Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập gene syrb 2 ừ chủng vi khuẩn pseudomonas syringae pv syringae sinh tổng hợp syringomycin cao

Nghiên cứu phân lập gene syrb 2 từ Pseudomonas syringae pv syringae nhằm tăng cường tổng hợp syringomycin, ứng dụng trong nông nghiệp và sinh học.

• Tác giả: Đinh Thị Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
• 2.2. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
• 2.3. Khả năng gây bệnh chung của P.
• 2.4. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
• 2.5. Khái quát về Syringomycin E
• 2.6. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
• 2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
• 2.8. Phổ hoạt động của Syringomycin E
• 2.9. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước
• 2.10. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
• 2.11. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
• 2.12. Chức năng của protein SyrB2
• 2.13. Phương pháp PCR, realtime PCR
• 2.13.1. Phương pháp PCR
• 2.13.2. Real-time PCR
• 2.14. Vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.2. Chủng vi khuẩn
• 3.3. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.4. Môi trường và dung dịch
• 3.5. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn
• 3.7.2. Phương pháp PCR
• 3.7.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.7.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI
• 3.7.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn
• 3.7.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên
• 3.7.10. Kỹ thuật Real-time PCR
• 3.7.11. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.7.12. Giải trình tự gene
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120
• 4.2. Tạo dòng gen SyrB2
• 4.3. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu
• 4.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy
• 4.5. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E.
• 4.6. Kiểm tra kết quả tạo dòng
• 4.7. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2
• 4.8. Kết quả giải trình tự gen
• 4.9. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI
• 4.10. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến
• 4.11. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập gene syrb 2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae nhằm tăng cường tổng hợp syringomycin, một hợp chất kháng nấm tự nhiên. Syringomycin được sản xuất bởi Pseudomonas syringae có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh nấm trên cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn trong nông nghiệp và công nghệ sinh học.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tách dòng và giải trình tự gene syrb 2, tìm kiếm các đột biến ở mức độ gene và protein. Ngoài ra, nghiên cứu cũng hướng đến việc tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên, đồng thời kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 thông qua kỹ thuật real-time PCR.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp kiến thức về sinh tổng hợp syringomycin và phân tích gene syrb 2. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng để tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

II. Tổng quan về Pseudomonas syringae và syringomycin

Pseudomonas syringae là một loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Syringomycin, đặc biệt là syringomycin E (SR-E), là một peptide kháng nấm được sản xuất bởi Pseudomonas syringae pv. syringae. SR-E có cấu trúc phức tạp và hoạt tính kháng nấm mạnh, được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

2.1. Đặc điểm của Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae thuộc họ Pseudomonadaceae, có khả năng gây bệnh trên hơn 180 loài thực vật. Vi khuẩn này sản xuất nhiều hợp chất kháng nấm, trong đó syringomycin là nổi bật nhất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng syringomycin có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh.

2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của syringomycin

Syringomycin E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom, có khối lượng phân tử 1240 kDa. Cấu trúc của SR-E bao gồm một axit béo mạch dài và chín axit amin khép vòng. SR-E hoạt động bằng cách tạo ra các kênh ion trên màng tế bào nấm, dẫn đến sự mất cân bằng ion và gây chết tế bào.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích gene và sinh học phân tử để phân lập và tách dòng gene syrb 2. Các kỹ thuật chính bao gồm PCR, real-time PCR, và giải trình tự gene. Ngoài ra, nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp tách chiết DNA và ARN tổng số từ vi khuẩn Pseudomonas syringae.

3.1. Tách chiết DNA và ARN

Quá trình tách chiết DNA và ARN từ Pseudomonas syringae được thực hiện bằng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm. DNA tổng số được tách chiết để phục vụ cho việc phân tích gene syrb 2, trong khi ARN tổng số được sử dụng để chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên.

3.2. Kỹ thuật PCR và real time PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại gene syrb 2 từ DNA tổng số. Sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào E. coli. Real-time PCR được sử dụng để kiểm tra sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng gene syrb 2 và giải trình tự gene. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 ở mức độ gen được tăng cường đáng kể. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện các đột biến trên gene syrb 2, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc nâng cao tổng hợp syringomycin.

