Nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của virus PRRS-06 gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS 06 gây hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn, cung cấp thông tin quan trọng cho ngành chăn nuôi.

• Tác giả: Hoàng Thị Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Hữu Nam
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Danh mục các chữ viết tắt
• 1.2. Danh mục bảng
• 1.3. Danh mục hình
• 1.4. Trích yếu luận văn
• 1.5. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.6. Mục đích nghiên cứu
• 1.7. Tổng quan tài liệu
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
• 1.7.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 1.7.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 1.7.1.3. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài
• 1.7.1.4. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam
• 1.7.2. Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)
• 1.7.2.1. Hình thái, cấu tạo virus PRRS
• 1.7.2.2. Phân loại virus PRRS
• 1.7.2.3. Khả năng gây bệnh của virus PRRS
• 1.7.2.4. Sức đề kháng của virus PRRS
• 1.7.2.5. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS
• 1.7.3. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản
• 1.7.3.1. Đặc điểm chung
• 1.7.3.2. Động vật cảm nhiễm
• 1.7.3.3. Chất chứa mầm bệnh
• 1.7.3.4. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây
• 1.7.3.5. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 1.7.3.6. Bệnh tích của lợn mắc PRRS
• 1.7.3.7. Các phương pháp chẩn đoán PRRS
• 1.7.3.8. Biện pháp phòng và trị bệnh
• 1.8. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.8.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.8.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.8.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 1.8.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 1.8.1.4. Thời gian nghiên cứu
• 1.8.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.8.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.8.4. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.8.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.8.5.1. Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
• 1.8.5.2. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
• 1.8.5.3. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
• 1.8.5.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
• 1.8.5.5. Phương pháp RT-PCR
• 1.8.5.6. Phương pháp giải trình tự Gen
• 1.8.5.7. Phương pháp đọc kết quả
• 1.9. Kết quả và thảo luận
• 1.9.1. Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu
• 1.9.2. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu
• 1.9.3. Kết quả kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác
• 1.9.4. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.9.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
• 1.9.6. Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.9.7. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.9.8. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.9.9. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06
• 1.9.10. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển
• 1.9.11. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển
• 1.9.12. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
• 1.10. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PRRS 06 và ảnh hưởng đến lợn

Virus PRRS-06, một trong những chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn, đã gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn. Virus này thuộc họ Arteriviridae và có khả năng gây bệnh cao, ảnh hưởng đến cả sức khỏe hô hấp và sinh sản của lợn. Nghiên cứu về virus PRRS-06 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của virus mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PRRS 06

Virus PRRS-06 có cấu trúc gen RNA, với khả năng gây bệnh cao và dễ dàng lây lan trong đàn lợn. Nghiên cứu cho thấy virus này có thể tồn tại lâu trong môi trường và có khả năng đột biến cao, tạo ra nhiều chủng khác nhau. Điều này làm cho việc kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn.

1.2. Tác động của virus PRRS 06 đến sức khỏe lợn

Virus PRRS-06 gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng ở lợn, bao gồm khó thở, sảy thai ở lợn nái, và giảm chất lượng tinh dịch ở lợn đực. Những tác động này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của lợn mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát virus PRRS 06

Việc kiểm soát virus PRRS-06 gặp nhiều thách thức do tính chất lây lan nhanh chóng và khả năng đột biến của virus. Các biện pháp phòng ngừa hiện tại chưa đủ hiệu quả để ngăn chặn sự bùng phát của dịch bệnh. Điều này đòi hỏi cần có những nghiên cứu sâu hơn để phát triển các phương pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán virus PRRS 06

Chẩn đoán virus PRRS-06 gặp khó khăn do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Việc phát hiện sớm virus là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan trong đàn lợn.

2.2. Tình hình dịch bệnh PRRS 06 tại Việt Nam

Tình hình dịch bệnh PRRS-06 tại Việt Nam diễn biến phức tạp, với nhiều đợt bùng phát xảy ra ở các tỉnh thành. Việc thiếu hụt vaccine hiệu quả và phương pháp phòng ngừa chưa đồng bộ đã làm gia tăng nguy cơ lây lan của virus.

