Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập gene syrb 2 ừ chủng vi khuẩn pseudomonas syringae pv syringae sinh tổng hợp syringomycin cao

Nghiên cứu phân lập gene syrb 2 từ Pseudomonas syringae pv syringae nhằm tăng cường tổng hợp syringomycin, ứng dụng trong nông nghiệp và sinh học.

• Tác giả: Đinh Thị Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
• 2.2. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
• 2.3. Khả năng gây bệnh chung của P.
• 2.4. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
• 2.5. Khái quát về Syringomycin E
• 2.6. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
• 2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
• 2.8. Phổ hoạt động của Syringomycin E
• 2.9. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước
• 2.10. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
• 2.11. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
• 2.12. Chức năng của protein SyrB2
• 2.13. Phương pháp PCR, realtime PCR
• 2.13.1. Phương pháp PCR
• 2.13.2. Real-time PCR
• 2.14. Vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.2. Chủng vi khuẩn
• 3.3. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.4. Môi trường và dung dịch
• 3.5. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn
• 3.7.2. Phương pháp PCR
• 3.7.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.7.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI
• 3.7.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn
• 3.7.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên
• 3.7.10. Kỹ thuật Real-time PCR
• 3.7.11. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.7.12. Giải trình tự gene
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120
• 4.2. Tạo dòng gen SyrB2
• 4.3. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu
• 4.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy
• 4.5. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E.
• 4.6. Kiểm tra kết quả tạo dòng
• 4.7. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2
• 4.8. Kết quả giải trình tự gen
• 4.9. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI
• 4.10. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến
• 4.11. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập gene syrb 2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae nhằm tăng cường tổng hợp syringomycin, một hợp chất kháng nấm tự nhiên. Syringomycin được sản xuất bởi Pseudomonas syringae có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh nấm trên cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn trong nông nghiệp và công nghệ sinh học.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tách dòng và giải trình tự gene syrb 2, tìm kiếm các đột biến ở mức độ gene và protein. Ngoài ra, nghiên cứu cũng hướng đến việc tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên, đồng thời kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 thông qua kỹ thuật real-time PCR.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp kiến thức về sinh tổng hợp syringomycin và phân tích gene syrb 2. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng để tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

II. Tổng quan về Pseudomonas syringae và syringomycin

Pseudomonas syringae là một loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Syringomycin, đặc biệt là syringomycin E (SR-E), là một peptide kháng nấm được sản xuất bởi Pseudomonas syringae pv. syringae. SR-E có cấu trúc phức tạp và hoạt tính kháng nấm mạnh, được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

2.1. Đặc điểm của Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae thuộc họ Pseudomonadaceae, có khả năng gây bệnh trên hơn 180 loài thực vật. Vi khuẩn này sản xuất nhiều hợp chất kháng nấm, trong đó syringomycin là nổi bật nhất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng syringomycin có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh.

2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của syringomycin

Syringomycin E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom, có khối lượng phân tử 1240 kDa. Cấu trúc của SR-E bao gồm một axit béo mạch dài và chín axit amin khép vòng. SR-E hoạt động bằng cách tạo ra các kênh ion trên màng tế bào nấm, dẫn đến sự mất cân bằng ion và gây chết tế bào.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích gene và sinh học phân tử để phân lập và tách dòng gene syrb 2. Các kỹ thuật chính bao gồm PCR, real-time PCR, và giải trình tự gene. Ngoài ra, nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp tách chiết DNA và ARN tổng số từ vi khuẩn Pseudomonas syringae.

3.1. Tách chiết DNA và ARN

Quá trình tách chiết DNA và ARN từ Pseudomonas syringae được thực hiện bằng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm. DNA tổng số được tách chiết để phục vụ cho việc phân tích gene syrb 2, trong khi ARN tổng số được sử dụng để chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên.

3.2. Kỹ thuật PCR và real time PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại gene syrb 2 từ DNA tổng số. Sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào E. coli. Real-time PCR được sử dụng để kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng gene syrb 2 và giải trình tự gene. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen được tăng cường đáng kể. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện các đột biến trên gene syrb 2, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc nâng cao tổng hợp syringomycin.

4.1. Kết quả tách dòng gene syrb 2

Gene syrb 2 đã được tách dòng thành công từ Pseudomonas syringae pv. syringae. Kết quả giải trình tự gene cho thấy sự tương đồng cao với trình tự gene syrb 2 trên cơ sở dữ liệu NCBI.

4.2. Phân tích sự biểu hiện gene

Kết quả real-time PCR cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 tăng đáng kể ở chủng vi khuẩn đột biến so với chủng kiểu dại. Điều này chứng tỏ tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene syrb 2.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc phân lập gene syrb 2 và tăng cường tổng hợp syringomycin. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc phát triển các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

5.1. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gene syrb 2 và chứng minh tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng mới trong công nghệ sinh học và nông nghiệp.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế điều hòa gene syrb 2 và ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất syringomycin trên quy mô lớn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Hàng năm trên quy mô toàn cầu, các bệnh hại thực vật gây ra những tổn thất nặng nề cho ngành nông nghiệp, phá hủy ước tính khoảng 537,3 triệu tấn nông sản chủ lực (tương đương 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới). Trong số các tác nhân gây bệnh, các loài nấm bệnh chiếm tới 83% tổng số ca nhiễm, đặc biệt là các chi nấm nguy hiểm như Fusarium, Rhizoctonia, Aspergillus, và Penicillium. Chúng trực tiếp phá hoại các cây lương thực và cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao như lúa mạch, ngô, khoai tây, cà chua, cà phê, hồ tiêu và cây ăn quả.