4.1. Kết quả tách dòng gene syrb 2

Gene syrb 2 đã được tách dòng thành công từ Pseudomonas syringae pv. syringae. Kết quả giải trình tự gene cho thấy sự tương đồng cao với trình tự gene syrb 2 trên cơ sở dữ liệu NCBI.

4.2. Phân tích sự biểu hiện gene

Kết quả real-time PCR cho thấy sự biểu hiện của gene syrb 2 tăng đáng kể ở chủng vi khuẩn đột biến so với chủng kiểu dại. Điều này chứng tỏ tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene syrb 2.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc phân lập gene syrb 2 và tăng cường tổng hợp syringomycin. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc phát triển các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp.

5.1. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gene syrb 2 và chứng minh tiềm năng của việc nâng cao tổng hợp syringomycin thông qua điều chỉnh gene. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng mới trong công nghệ sinh học và nông nghiệp.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế điều hòa gene syrb 2 và ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất syringomycin trên quy mô lớn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hằng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Chúng phá hủy 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra với tỷ lệ lớn. Chúng gây bệnh trên nhiều loại rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu.

Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Hơn nữa, ngày càng gia tăng bệnh nhiễm nấm, ít các loại thuốc kháng nấm có sẵn, và các loài nấm ngày càng kháng với thuốc chống nấm có sẵn, đã dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm mới. Chủng Pseudomonas syringae pv.

syringae sản xuất lipodepsinonapeptides với hoạt tính kháng nấm. Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E, syringotoxin B, và syringostatin A) cho thấy, cả ba hợp chất có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm. Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) là một trong những hợp chất quan trọng nhất được nghiên cứu. Syringomycin B2 là một enzyme quan trọng liên quan chặt chẽ trong quá trình tiết ra Syringomycin E, một hoạt chất có phổ kháng khuẩn và nấm rộng được sản sinh bởi Pseudomonas syringae pv.

n 2 Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao” 1. Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở mức độ gen và protein.

- Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. - Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT- realtime PCR. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học.

Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gen syrB2 là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất Syringomycin sau này. Ý nghĩa trong thực tiễn Sản phẩm của quá trình tách dòng gen syrB2 sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp syringomycin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.

Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý Pseudomonas Syringae pv. syringae được phân loại thuộc[28]: Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Gamma Proteobacteria Bộ (Order): Pseudomonadales Họ (Family): Pseudomonadaceae Chi (Genus): Pseudomonas Loài (Species): P.1: Pseudomonas dƣới kính hiển vi điện tử [16] Pseudomonas syringae pv.syringae là một thành viên của chi Pseudomonas, và dựa trên phân tích 16S rRNA, nó được đặt trong nhóm P. Nó được đặt tên theo tên của cây Tử đinh hương (Sơn mai hoa), chúng được phân lập đầu tiên từ cây này [28].

Đặc điểm hình thái học chung cho chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động n 4 nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Có kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm, có khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao. Tính chất nuôi cấy: Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5oC - 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0.

Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A) và hình thái tế bào (B) [1] Trên môi trường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu hướng mọc lan (Hình 2.2A) , 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.

Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai [6]. Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Pseudomonas mọc được ở trên môi trường SS (shigella salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt với trực khuẩn Whitmore. Tính chất đặc trưng của Pseudomonas là sinh sắc tố và chất thơm.

Có hai loại sắc tố chính pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím [1]. Sắc tố này không bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt. Sắc tố của Pseudomonas dưới ảnh hưởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi n 5 thành màu nâu, đen.

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học [7,25]. Khả năng gây bệnh chung của P.

syringae được chứng minh gây ra một loạt các triệu chứng trên thực vật, bao gồm cả cháy lá, đốm lá, lá sần sùi. Loài này được chia thành nhiều biến thể gây bệnh (pathovars), trên nhiều cây chủ khác nhau. Khi Pseudomonas xâm nhập vào mô thực vật, chúng tương tác tạo triệu chứng ngậm nước, sau đó là quá trình tăng sinh và phát triển các triệu chứng nâng cao hơn. Trong khi đó, các tế bào cây chủ phản ứng lại sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cơ chế hoại tử sau 12-24 giờ [8].