III. Phương pháp nghiên cứu virus PRRS 06 hiệu quả

Nghiên cứu virus PRRS-06 cần áp dụng các phương pháp hiện đại để đánh giá đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus. Các phương pháp như nuôi cấy tế bào, RT-PCR và giải trình tự gen sẽ giúp xác định sự biến đổi của virus qua các đời cấy chuyển.

3.1. Nuôi cấy virus PRRS 06 trên môi trường tế bào

Việc nuôi cấy virus PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145 cho phép nghiên cứu sự phát triển và khả năng gây bệnh của virus. Phương pháp này giúp xác định hiệu giá virus và theo dõi sự biến đổi của virus qua các đời cấy chuyển.

3.2. Phân tích gen và đặc tính sinh học phân tử

Phân tích gen của virus PRRS-06 thông qua phương pháp RT-PCR và giải trình tự gen giúp xác định trình tự nucleotide và axit amin. Điều này cung cấp thông tin quan trọng về sự ổn định và khả năng đột biến của virus.

IV. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu virus PRRS 06

Kết quả nghiên cứu về virus PRRS-06 có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Việc hiểu rõ đặc tính sinh học của virus sẽ giúp người chăn nuôi có những biện pháp phòng ngừa kịp thời và hiệu quả hơn.

4.1. Phát triển vaccine từ chủng virus PRRS 06

Nghiên cứu về virus PRRS-06 sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển vaccine mới, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho đàn lợn và giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh.

4.2. Biện pháp phòng ngừa hiệu quả cho đàn lợn

Các biện pháp phòng ngừa như vệ sinh chuồng trại, kiểm soát nguồn giống và tiêm vaccine định kỳ sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ lây lan virus PRRS-06 trong đàn lợn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu virus PRRS 06

Nghiên cứu virus PRRS-06 là cần thiết để hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus. Điều này không chỉ giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả mà còn góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Tương lai của nghiên cứu này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus PRRS 06

Nghiên cứu virus PRRS-06 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe đàn lợn và đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc phát triển vaccine hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Hướng nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các chủng vaccine mới và cải thiện các biện pháp phòng ngừa để đối phó với sự biến đổi của virus PRRS-06.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), hay còn gọi là bệnh "Tai xanh", là một trong những hiểm họa truyền nhiễm hàng đầu đe dọa trực tiếp đến an ninh chăn nuôi toàn cầu và Việt Nam. Thống kê dịch tễ trong giai đoạn 2007 - 2010 cho thấy tính chất tàn phá khốc liệt của virus PRRS (PRRSV): năm 2007 dịch bùng phát tại 21 tỉnh thành làm 88.945 con lợn mắc bệnh và 19.322 con bị tiêu hủy; năm 2008 dịch lan rộng ra 28 tỉnh khiến 298.095 con mắc bệnh và 286.000 con chết hoặc tiêu hủy; đỉnh điểm năm 2010 có tới hơn 621.000 con nhiễm bệnh và 336.000 con bị tiêu hủy trên cả nước. Thách thức lớn nhất trong việc kiểm soát dịch bệnh bắt nguồn từ đặc tính biến dị di truyền nhanh của virus RNA, tạo ra nhiều biến chủng có độc lực cao làm giảm hiệu lực bảo hộ chéo của các loại vaccine ngoại nhập.