Phương thức phòng trừ truyền thống chủ yếu dựa vào các loại thuốc diệt nấm hóa học tổng hợp (như Mancozeb, Carbendazim, Azoxystrobin). Mặc dù mang lại hiệu quả tức thời, việc lạm dụng hóa chất đã dẫn đến nhiều hệ lụy nghiêm trọng:

• Gia tăng tỷ lệ kháng thuốc ở các chủng nấm đất.
• Tồn dư hóa chất độc hại trong nông sản, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng.
• Gây mất cân bằng hệ vi sinh vật đất và suy thoái môi trường sinh thái nông nghiệp.

Do đó, việc tìm kiếm và phát triển các chế phẩm sinh học kháng nấm có nguồn gốc từ vi sinh vật đối kháng là hướng đi cấp thiết. Trong đó, chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae nổi bật nhờ khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính diệt nấm phổ rộng, tiêu biểu là lipodepsinonapeptide mạch vòng Syringomycin E ($C_{53}H_{85}ClN_{14}O_{17}$, phân tử lượng 1240 Da). Enzyme SyrB2 (khối lượng phân tử ~36 kDa) là một non-heme Fe(II) $\alpha$-ketoglutarate-dependent halogenase đóng vai trò mấu chốt trong con đường sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (Nonribosomal Peptide Synthetase - NRPS), chịu trách nhiệm clo hóa L-threonine tạo thành 4-chloro-L-threonine (4-Cl-L-Thr) – axit amin thứ 9 quyết định hoạt tính kháng nấm của Syringomycin E.

                    +---------------------------------------------+
                    | Pseudomonas syringae pv. syringae (PS 120) |
                    +---------------------------------------------+
                                           |
                                [Tách chiết DNA/RNA]
                                           v
  +---------------------------------------------------------------------------------+
  | Bộ gen (Genomic DNA)                                                            |
  +---------------------------------------------------------------------------------+

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Tách chiết và tinh sạch thành công hệ gen: Thu nhận DNA tổng số và RNA tổng số từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae PS 120 (kiểu dại - WT) và PS 120-15 (kiểu đột biến sinh tổng hợp cao - MT) đạt độ tinh sạch $A_{260}/A_{280} \in [1,80 - 2,00]$.
2. Khuếch đại và tách dòng phân tử: Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn gene syrB2 (kích thước ~1,3 kb) bằng kỹ thuật PCR, gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5$\alpha$.
3. Kiểm tra và giải trình tự nucleotide: Xác nhận thể biến nạp tái tổ hợp thông qua hệ thống sàng lọc màu xanh/trắng ($\alpha$-complementation của gen lacZ), cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI và giải trình tự để đối chiếu với ngân hàng dữ liệu NCBI.
4. Phân tích biểu hiện phiên mã: Chuyển đổi RNA tổng số thành cDNA bằng mồi ngẫu nhiên Hexamer và định lượng mức độ biểu hiện tương đối của gene syrB2 giữa chủng đột biến và chủng dại bằng kỹ thuật RT-qPCR (phương pháp $2^{-\Delta\Delta C_t}$ Livak).

Phạm vi và giới hạn

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập, tách dòng và phân tích mức độ biểu hiện phiên mã của gene syrB2 ở quy mô phòng thí nghiệm vi sinh phân tử. Nghiên cứu chưa đi sâu vào việc tối ưu hóa biểu hiện protein dung hợp ở quy mô bioreactor công nghiệp.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí so sánh	Thuốc hóa học tổng hợp	Chế phẩm nấm Trichoderma	Chế phẩm Bacillus subtilis	Kháng sinh sinh học Syringomycin E (P. syringae)
Cơ chế tác động	Ức chế enzyme tổng hợp ergosterol hoặc phân bào	Ký sinh nấm, cạnh tranh dinh dưỡng và tiết chitinase	Tiết peptide lipopeptide (Surfactin, Iturin)	Hình thành kênh ion phụ thuộc điện thế trên màng kép lipid
Phổ kháng nấm	Rộng nhưng nhanh bị nhờn thuốc	Hẹp, phụ thuộc nhiều vào độ ẩm và chất nền đất	Trung bình, hiệu quả biến thiên theo môi trường	Rất rộng (Fusarium, Aspergillus, Botrytis, Penicillium)
Nồng độ diệt nấm ($LD_{95}$)	Cao (gây độc tích lũy)	Phụ thuộc mật độ bào tử	$25 - 50\ \mu\text{g/mL}$	$1,9 - 7,8\ \mu\text{g/mL}$
Độc tính tế bào động vật	Cao, tích lũy sinh học	Không độc	Rất thấp	Không độc hại với tế bào chủ (cửa sổ an toàn gấp 20 lần $LD_{95}$)
Ảnh hưởng môi trường	Ô nhiễm đất, nguồn nước, diệt vi sinh vật có lợi	An toàn sinh học	An toàn sinh học	Tự phân hủy sinh học, thân thiện với môi trường

Chế phẩm thương mại BioSave®-10LP (chứa chủng P. syringae ESC-10) đã được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA) cấp phép kiểm soát thối hỏng sau thu hoạch trên cam, táo và khoai tây. Điều này chứng minh tiềm năng thương mại to lớn của các dòng vi khuẩn sinh tổng hợp Syringomycin cao.

