Luận Văn Thạc Sĩ: Phân Lập Gene Syrb 2 Từ Chủng Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae Pv Syringae Để Sinh Tổng Hợp Syringomycin Cao

• Tác giả: Đinh Thị Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
• 2.2. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
• 2.3. Khả năng gây bệnh chung của P.
• 2.4. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
• 2.5. Khái quát về Syringomycin E
• 2.6. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
• 2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
• 2.8. Phổ hoạt động của Syringomycin E
• 2.9. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước
• 2.10. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
• 2.11. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
• 2.12. Chức năng của protein SyrB2
• 2.13. Phương pháp PCR, realtime PCR
• 2.13.1. Phương pháp PCR
• 2.13.2. Real-time PCR
• 2.14. Vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.2. Chủng vi khuẩn
• 3.3. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.4. Môi trường và dung dịch
• 3.5. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn
• 3.7.2. Phương pháp PCR
• 3.7.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.7.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI
• 3.7.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn
• 3.7.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên
• 3.7.10. Kỹ thuật Real-time PCR
• 3.7.11. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.7.12. Giải trình tự gene
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120
• 4.2. Tạo dòng gen SyrB2
• 4.3. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu
• 4.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy
• 4.5. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E.
• 4.6. Kiểm tra kết quả tạo dòng
• 4.7. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2
• 4.8. Kết quả giải trình tự gen
• 4.9. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI
• 4.10. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến
• 4.11. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập gene syrb 2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae nhằm tăng cường tổng hợp syringomycin, một hợp chất kháng nấm tự nhiên. Syringomycin được sản xuất bởi Pseudomonas syringae có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh nấm trên cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn trong nông nghiệp và công nghệ sinh học.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tách dòng và giải trình tự gene syrb 2, tìm kiếm các đột biến ở mức độ gene và protein. Ngoài ra, nghiên cứu cũng hướng đến việc tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên, đồng thời kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 thông qua kỹ thuật real-time PCR.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp kiến thức về sinh tổng hợp syringomycin và phân tích gene syrb 2. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng để tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

II. Tổng quan về Pseudomonas syringae và syringomycin

Pseudomonas syringae là một loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Syringomycin, đặc biệt là syringomycin E (SR-E), là một peptide kháng nấm được sản xuất bởi Pseudomonas syringae pv. syringae. SR-E có cấu trúc phức tạp và hoạt tính kháng nấm mạnh, được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

2.1. Đặc điểm của Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae thuộc họ Pseudomonadaceae, có khả năng gây bệnh trên hơn 180 loài thực vật. Vi khuẩn này sản xuất nhiều hợp chất kháng nấm, trong đó syringomycin là nổi bật nhất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng syringomycin có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh.

2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của syringomycin

Syringomycin E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom, có khối lượng phân tử 1240 kDa. Cấu trúc của SR-E bao gồm một axit béo mạch dài và chín axit amin khép vòng. SR-E hoạt động bằng cách tạo ra các kênh ion trên màng tế bào nấm, dẫn đến sự mất cân bằng ion và gây chết tế bào.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích gene và sinh học phân tử để phân lập và tách dòng gene syrb 2. Các kỹ thuật chính bao gồm PCR, real-time PCR, và giải trình tự gene. Ngoài ra, nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp tách chiết DNA và ARN tổng số từ vi khuẩn Pseudomonas syringae.

3.1. Tách chiết DNA và ARN

Quá trình tách chiết DNA và ARN từ Pseudomonas syringae được thực hiện bằng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm. DNA tổng số được tách chiết để phục vụ cho việc phân tích gene syrb 2, trong khi ARN tổng số được sử dụng để chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên.

3.2. Kỹ thuật PCR và real time PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại gene syrb 2 từ DNA tổng số. Sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào E. coli. Real-time PCR được sử dụng để kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng gene syrb 2 và giải trình tự gene. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen được tăng cường đáng kể. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện các đột biến trên gene syrb 2, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc nâng cao tổng hợp syringomycin.

4.1. Kết quả tách dòng gene syrb 2

Gene syrb 2 đã được tách dòng thành công từ Pseudomonas syringae pv. syringae. Kết quả giải trình tự gene cho thấy sự tương đồng cao với trình tự gene syrb 2 trên cơ sở dữ liệu NCBI.

4.2. Phân tích sự biểu hiện gene

Kết quả real-time PCR cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 tăng đáng kể ở chủng vi khuẩn đột biến so với chủng kiểu dại. Điều này chứng tỏ tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene syrb 2.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc phân lập gene syrb 2 và tăng cường tổng hợp syringomycin. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc phát triển các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

5.1. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gene syrb 2 và chứng minh tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng mới trong công nghệ sinh học và nông nghiệp.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế điều hòa gene syrb 2 và ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất syringomycin trên quy mô lớn.