Đứng trước thực tiễn đó, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Hoàng Thị Thảo tập trung giải quyết vấn đề cốt lõi: Đánh giá sự ổn định về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển liên tục trên môi trường tế bào Marc-145. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016, sử dụng chủng virus phân lập từ ổ dịch thực địa tại Hải Phòng năm 2015. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi chứng minh chủng KTY-PRRS-06 đạt hiệu giá nhân lên cao tới 10^4,56 TCID50/25µl và duy trì độ tương đồng nucleotide đoạn gen kháng nguyên ORF5 từ 98,15% đến 100%, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc tuyển chọn giống virus phục vụ sản xuất vaccine thế hệ mới tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học thú y và sinh học phân tử hiện đại:

• Hệ thống phân loại và cấu trúc PRRSV: Virus PRRS thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus. Hệ gen là chuỗi RNA đơn dương kích thước xấp xỉ 13 - 15 kb, chứa 7 khung đọc mở (ORF1 đến ORF7). Virus có tính hướng tế bào đặc hiệu cao, đích tấn công chủ yếu là các đại thực bào phế nang lợn (Pulmonary Alveolar Macrophage - PAM), làm phá hủy tới 40% tế bào miễn dịch này và gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng.
• Vai trò của khung đọc mở ORF5 và Glycoprotein GP5: Đoạn gen ORF5 có kích thước 603 base pair (bp), mã hóa cho protein màng bọc GP5 gồm 200 axit amin với khối lượng phân tử 25 kDa. GP5 là kháng nguyên bề mặt quan trọng nhất, mang các epitop trung hòa chủ yếu kích thích cơ thể sinh kháng thể, đồng thời là vùng gen biến đổi di truyền mạnh nhất thường được dùng để phân tích dịch tễ học phân tử.
• Hiệu ứng gây bệnh tích tế bào (CPE) và chỉ số TCID50: Sự nhân lên của virus trong tế bào nuôi cấy được định lượng thông qua hiệu ứng bệnh tích tế bào (Cytopathic Effect - CPE) và liều gây nhiễm 50% môi trường nuôi cấy mô (TCID50), cho phép xác định động lực học tăng trưởng của virus qua các đời cấy chuyển.
• Hệ thống tế bào nuôi cấy liên tục: Dòng tế bào biểu mô thận khỉ Marc-145 được ứng dụng làm mô hình chuẩn để nhân dòng, làm giảm độc lực và duy trì các chủng PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ độc lực cao.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu nghiên cứu: Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ 35 con lợn nghi mắc bệnh tại ổ dịch tự nhiên ở Hải Phòng (năm 2015), phân bổ qua các nhóm: 11 lợn con theo mẹ, 8 lợn sau cai sữa, 7 lợn choai, 4 nái mang thai và 5 nái nuôi con. Phương pháp chọn mẫu chủ đích dựa trên các triệu chứng lâm sàng điển hình (sốt cao, tím tái vùng tai và bẹn, viêm phổi kẽ, sảy thai hoặc mất sữa) nhằm tối ưu hóa tỷ lệ phân lập thành công chủng virus cường độc.
• Kiểm định loại trừ tạp nhiễm: 100% mẫu phân lập được kiểm tra bằng RT-PCR để loại trừ hoàn toàn sự có mặt của 4 tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác trên lợn: Dịch tả lợn cổ điển (CSFV), Lở mồm long móng (FMDV), Tiêu chảy cấp tính (PEDV) và Viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV).