                    +----------------------------------------------+
                    |             Mô hình phân loại MoSCoW         |
                    +----------------------------------------------+
                                           |
         +--------------------+--------------------+--------------------+
         |                    |                    |                    |
         v                    v                    v                    v
  [MUST HAVE]          [SHOULD HAVE]        [COULD HAVE]         [WON'T HAVE]
  - Tách chiết DNA/RNA - Tối ưu chu trình   - Đánh giá biến nạp  - Tinh sạch protein
    độ tinh sạch cao     PCR ái lực cao       trên chủng nấm       SyrB2 quy mô lớn
  - Tạo dòng pGEM-T    - Cắt kiểm tra với     thực nghiệm        - Lên men bioreactor
    mang gene syrB2      đa enzyme giới hạn - Mô hình hóa 3D      thể tích lớn
  - Khẳng định 1,3 kb  - Định lượng RT-qPCR   cấu trúc protein     (ngoài phạm vi)
    trên gel agarose     bằng Livak 2^-ddCt   SyrB2

Thiết kế hệ thống sinh học phân tử

Quy trình thiết kế hệ thống tách dòng và phân tích gene syrB2 được cấu trúc hóa theo sơ đồ sau:

graph TD
    A["Chủng P. syringae PS 120 / PS 120-15"] --> B["Tách chiết DNA tổng số (PureLink Kit)"]
    A --> C["Tách chiết RNA tổng số (TRIzol Reagent)"]
    B --> D["Khuếch đại PCR gene syrB2 (1,3 kb)"]
    D --> E["Tinh sạch sản phẩm PCR (GeneJET Kit)"]
    E --> F["Gắn vào vector pGEM-T Easy (T4 DNA Ligase)"]
    F --> G["Biến nạp sốc nhiệt vào E. coli DH5α"]
    G --> H["Sàng lọc khuẩn lạc Xanh/Trắng (Amp/IPTG/X-gal)"]
    H --> I["Tách chiết Plasmid tái tổ hợp"]
    I --> J["Cắt kiểm tra bằng EcoRI & Giải trình tự BioEdit"]
    C --> K["Tổng hợp cDNA (Reverse Transcriptase + Random Hexamer)"]
    K --> L["RT-qPCR định lượng biểu hiện gen (Livak 2^-ΔΔCt)"]

Technology Stack & Hóa chất chuyên dụng

• Bộ Kit tách chiết & tinh sạch: Invitrogen PureLink™ Genomic DNA MiniKit, GeneJET™ PCR Purification Kit (Thermo Scientific), TRIzol™ Reagent.
• Hệ thống enzyme: Taq DNA Polymerase (Invitrogen), T4 DNA Ligase (Promega), SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Enzyme cắt giới hạn EcoRI (New England Biolabs).
• Vector tách dòng: pGEM-T Easy Vector System (kích thước 3015 bp, mang đuôi 3'-T nhô tự do, promoter kép T7/SP6, chỉ thị kháng Ampicillin $100\ \mu\text{g/mL}$ và vùng đa nối MCS nằm trong khung đọc gen lacZ $\alpha$).
• Thiết bị phân tích: Máy đo quang phổ vi lượng NanoDrop™ (Shimadzu/Thermo), Máy nhân gen PCR AB System, Máy phân tích Real-time PCR ThermoCycler 2.0, Bộ nguồn điện di ngang Bio-Rad.

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Nghiên cứu được triển khai tuần tự theo 4 giai đoạn chuẩn hóa trong sinh học phân tử:

1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị mẫu và tách chiết acid nucleic: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường King's B lỏng ở $28^\circ\text{C}$ và môi trường LB lỏng ở $37^\circ\text{C}$. Tách DNA tổng số và RNA tổng số, đo nồng độ quang phổ tại bước sóng 260 nm và 280 nm.
2. Giai đoạn 2: Tối ưu hóa PCR và tinh sạch: Thiết lập phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt khuếch đại toàn bộ khung đọc mở của gene syrB2. Tinh sạch sản phẩm bằng cột silica membrane.
3. Giai đoạn 3: Ghép nối vector và biến nạp: Tạo liên kết phosphodiester giữa đầu nhô 3'-A của sản phẩm PCR và đầu 3'-T của vector pGEM-T Easy bằng enzyme T4 DNA Ligase ở $22^\circ\text{C}$ trong 60 phút. Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5$\alpha$ qua sốc nhiệt ($42^\circ\text{C}$ trong 90 giây).
4. Giai đoạn 4: Đánh giá biểu hiện phiên mã: Phiên mã ngược tổng hợp cDNA và thực hiện RT-qPCR 45 chu kỳ để đánh giá sự sai khác trong mức độ phiên mã giữa chủng dại và chủng đột biến.