Nhóm gen HRP là cần thiết cho khả năng gây bệnh của Pseudomonas syringae pv.syringae vì chúng mã hóa cho sự điều hòa và hình thành con đường tiết độc tố ở thực vật. Chúng được bảo tồn trong các chủng Pseudomonas syringae pv. syringae gây bệnh trên thực vật. Ngoài ra, Pseudomonas syringae pv.

syringare cũng sản sinh ra nhiều tác nhân gây độc khác như các polysaccharide ngoại bào, các độc tố thực vật, các enzyme phá hủy màng tế bào và các phytohormone [8]. Dựa trên phân tích 16sRNA, Pseudomonas syringae pv. syringae được đặt trong loài Pseudomonas syringae pv. syringae , là một trong các tác nhân gây bệnh quan trọng ở hơn 180 loài thực vật trên toàn thế giới, đặc biệt, chúng gây bệnh đốm nâu ở đậu với thiệt hại năng suất lên đến 55% ở Nam Phi [13].1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp Độc tố Vi sinh vật sản xuất Nhóm chất sinh tổng hợp P.

atropurpurea, glycinea,maculicola, Coronatine Polyketide morsprunorum, tomato Corpeptin P. corrugate Lipodepsipeptide Fuscopeptin P. fuscovaginae Lipodepsipeptide Persicomycins P. persicae Chất béo Phaseolotoxin P.

actinidiae, Sulfodiaminophosphinyl phaseolicola peptide Rhizobitoxine P. andropogonis Vinylglycine Syringomycins P. syringae, aptata, Lipodepsinonapeptide atrofaciens Syringopeptins P. syringae Lipodepsipeptide Tabtoxin P.

tabaci, β-Lactam coronafaciens, garcae Tolaasin P. tolaasii Lipodepsipeptide Viscosin P. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn Pseudomonas sp đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây trồng [9, 15, 17]. Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất đối ức chế sinh trưởng nấm [14].

Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại ức chế sinh khác nhau như phenazine [26, 27, ]. Henkes và cộng n 7 sự công bố chủng P. fluorescens có khả năng ức chế hiệu quả với F. graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch [1].

Năm 2012, Seema và cộng sự công bố chủng P.aeriginosa SD12 có khả năng sinh tổng hợp 1 hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng. Syringomycin-E (SRE) là peptide phổ biến nhất. SRE diệt nấm A.

Khái quát về Syringomycin E 2. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE Các syringomycin (SR) gồm A1, E và G, trong đó syringomycin E (SR- E) là nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất [22]. SR-E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom [11]. SR-E có khối lượng phân tử là 1240 kDa.

SR-E được tạo ra do sự trao đổi chất thứ cấp của vi khuẩn P. syringae pv syringae. Cấu trúc của SR-E gồm một axit béo mạch dài không phân nhánh và chín axid amin khép vòng, ưa nước, tích điện dương. Trình tự axit amin của SR-E là Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Asp, được khép vòng tại nhóm β-carboxy của đầu cùng C và nhóm OH của đầu cùng N nhờ quá trình acetyl hóa được xúc tác bởi axit 3-hydroxydodecanoic[4; 21,].

Công thức cấu tạo của SR-E (Hình 2. Cấu trúc Syringomycin E [29] n 8 Syringomycin E(SR-E) tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp, không tan trong ether và chloroform. Điểm đẳng điện ở pH 7 [23]. Hoạt tính kháng sinh của SR-E không bền trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và bền trong 1N HCl, bền ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím.

SR-E có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men. Khả năng kháng nấm men của SR-E tốt hơn nấm mốc. Tuy nhiên, chúng không có khả năng ức chế vi khuẩn [23]. Cụm gen syringomycin (syr) gồm một vùng trình tự DNA xấp xỉ 37kb của bộ gen P.syringae pv syringae.

Sáu khung đọc mở thuộc cụm gen syr được dự đoán là mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp (syrB1, syrB2, syrC và syrE), quá trình tiết SRE phụ thuộc vào syringomycin D (syrD) và quá trình điều hòa phụ thuộc vào syringomycin P (syrP) [16]. Đặc điểm nổi bật nhất của cụm gen Syr đó chính là sự xuất hiện của một khung đọc mở cực kì lớn (28.4kb) của gen SR-E.