• Nuôi cấy và cấy chuyển virus: Chủng KTY-PRRS-06 được cấy chuyển liên tục qua 40 đời (P0 đến P40) trên tế bào Marc-145 với bội số lây nhiễm MOI = 0,01 trong môi trường DMEM bổ sung 5 - 10% huyết thanh thai bò (FBS). Hiệu giá TCID50 được tính toán theo phương pháp Behrens-Karber và Reed-Muench.
• Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kít QIAamp Viral RNA (Qiagen), thực hiện phản ứng One-step RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại trọn vẹn đoạn gen ORF5 (603 bp). Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự gen tự động trên hệ thống máy Beckman Coulter CEQ 8000. Dữ liệu trình tự được đối chiếu bằng công cụ BLAST trên GenBank và xây dựng cây phát sinh loài qua phần mềm MEGA5 theo phương pháp Neighbor-Joining.
• Khung thời gian nghiên cứu: Toàn bộ các chu trình thực nghiệm, từ phân lập mẫu, nuôi cấy 40 thế hệ tế bào đến phân tích tin sinh học, được thực hiện trong 10 tháng liên tục (09/2015 - 06/2016).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ phân lập virus và xác định tác nhân đơn nhiễm: Từ 35 mẫu lợn nghi nhiễm, phương pháp RT-PCR đã xác định được 28 mẫu dương tính với PRRSV, đạt tỷ lệ 80,00%. Trong đó, nhóm lợn nái mang thai đạt tỷ lệ dương tính 100% (4/4 con) và lợn choai đạt 85,72% (6/7 con). Mẫu phân lập từ phổi lợn nái mang ký hiệu KTY-PRRS-06 có hiệu giá ban đầu đạt 10^2,66 TCID50/25µl, kiểm định hoàn toàn âm tính với CSFV, FMDV, PEDV và TGEV.
2. Tiến trình bệnh tích tế bào (CPE) ổn định: Khi gây nhiễm trên tế bào Marc-145 ở các đời đại diện (P1, P10, P20, P30, P40), bệnh tích tế bào tiến triển rất nhanh và đồng nhất: sau 24 giờ đạt 15 - 25% diện tích đáy bình; sau 36 giờ đạt 40 - 55%; sau 48 giờ đạt 60 - 70%; sau 60 giờ đạt 85 - 90%; đến 72 giờ đạt 100% tế bào bị phá hủy hoàn toàn và bong tróc đáy bình tại mốc 84 giờ.
3. Động lực học nhân lên và điểm cực đại hiệu giá: Đường cong sinh trưởng của chủng KTY-PRRS-06 cho thấy hiệu giá virus tăng vọt từ 10^2,23 TCID50/25µl ở 24 giờ lên mức đỉnh 10^4,56 TCID50/25µl ở thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm. Sau 72 giờ, hiệu giá suy giảm nhanh xuống 10^2,58 ở 84 giờ và chỉ còn 10^1,63 ở 120 giờ. Hiệu giá qua các đời cấy chuyển tăng dần và duy trì rất ổn định: từ 10^2,66 (P0) lên 10^2,87 (P10, P20) và đạt 10^3,16 (P30, P40).
4. Độ ổn định di truyền cao của gen kháng nguyên ORF5: Đoạn gen ORF5 kích thước 603 bp mã hóa 200 axit amin của protein GP5 cho thấy mức độ tương đồng nucleotide giữa các đời cấy chuyển dao động từ 98,15% đến 100%, và tương đồng axit amin từ 96,88% đến 100%. Phân tích cây phát sinh loài khẳng định chủng KTY-PRRS-06 thuộc dòng Bắc Mỹ (Type 2) biến thể độc lực cao, có mối liên hệ phả hệ gần gũi với các chủng lưu hành tại Trung Quốc và Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Diễn biến bệnh tích tế bào đạt 100% ở mốc 72 giờ phản ánh độc lực mạnh mẽ của chủng KTY-PRRS-06. Sự sụt giảm hiệu giá sau 72 giờ được giải thích do toàn bộ giá thể tế bào Marc-145 đã bị ly giải hoàn toàn, khiến virus mất nguồn năng lượng và bộ máy sinh tổng hợp tế bào chủ để tiếp tục nhân lên, dẫn tới hiện tượng bất hoạt tự nhiên của các hạt virion trong môi trường nuôi cấy.