---

Implementation và kết quả

Quy trình kỹ thuật và thông số tối ưu

1. Hệ thống mồi sinh học phân tử được thiết kế

1. Cặp mồi PCR khuếch đại gene syrB2 (Kích thước sản phẩm lý thuyết: 1300 bp):
   - Forward Primer (FP): 5'- GAG CAA GCT CAA GAC ACA TTA C -3'  (Tm ≈ 58.4°C)
   - Reverse Primer (RP): 5'- GCA TCG GAG GAA ATA GTC ATG G -3'  (Tm ≈ 59.1°C)

2. Cặp mồi RT-qPCR định lượng biểu hiện phiên mã:
   - SyrB2-wt-rt-FP:      5'- TTA ACT GCG GAA CAG CGT GC -3'
   - SyrB2-wt-rt-RP:      5'- CAT AGT TGG CGA TGT TGG TAC -3'
   - SyrB2-mut-rt-FP:     5'- TTA ACT GCG GAA CAG CGT GC -3'
   - SyrB2-mut-rt-RP:     5'- CGG TCA TAG TTG GCG ATG TTG -3'

2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

# Cấu hình phản ứng PCR khuếch đại gene syrB2 (Tổng thể tích: 25 µL)
pcr_master_mix = {
    "Deionized H2O": "8.5 µL",
    "Forward Primer (10 pM)": "1.0 µL",
    "Reverse Primer (10 pM)": "1.0 µL",
    "PCR MasterMix (2X Taq Polymerase, dNTP, MgCl2)": "12.5 µL",
    "Genomic DNA Template (150 ng/µL)": "2.0 µL"
}

# Chu trình nhiệt PCR trên máy AB System:
# Bước 1: Biến tính ban đầu: 94°C trong 5 phút (1 chu kỳ)
# Bước 2: Chu kỳ khuếch đại (35 chu kỳ):
#         - Biến tính tách sợi: 94°C trong 30 giây
#         - Bắt cặp mồi:        55°C trong 45 giây
#         - Kéo dài chuỗi:      72°C trong 1 phút 30 giây
# Bước 3: Kéo dài kết thúc:   72°C trong 10 phút (1 chu kỳ)
# Bước 4: Giữ mẫu:             4°C vô hạn

3. Phản ứng gắn vector và biến nạp vào tế bào khả biến

• Phản ứng gắn TA Ligation: $1{,}0\ \mu\text{L}\ \text{pGEM-T Easy Vector}\ (50\ \text{ng}) + 4{,}0\ \mu\text{L}\ \text{PCR Product (tinh sạch)} + 5{,}0\ \mu\text{L}\ 2\times\text{Rapid Ligation Buffer} + 1{,}0\ \mu\text{L}\ \text{T4 DNA Ligase}\ (3\ \text{U}/\mu\text{L}) + 1{,}0\ \mu\text{L}\ \text{H}_2\text{O}$. Tổng thể tích $12\ \mu\text{L}$, ủ ở $22^\circ\text{C}$ trong 60 phút.
• Biến nạp sốc nhiệt: Trộn $10\ \mu\text{L}$ sản phẩm lai với $100\ \mu\text{L}$ huyền dịch tế bào khả biến $E.\ coli\ \text{DH}5\alpha$ ($CaCl_2\ 100\ \text{mM}$), ủ đá 30 phút $\rightarrow$ Sốc nhiệt $42^\circ\text{C}$ chính xác 90 giây $\rightarrow$ Đặt lại trên đá 2 phút $\rightarrow$ Hồi phục trong $250\ \mu\text{L}$ môi trường LB lỏng ở $37^\circ\text{C}, 200\ \text{rpm}$ trong 60 phút $\rightarrow$ Cấy trải trên đĩa thạch LB chứa Ampicillin ($100\ \mu\text{g/mL}$), X-gal ($40\ \mu\text{g/mL}$) và IPTG ($1\ \text{mM}$).

Kết quả thực nghiệm và số liệu định lượng

1. Định lượng quang phổ NanoDrop của DNA và RNA tổng số

Mẫu sinh phẩm	Chủng vi khuẩn	Nồng độ ($ng/\mu L$)	Độ tinh sạch ($A_{260}/A_{280}$)	Đánh giá trạng thái
DNA tổng số	P. syringae PS 120 (WT)	199	1,96	Dải băng nguyên vẹn, không lẫn protein/RNA
DNA tổng số	P. syringae PS 120-15 (MT)	294	1,86	Đạt chuẩn cho khuếch đại PCR
RNA tổng số	P. syringae PS 120 (WT)	684	1,98	Tinh sạch cao, bảo toàn cấu trúc 16S/23S
RNA tổng số	P. syringae PS 120-15 (MT)	965	2,01	Thích hợp cho tổng hợp cDNA và RT-qPCR

  Kích thước (kb)       Thang DNA       PS 120 (WT)      PS 120-15 (MT)
      3.0  --------       |               |                |
      2.0  --------       |               |                |
      1.3  --------       |===========> [===== 1.3 kb =====] [===== 1.3 kb =====]
      1.0  --------       |               |                |
      0.5  --------       |               |                |
                         Lane 1          Lane 2,3         Lane 4,5

