được phân lập từ trái cây, giảm, rượu, bia; trong đất, nước.
Về vi thé, vi khuẩn acetic là những trực khuẩn Gram âm. Chúng thường có dang hình que đến elip, đứng tách riêng lẻ hoặc một số xếp thành dạng chuỗi dài. Ngoài ra, một số loài e n có tế bảo hình cầu, xoăn, chùy, hình chi hay hình bán nguyệt tùy thuộc loài và điều kiện môi trường nuôi cấy. Trong môi trường | ng, vi khuẩn acetic có tốc độ sinh trưởng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thé phát triển thành 17 triệu tế bào [24].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tiết ra acid acetic với nồng độ thấp có tác dụng kích thích sự sinh trưởng. Ngoài ra, chúng c n có thé sinh acid glucuronic bang quá trình pentose phosphate [5]. Vi khuẩn acetic là loài ưa mát, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 20 - 30°C. Tuy nhiên, chúng có thé tồn tại đến 38°C nhưng sinh trưởng rất chậm.
Vi khuẩn acetic có tính chịu acid cao, pH thích hợp là 3.2, một số loài vẫn có thể phát triển được ở pH 3. Nhóm vi khuẩn này không có khả năng tạo bào tử. Một số loài có thể di động nhờ tiên mao ở một đầu - đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này. Đây là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.
Trên môi trường thạch, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lac tr n, nh , đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như Acetobacter aceti, Gluconabacter xylinus. có khuan lạc rat nh_ (đường kính khoảng 1 mm), bề mặt trơn bóng, có tâm sam màu. Một số loài có khuẩn lạc lớn (đường kính khoảng 4 - 5 mm), bề mặt trơn bóng, không có mau, m ng va trong suốt.
Một số loài tạo thành khuẩn lac ăn sâu vào môi trường nên khó lay ra bằng que cay. Trên môi trường | ng, vi khuẩn acetic tập trung trên bề mặt môi trường, nơi tiếp xúc nhiều oxy, tạo thành lớp mang có cau trúc khác nhau tùy theo loài và điều kiện nuôi cấy. Khi lắc dao, lớp mang nay chìm xuống và vi khuẩn tiếp tục tập trung vào nơi chứa nhiều Oxy dé hinh thanh lớp màng mới. Bên cạnh đó, một số loài lại tạo khối cellulose chìm trong | ng môi trường nuôi cay.
Khi nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, dung dịch môi trường phía dưới lớp màng cellulose trong suốt. Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện dong, cellulose được hình thành biv ra làm van đục môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi cay vi khuẩn acetic phải đáp ứng day đủ các acid amin như acid pantothenic, valin, alanin, prolin., một số chất kích thích sinh trưởng như p - aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin. và một số chất khoang K, Ca, Mg, Fe, S, P,.
có thé ở dang muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ. Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn acetic dựa trên các tính chat sinh hoá cụ thé sau: khả năng tao catalase, khả năng tổng hợp các chat ketol từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol, sorbitol. , khả năng oxy hóa acetat thành CO2 và nước, kha năng oxy hóa glucose thành acid gluconic, khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nito trong môi trường Hoyer va sử dụng rượu etylic làm nguồn carbon, khả năng tạo sắc tố nâu, khả năng tong hợp cellulose. Trên cơ sở nảy, Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydan, mesoxydan, oxydan, peroxydan: nhóm suboxydan gồm các loài Acetobacter suboxydaz va Acetobacter melanogennum: nhóm mesoxydan gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti va Acetobacter mesoxydans; nhóm oxydan gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ketol: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens va Acetobacter lovaniens, nhóm peroxydan gồm Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum không chứa catalase va không oxy hoá được glucose [25].
Giống vi khuẩn Gluconacetobacter 1. Giới thiệu Phân loại Gluconacetobacter Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadiace Họ: Acetobacteraceae Giống: Gluconacetobacter [25] Họ Acetobacteraceae bao gồm các giống Gluconacetobacter, Acidomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Asaia va Kozakia. Trong đó, giỗng Gluconacetobacter và Acetobacter là có khả năng tong hop cellulose hiệu quả nhất. Vì thế, đây là hai giống tiêu biểu được ứng dụng rộng rãi nhất trong các chủng vi khuẩn acetic.
Gan đây, các nhà nghiên cứuc n phát hiện chung đóng vaitr chính trong hệ lên men hình thành acid glucuronic. Vi khuẩn Gluconacetobacter có thé được tim thay từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên. Đặc biệt, vi khuẩn này dễ dàng phân lập từ giảm, thạch dừa, trà kombucha do chúng đóng vaitr chính trong các hệ lên men này. * j fi\ Pee a eSWe ae pe hor AND Hình 1.
Vi khuan Gluconacetobacter xylinus [25] 1. Dic diém hinh thai Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuan Gram âm, có dạng hình que thắng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 0.0um thay đổi tùy loài.