So sánh với các công bố khác, thời gian đạt đỉnh hiệu giá (72 giờ) của KTY-PRRS-06 ngắn hơn so với chủng nhược độc Hanvet1.VN vốn cần từ 80 đến 96 giờ (theo nghiên cứu năm 2015 của Nguyễn Thu Trang), nhưng tương đồng hoàn toàn với các nghiên cứu trên các chủng PRRS cường độc miền Bắc đạt cực đại ở 72 giờ với hiệu giá 10^4,83 (Nguyễn Thị Lan và cs., 2012). Dữ liệu này chứng minh chủng thực địa KTY-PRRS-06 có khả năng thích ứng tuyệt vời trên dòng tế bào Marc-145 mà không làm suy giảm tốc độ tăng trưởng qua 40 đời cấy chuyển.

Về mặt sinh học phân tử, sự bảo tồn của khung đọc mở ORF5 với độ tương đồng trên 98% qua 40 thế hệ khẳng định môi trường nuôi cấy in-vitro không gây ra các đột biến đảo khung hay biến đổi cấu trúc kháng nguyên GP5 thiết yếu. Các kết quả định lượng này được trình bày trực quan qua đồ thị đường cong sinh trưởng logarit bậc 10 kết hợp với ma trận căn chỉnh đa trình tự nucleotide, tạo bằng chứng tin cậy về tính đồng nhất di truyền của chủng giống.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa ngân hàng giống virus gốc (Master Seed Lot): Các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y cần phối hợp với Học viện Nông nghiệp Việt Nam thiết lập quy trình bảo quản chủng KTY-PRRS-06 ở mức -86°C trong thời hạn 6 tháng tới, duy trì hiệu giá chuẩn tối thiểu 10^3,50 TCID50/ml để làm nguồn giống gốc ổn định.
2. Tiến hành lộ trình làm suy giảm độc lực để tạo vaccine: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học thú y cần tiếp tục thực hiện cấy chuyển chủng KTY-PRRS-06 từ đời P41 đến đời P85 - P100 trong giai đoạn 2026 - 2028, nhằm sàng lọc các đột biến làm giảm độc lực hoàn toàn trên lợn mục tiêu nhưng vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch bảo hộ trên 85%.
3. Cải tiến quy trình giám sát dịch tễ phân tử diện rộng: Cục Thú y và các Chi cục Chăn nuôi Thú y địa phương cần áp dụng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ORF5 (603 bp) định kỳ 6 tháng/lần tại các vùng chăn nuôi trọng điểm, nhằm kịp thời phát hiện các biến đổi kháng nguyên vượt ngưỡng 5% so với các chủng vaccine hiện hành.
4. Thắt chặt quy trình an toàn sinh học cấp độ trang trại: Các chủ trang trại chăn nuôi quy mô từ 300 lợn nái trở lên cần duy trì thời gian cách ly lợn hậu bị nhập mới tối thiểu 28 ngày, xét nghiệm huyết thanh học và áp dụng lịch tiêm phòng vaccine đồng bộ để hạ thấp tỷ lệ lưu hành virus trong đàn xuống dưới 5%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y - Công nghệ Sinh học: Nắm vững quy trình chuẩn từ phân lập virus, kỹ thuật nuôi cấy tế bào một lớp Marc-145, tính toán TCID50 theo phương pháp Behrens-Karber cho đến phân tích phả hệ phân tử bằng MEGA5.
2. Doanh nghiệp sản xuất vaccine và chế phẩm sinh học: Sử dụng các thông số động lực học nhân lên (thời điểm thu hoạch tối ưu 72 giờ, nồng độ MOI = 0,01) để tối ưu hóa quy trình lên men sinh học quy mô công nghiệp và kiểm soát chất lượng giống gốc.
3. Bác sĩ thú y và kỹ sư chăn nuôi tại trang trại: Hiểu rõ bức tranh lâm sàng phức tạp (sảy thai 93,75% ở thai kỳ cuối, viêm dịch hoàn 95% ở đực giống) và cơ chế phá hủy đại thực bào PAM để xây dựng phác đồ điều trị hỗ trợ và ngăn chặn bội nhiễm vi khuẩn kế phát hiệu quả.
4. Cơ quan quản lý dịch tễ và kiểm dịch động vật: Khai thác dữ liệu phân tích trình tự ORF5 để đánh giá mức độ tương đồng di truyền của các biến thể virus đang lưu hành, hỗ trợ ra quyết định cấp phép và lựa chọn chủng vaccine phòng dịch quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng virus KTY-PRRS-06 có nguồn gốc từ đâu và thuộc nhóm di truyền nào?
Chủng KTY-PRRS-06 được phân lập từ mẫu phổi của lợn nái mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại ổ dịch Hải Phòng năm 2015. Kết quả phân tích phả hệ đoạn gen ORF5 xác định chủng này thuộc dòng Bắc Mỹ (Type 2), có độc lực cao và mang mối quan hệ di truyền rất gần với các chủng PRRSV gây dịch biến thể tại Việt Nam và Trung Quốc.