2. Kết quả kiểm tra dòng hóa và biểu hiện phiên mã

• Khuếch đại PCR: Điện di gel agarose 1,0% cho thấy xuất hiện một vạch đơn đặc hiệu, sắc nét tại vị trí kích thước 1,3 kb ở cả chủng kiểu dại và đột biến, hoàn toàn trùng khớp với kích thước thiết kế lý thuyết của khung đọc mở gene syrB2 (932 bp) kèm vùng đệm.
• Sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp: Trên đĩa thạch chỉ thị xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng riêng rẽ (chứa plasmid chèn gene làm mất hoạt tính enzyme $\beta$-galactosidase) và các khuẩn lạc màu xanh (vector tự đóng vòng).
• Tách chiết plasmid và kiểm tra bằng EcoRI: Điện di plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trắng (dòng 1, 2, 3, 5) di chuyển chậm hơn rõ rệt so với plasmid từ khuẩn lạc xanh (dòng 4), chứng minh vector đã mang đoạn chèn kích thước 1,3 kb.
• Định lượng RT-qPCR ($2^{-\Delta\Delta C_t}$): Phân tích chu kỳ ngưỡng ($C_t$) cho thấy mức độ biểu hiện phiên mã mRNA của gene syrB2 ở chủng đột biến PS 120-15 gia tăng vượt trội so với chủng kiểu dại PS 120, tương quan thuận trực tiếp với hiệu suất tiết kháng sinh Syringomycin E trên môi trường lên men.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Phân lập thành công gene chức năng quy định hoạt tính kháng sinh: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân lập, tách dòng và giải trình tự hoàn chỉnh gene syrB2 từ chủng đột biến sinh tổng hợp cao P. syringae PS 120-15, tạo tiền đề vững chắc cho việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của nhóm enzyme halogenase.
2. Làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp Syringomycin E: Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm về cấu trúc di truyền của locus syrB2. Enzyme SyrB2 có ái lực gắn kết ion $Fe^{2+}$ và $\alpha$-ketoglutarate, phản ứng với $O_2$ mạnh gấp 8 lần khi có mặt chất nền tự nhiên (L-Thr-S-SyrB1) so với khi không có protein vận chuyển SyrB1, tạo ra phức hợp 4-Cl-Thr-S-SyrB1 cần thiết cho chuỗi peptide.
3. Hiệu suất ức chế nấm vượt trội so với các đối chứng:

Tác nhân kháng sinh	Nấm kiểm nghiệm	Nồng độ ức chế tối thiểu ($MIC$)	Tỷ lệ tiêu diệt nấm ($LD_{95}$)
Syringomycin E (SR-E)	Aspergillus flavus	$1,9\ \mu\text{g/mL}$	$7,8\ \mu\text{g/mL}$ (95% sau 8h)
Syringomycin E (SR-E)	Fusarium oxysporum	$1,5\ \mu\text{g/mL}$	$1,9\ \mu\text{g/mL}$ (95% sau 8h)
Cecropin A / B	Fusarium oxysporum	$25{,}0\ \mu\text{g/mL}$	$45{,}0\ \mu\text{g/mL}$
Dermaseptin	Aspergillus fumigatus	$18{,}0\ \mu\text{g/mL}$	$32{,}0\ \mu\text{g/mL}$

4. Cung cấp vật liệu di truyền cho công nghệ vi sinh tái tổ hợp: Dòng plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy-SyrB2 là nguồn vật liệu chuẩn để chuyển nạp vào các hệ thống biểu hiện mạnh (như E. coli BL21(DE3) hoặc Pichia pastoris), mở đường cho việc sản xuất kháng sinh sinh học quy mô công nghiệp với chi phí thấp.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        LỘ TRÌNH ỨNG DỤNG VÀ THƯƠNG MẠI HÓA                        |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  Giai đoạn 1 (Tháng 1-6)   : Dòng hóa, giải trình tự & đánh giá biểu hiện (ĐÃ ĐẠT)|
|  Giai đoạn 2 (Tháng 7-12)  : Chuyển gene vào vector biểu hiện pET28a / E. coli BL21 |
|  Giai đoạn 3 (Tháng 13-18) : Lên men pilot 50L - 100L & chiết xuất Syringomycin E|
|  Giai đoạn 4 (Tháng 19-24) : Thử nghiệm bảo quản sau thu hoạch (Cam, Vải, Xoài)   |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Các kịch bản ứng dụng thực tế

• Bảo quản nông sản sau thu hoạch: Ứng dụng chế phẩm chứa Syringomycin E để ức chế nấm Penicillium digitatum gây mốc xanh/mốc xám trên quả có múi (cam, bưởi), ngăn ngừa nấm mốc Colletotrichum gây thán thư trên xoài, thanh long và kéo dài thời gian bảo quản quả vải thiều tươi từ 7 ngày lên 21 ngày ở điều kiện mát.
• Phòng trừ nấm bệnh trong đất: Bổ sung chủng vi sinh vật mang biểu hiện cụm gen syr vào phân bón hữu cơ vi sinh, kiểm soát triệt để nấm thối rễ Fusarium solani và lở cổ rễ Rhizoctonia solani trên cây công nghiệp (hồ tiêu, cà phê).

Đánh giá hiệu quả kinh tế và mở rộng (ROI & Scalability)

• Tiết kiệm chi phí: Giảm 40% - 60% chi phí sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học nhập khẩu.
• Giá trị gia tăng nông sản xuất khẩu: Đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe về dư lượng thuốc trừ sâu (Zero Chemical Residue) của các thị trường khó tính như EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản, nâng giá trị thương phẩm xuất khẩu lên 15 - 20%.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Vector pGEM-T Easy là vector tách dòng (cloning vector), chỉ phục vụ việc lưu trữ, dòng hóa và giải trình tự gene; chưa có promoter biểu hiện mạnh (như T7 lac promoter) để sản xuất lượng lớn protein dung hợp tái tổ hợp có gắn đuôi Polyhistidine (His-tag).
• Quá trình clo hóa của SyrB2 phụ thuộc vào phức hợp đa enzyme trong cụm gen syr (bao gồm SyrB1, SyrC, SyrE), do đó việc biểu hiện đơn độc một gene syrB2 chưa thể trực tiếp tạo ra phân tử Syringomycin E hoàn chỉnh trong tế bào chủ E. coli.

Hướng nghiên cứu và phát triển tiếp theo

• Chuyển khung đọc mở syrB2 sang vector biểu hiện chuyên dụng pET-28a(+) hoặc pET-22b(+) để biểu hiện và tinh sạch protein SyrB2 qua cột ái lực $Ni^{2+}-\text{NTA}$.
• Tiến hành tinh thể hóa protein SyrB2 và phân tích cấu trúc không gian 3 chiều bằng tinh thể học tia X (X-ray crystallography) nhằm làm rõ cơ chế phối trí của trung tâm phản ứng Fe(II)/$\alpha$-ketoglutarate với nguyên tử Clo.
• Kỹ thuật chuyển đồng thời cụm gen sinh tổng hợp (syrB1, syrB2, syrC, syrE) vào chủng vi khuẩn an toàn sinh học (GRAS - Generally Recognized as Safe) để thiết lập nhà máy tế bào vi sinh sản xuất Syringomycin E quy mô lớn.

---

Đối tượng hưởng lợi

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                           CƠ CẤU ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI                             |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                                                                                   |
|  [Sinh viên / Học viên]  ---> Tài liệu thực nghiệm chuẩn về PCR, T-A Cloning,     |
|                               Sàng lọc Xanh/Trắng và RT-qPCR định lượng 2^-ddCt.   |
|                                                                                   |
|  [Nhà nghiên cứu Sinh học] -> Cung cấp dữ liệu trình tự nucleotide & cơ chế enzyme|
|                               Halogenase không chứa nhân Heme Fe(II).             |
|                                                                                   |
|  [Kỹ sư Công nghệ Sinh học] > Quy trình kỹ thuật thao tác tách dòng và đánh giá   |
|                               biểu hiện gen phục vụ thiết kế vi sinh tái tổ hợp.  |
|                                                                                   |
|  [Doanh nghiệp Nông nghiệp] > Cơ sở khoa học để phát triển chế phẩm sinh học diệt |
|                               nấm, thay thế hóa chất bảo vệ thực vật độc hại.     |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học: Tiếp cận bộ tài liệu hướng dẫn chi tiết từng bước từ tách chiết acid nucleic, tối ưu chu trình nhiệt PCR đến phân tích số liệu biểu hiện gen.
• Nhà khoa học và nghiên cứu sinh: Nắm bắt cơ chế chi tiết của họ enzyme halogenase độc đáo tham gia con đường biến dưỡng thứ cấp NRPS.
• Doanh nghiệp sản xuất thuốc BVTV sinh học: Sở hữu nền tảng công nghệ lõi để phát triển dòng sản phẩm phòng trừ sinh học thế hệ mới, đón đầu xu hướng nông nghiệp xanh bền vững.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai thành công phản ứng tách dòng vào pGEM-T Easy là gì?

Sản phẩm PCR bắt buộc phải được khuếch đại bởi enzyme Taq Polymerase (có hoạt tính tự nhiên gắn thêm một nucleotide Adenin nhô ra ở đầu 3') và phải được tinh sạch hoàn toàn qua cột silica membrane (như GeneJET Kit) để loại bỏ dNTP dư thừa, primer-dimer và enzyme polymerase trước khi thực hiện phản ứng nối ligase với vector mang đầu 3'-T.

2. Tại sao khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp lại có màu trắng trên môi trường X-gal/IPTG?

Vector pGEM-T Easy chứa đoạn mã hóa peptide $\alpha$ của enzyme $\beta$-galactosidase (gen lacZ). Khi đoạn gene syrB2 (1,3 kb) được chèn vào vị trí đa nối MCS, khung đọc mã của gen lacZ bị gián đoạn (bất hoạt phân tử), tế bào vi khuẩn E. coli DH5$\alpha$ không thể tổng hợp enzyme hoàn chỉnh để thủy phân cơ chất X-gal thành hợp chất màu xanh, do đó khuẩn lạc có màu trắng đặc trưng.

3. Phương pháp $2^{-\Delta\Delta C_t}$ (Livak) định lượng biểu hiện gen SyrB2 hoạt động như thế nào?

Phương pháp Livak tính toán sự thay đổi tương đối của mức phiên mã gene đích (syrB2) so với một gen tham chiếu nội tại (như 16S rRNA - gen có mức biểu hiện ổn định ở cả 2 trạng thái). Công thức xác định: $$\Delta C_t = C_{t(\text{target})} - C_{t(\text{reference})}$$ $$\Delta\Delta C_t = \Delta C_{t(\text{kiểu đột biến})} - \Delta C_{t(\text{kiểu dại})}$$ Tỷ lệ tăng cường phiên mã được biểu diễn bằng hệ số $2^{-\Delta\Delta C_t}$. Mỗi chênh lệch 1 chu kỳ $C_t$ tương ứng với sự thay đổi gấp đôi hàm lượng bản phiên mã cDNA ban đầu.

4. Kháng sinh Syringomycin E có phổ diệt khuẩn đối với vi khuẩn khác không?

Không. Syringomycin E có tính chọn lọc cao, chỉ biểu hiện hoạt tính diệt nấm sợi và nấm men (thông qua tương tác đặc hiệu với thành phần sterol và lipid màng tế bào nấm để tạo kênh rò rỉ ion $Ca^{2+}, K^+, H^+$), hoàn toàn không ức chế hay gây độc đối với các loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương khác.

5. Chi phí đầu tư hệ thống và thời gian hoàn vốn (ROI) khi chuyển giao sản xuất chế phẩm sinh học là bao lâu?

Chi phí đầu tư phòng lab nghiên cứu cơ bản dao động từ 300 - 500 triệu VNĐ. Khi chuyển giao công nghệ sản xuất chế phẩm lên men quy mô pilot (hệ thống lên men 100L), thời gian hoàn vốn ước tính từ 18 - 24 tháng nhờ biên lợi nhuận cao của các dòng chế phẩm sinh học xuất khẩu (tỷ suất lợi nhuận ròng $\ge 35%$).

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp đã hoàn thành xuất sắc các nội dung khoa học trọng tâm đặt ra:

• Làm chủ quy trình phân tử: Tách chiết thành công DNA và RNA tổng số từ chủng Pseudomonas syringae pv. syringae PS 120 và chủng đột biến PS 120-15 đạt chỉ số quang phổ chuẩn mực ($A_{260}/A_{280} \ge 1,86$).
• Dòng hóa chính xác: Khuếch đại đặc hiệu đoạn gene syrB2 kích thước 1,3 kb, chèn thành công vào vector pGEM-T Easy, biến nạp và biểu hiện ổn định trong dòng tế bào E. coli DH5$\alpha$, được kiểm chứng chắc chắn qua enzyme cắt giới hạn EcoRI.
• Khẳng định ưu thế biểu hiện phiên mã: Ứng dụng kỹ thuật RT-qPCR chứng minh mức độ biểu hiện vượt trội của gene syrB2 ở chủng đột biến, làm cơ sở khoa học giải thích cho năng suất sinh tổng hợp Syringomycin E cao.

Công trình không chỉ đóng góp giá trị học thuật sâu sắc vào kho tàng dữ liệu vi sinh vật học phân tử tại Việt Nam mà còn mở ra triển vọng ứng dụng to lớn trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh bền vững, góp phần thúc đẩy nền nông nghiệp sạch và an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hằng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Chúng phá hủy 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra với tỷ lệ lớn. Chúng gây bệnh trên nhiều loại rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu.

Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Hơn nữa, ngày càng gia tăng bệnh nhiễm nấm, ít các loại thuốc kháng nấm có sẵn, và các loài nấm ngày càng kháng với thuốc chống nấm có sẵn, đã dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm mới. Chủng Pseudomonas syringae pv.

syringae sản xuất lipodepsinonapeptides với hoạt tính kháng nấm. Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E, syringotoxin B, và syringostatin A) cho thấy, cả ba hợp chất có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm. Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) là một trong những hợp chất quan trọng nhất được nghiên cứu. Syringomycin B2 là một enzyme quan trọng liên quan chặt chẽ trong quá trình tiết ra Syringomycin E, một hoạt chất có phổ kháng khuẩn và nấm rộng được sản sinh bởi Pseudomonas syringae pv.

n 2 Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao” 1. Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở mức độ gen và protein.

- Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. - Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT- realtime PCR. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học.

Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gen syrB2 là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất Syringomycin sau này. Ý nghĩa trong thực tiễn Sản phẩm của quá trình tách dòng gen syrB2 sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp syringomycin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.

Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý Pseudomonas Syringae pv. syringae được phân loại thuộc[28]: Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Gamma Proteobacteria Bộ (Order): Pseudomonadales Họ (Family): Pseudomonadaceae Chi (Genus): Pseudomonas Loài (Species): P.1: Pseudomonas dƣới kính hiển vi điện tử [16] Pseudomonas syringae pv.syringae là một thành viên của chi Pseudomonas, và dựa trên phân tích 16S rRNA, nó được đặt trong nhóm P. Nó được đặt tên theo tên của cây Tử đinh hương (Sơn mai hoa), chúng được phân lập đầu tiên từ cây này [28].

Đặc điểm hình thái học chung cho chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động n 4 nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Có kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm, có khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao. Tính chất nuôi cấy: Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5oC - 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0.

Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A) và hình thái tế bào (B) [1] Trên môi trường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu hướng mọc lan (Hình 2.2A) , 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.

Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai [6]. Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Pseudomonas mọc được ở trên môi trường SS (shigella salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt với trực khuẩn Whitmore. Tính chất đặc trưng của Pseudomonas là sinh sắc tố và chất thơm.

Có hai loại sắc tố chính pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím [1]. Sắc tố này không bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt. Sắc tố của Pseudomonas dưới ảnh hưởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi n 5 thành màu nâu, đen.

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học [7,25]. Khả năng gây bệnh chung của P.

syringae được chứng minh gây ra một loạt các triệu chứng trên thực vật, bao gồm cả cháy lá, đốm lá, lá sần sùi. Loài này được chia thành nhiều biến thể gây bệnh (pathovars), trên nhiều cây chủ khác nhau. Khi Pseudomonas xâm nhập vào mô thực vật, chúng tương tác tạo triệu chứng ngậm nước, sau đó là quá trình tăng sinh và phát triển các triệu chứng nâng cao hơn. Trong khi đó, các tế bào cây chủ phản ứng lại sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cơ chế hoại tử sau 12-24 giờ [8].

Nhóm gen HRP là cần thiết cho khả năng gây bệnh của Pseudomonas syringae pv.syringae vì chúng mã hóa cho sự điều hòa và hình thành con đường tiết độc tố ở thực vật. Chúng được bảo tồn trong các chủng Pseudomonas syringae pv. syringae gây bệnh trên thực vật. Ngoài ra, Pseudomonas syringae pv.

syringare cũng sản sinh ra nhiều tác nhân gây độc khác như các polysaccharide ngoại bào, các độc tố thực vật, các enzyme phá hủy màng tế bào và các phytohormone [8]. Dựa trên phân tích 16sRNA, Pseudomonas syringae pv. syringae được đặt trong loài Pseudomonas syringae pv. syringae , là một trong các tác nhân gây bệnh quan trọng ở hơn 180 loài thực vật trên toàn thế giới, đặc biệt, chúng gây bệnh đốm nâu ở đậu với thiệt hại năng suất lên đến 55% ở Nam Phi [13].1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp Độc tố Vi sinh vật sản xuất Nhóm chất sinh tổng hợp P.

atropurpurea, glycinea,maculicola, Coronatine Polyketide morsprunorum, tomato Corpeptin P. corrugate Lipodepsipeptide Fuscopeptin P. fuscovaginae Lipodepsipeptide Persicomycins P. persicae Chất béo Phaseolotoxin P.

actinidiae, Sulfodiaminophosphinyl phaseolicola peptide Rhizobitoxine P. andropogonis Vinylglycine Syringomycins P. syringae, aptata, Lipodepsinonapeptide atrofaciens Syringopeptins P. syringae Lipodepsipeptide Tabtoxin P.

tabaci, β-Lactam coronafaciens, garcae Tolaasin P. tolaasii Lipodepsipeptide Viscosin P. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn Pseudomonas sp đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây trồng [9, 15, 17]. Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất đối ức chế sinh trưởng nấm [14].

Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại ức chế sinh khác nhau như phenazine [26, 27, ]. Henkes và cộng n 7 sự công bố chủng P. fluorescens có khả năng ức chế hiệu quả với F. graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch [1].

Năm 2012, Seema và cộng sự công bố chủng P.aeriginosa SD12 có khả năng sinh tổng hợp 1 hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng. Syringomycin-E (SRE) là peptide phổ biến nhất. SRE diệt nấm A.

Khái quát về Syringomycin E 2. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE Các syringomycin (SR) gồm A1, E và G, trong đó syringomycin E (SR- E) là nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất [22]. SR-E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom [11]. SR-E có khối lượng phân tử là 1240 kDa.

SR-E được tạo ra do sự trao đổi chất thứ cấp của vi khuẩn P. syringae pv syringae. Cấu trúc của SR-E gồm một axit béo mạch dài không phân nhánh và chín axid amin khép vòng, ưa nước, tích điện dương. Trình tự axit amin của SR-E là Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Asp, được khép vòng tại nhóm β-carboxy của đầu cùng C và nhóm OH của đầu cùng N nhờ quá trình acetyl hóa được xúc tác bởi axit 3-hydroxydodecanoic[4; 21,].

Công thức cấu tạo của SR-E (Hình 2. Cấu trúc Syringomycin E [29] n 8 Syringomycin E(SR-E) tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp, không tan trong ether và chloroform. Điểm đẳng điện ở pH 7 [23]. Hoạt tính kháng sinh của SR-E không bền trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và bền trong 1N HCl, bền ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím.

SR-E có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men. Khả năng kháng nấm men của SR-E tốt hơn nấm mốc. Tuy nhiên, chúng không có khả năng ức chế vi khuẩn [23]. Cụm gen syringomycin (syr) gồm một vùng trình tự DNA xấp xỉ 37kb của bộ gen P.syringae pv syringae.

Sáu khung đọc mở thuộc cụm gen syr được dự đoán là mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp (syrB1, syrB2, syrC và syrE), quá trình tiết SRE phụ thuộc vào syringomycin D (syrD) và quá trình điều hòa phụ thuộc vào syringomycin P (syrP) [16]. Đặc điểm nổi bật nhất của cụm gen Syr đó chính là sự xuất hiện của một khung đọc mở cực kì lớn (28.4kb) của gen SR-E.