2. Vì sao thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm lại là mốc thu hoạch virus tối ưu nhất?
Theo kết quả theo dõi động lực học sinh trưởng lặp lại 3 lần, hiệu giá virus đạt đỉnh cực đại ở mức 10^4,56 TCID50/25µl đúng vào 72 giờ sau khi gây nhiễm, tương ứng lúc 100% tế bào Marc-145 bị phá hủy. Thu hoạch sau mốc 72 giờ sẽ khiến hiệu giá sụt giảm mạnh (chỉ còn 10^1,63 ở 120 giờ) do hạt virus bị thoái hóa trong môi trường.

3. Khung đọc mở ORF5 đóng vai trò gì trong việc đánh giá sự biến đổi của virus PRRS?
Gen ORF5 có chiều dài 603 bp mã hóa cho protein màng GP5 gồm 200 axit amin. Đây là vùng gen quy định tính kháng nguyên trung hòa chủ yếu của PRRSV nhưng lại có tần số đột biến cao nhất trong hệ gen. Do đó, theo dõi trình tự ORF5 là tiêu chuẩn vàng để xác định sự ổn định di truyền và quan hệ phả hệ của virus.

4. Nuôi cấy PRRSV trên dòng tế bào Marc-145 có ưu điểm gì so với đại thực bào PAM?
Mặc dù tế bào PAM tự nhiên có độ nhạy cao nhưng khó thu thập ổn định và không thể nhân dòng lâu dài. Ngược lại, tế bào Marc-145 là dòng tế bào liên tục, cho phép cấy chuyển ổn định qua 40 đời, khả năng gây bệnh tích tế bào rõ rệt và đảm bảo tính đồng nhất phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử cũng như sản xuất vaccine quy mô lớn.

5. Mức độ ổn định di truyền của chủng KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển được thể hiện như thế nào?
Qua 40 thế hệ cấy chuyển liên tục từ đời P1 đến P40, đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 duy trì độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100% và axit amin từ 96,88% đến 100%. Hiệu giá virus duy trì ổn định ở mức 10^2,66 - 10^3,16 TCID50/25µl, chứng minh chủng virus không bị biến đổi cấu trúc kháng nguyên cốt lõi trong điều kiện nuôi cấy in-vitro.

Kết luận

• Chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 được phân lập thành công từ ổ dịch thực địa tại Hải Phòng năm 2015, kiểm định đơn nhiễm 100% không chứa tạp nhiễm CSFV, FMDV, PEDV và TGEV.
• Động lực học nhân lên trên tế bào Marc-145 đạt đỉnh cực đại ở mốc 72 giờ sau gây nhiễm với hiệu giá 10^4,56 TCID50/25µl, xác lập thời điểm thu hoạch tối ưu cho các quy trình nuôi cấy sinh học.
• Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và hiệu giá virus thể hiện tính ổn định cao qua 40 đời cấy chuyển liên tục, với hiệu giá đạt 10^3,16 TCID50/25µl ở đời P40.
• Đoạn gen kháng nguyên bề mặt ORF5 (603 bp/200 axit amin) duy trì độ tương đồng nucleotide đạt từ 98,15% đến 100% và axit amin từ 96,88% đến 100% qua 40 thế hệ.
• Luận văn đóng góp nguồn dữ liệu khoa học chuẩn xác và khẳng định tiềm năng ứng dụng của chủng KTY-PRRS-06 làm ứng viên sáng giá để nghiên cứu làm suy giảm độc lực chế tạo vaccine PRRS nội địa.

Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2026 - 2028, các đơn vị nghiên cứu cần đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ, tiếp tục thử nghiệm cấy chuyển đến đời P85 nhằm hoàn thiện dòng vaccine nhược độc an toàn. Các nhà khoa học và doanh nghiệp hãy kết nối ngay với nhóm nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam để khai thác nguồn chủng giống và thúc đẩy các giải pháp bảo vệ đàn lợn bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ THẢO NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC KTY-PRRS-06 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN Ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học : PGS. Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các Thầy, Cô giáo - những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong thời gian tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. Nguyễn Hữu Nam, người hướng dẫn khoa học, về sự giúp đỡ nhiệt tình và có trách nhiệm đối với tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Lời cảm ơn của tôi cũng xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh, chị, em phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y nơi tôi thực hiện đề tài đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thảo ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục bảng .viii Danh mục hình.

ix Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích nghiên cứu. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Tình hình dịch PRRS trên thế giới. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài.

Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam. Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV). Hình thái, cấu tạo virus PRRS. Phân loại virus PRRS.

Khả năng gây bệnh của virus PRRS. Sức đề kháng của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.

Đặc điểm chung. Động vật cảm nhiễm. Chất chứa mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây.

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS. 15 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Bệnh tích của lợn mắc PRRS. Các phương pháp chẩn đoán PRRS.

Biện pháp phòng và trị bệnh. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY- PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145. Phương pháp nghiên cứu. Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145.

Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS. Phương pháp RT- PCR.

Phương pháp giải trình tự Gen. Phương pháp đọc kết quả. Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu chủng virus prrs nghiên cứu.

Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu. Kết quả kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY- PRRS-06. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển.

Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06. 36 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06.

Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử.

Kết luận và kiến nghị. 52 Tài liệu tham khảo. 53 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ BED Blue Ear disease BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair CNSH Công nghệ sinh học CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecco,s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxynucleotide Acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat EAV Equine Arteritis virus EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acide ELISA Enzyme Linked Immunosortbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum GP Glycoprotein IFA Indirect Immunofluoresence Assay kDa Kilodalton LDHV Lactate Dehydlogenase – elevating virus Log Logarit (cơ số 10) MEGA5 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10 MOI Multiplicity Of Infection mRNA Acid Ribonucleic thông tin vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MSD Mistery Swine Disease OIE Tổ chức thú y thế giới ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PAM Pulmnary Alveolar Macrophage PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PEARS Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA Ribonucleic Acid RT- PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SHFV Simian Hemorrhaghic Fever Virus TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 VNT Virus Neutralization Test vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Protein cấu trúc của PRRSV.

Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR. Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR. Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR.

Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được. Kết quả chẩn đoán RT- PCR các lợn nghi mắc PRRS. Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu. Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, FED, TGE.

Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY- PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 tại thời điểm thu hoạch. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng KTY-PRRS-06.

So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY-PRRS-06. So sánh sự tương đồng về axit amin của virus KTY-PRRS-06 ở các đời cấy chuyển. 49 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới. Cấu trúc hạt của PRRS virus. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào.

Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm.

Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm. Đường cong sinh trưởng của virus KTY-PRRS-06. Log10 hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số.

Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 ở đời cấy chuyển thứ 10. So sánh trình tự nucleotide của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển. So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.

Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06. 51 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Thảo Tên luận văn: “ Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá được sự ổn định một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng các phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT- PCR; phương pháp giải trình tự Gen. Kết quả chính và kết luận 1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06: Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145.

Chủng virus PRRS có hiệu giá cao và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145. Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm. Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06: Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục. Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virus KTY-PRRS-06 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein kháng nguyên GP5.

Trình tự nucleotide và axit amin của trong đoạn gen ORF5 của chủng nghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độ tương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%. x LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Thao Thesis title: "Research biology and molecular biology of the virulent strain KTY- PRRS-06 cause Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome".