Nghiên cứu vai trò của nhóm gen mã hóa deubiquitinase và một số tín hiệu phân tử trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn

Nghiên cứu vai trò của nhóm gen deubiquitinase và tín hiệu phân tử trong bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế bệnh.

• Tác giả: NCS. Đỗ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Xuân
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Vai Trò Của Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase Trong Bệnh Tăng Hồng Cầu Vô Căn
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 1.2. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.1. Khái niệm và đặc điểm sinh học của tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.2. Chức năng của tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 1.2.3. Các marker sinh học liên quan đến quá trình apoptosis
• 1.2.4. Một số gen kiểm soát miễn dịch
• 1.2.5. Một số cytokine sử dụng trong nghiên cứu
• 1.2.6. Nghiên cứu sử dụng tế bào đơn nhân máu ngoại vi trên bệnh THCVC
• 1.3. Một số gen thuộc nhóm deubiquitinase và mối liên hệ với các tín hiệu phân tử
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng và tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
• 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.4. Hóa chất sử dụng
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Xét nghiệm sinh hóa máu
• 2.5.2. Tách huyết tương
• 2.5.3. Tách chiết DNA và RNA
• 2.5.4. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger và phân tích dữ liệu
• 2.5.5. Tổng hợp cDNA
• 2.5.6. Real-Time PCR
• 2.5.7. Một số phương pháp tin sinh sử dụng trong luận án
• 2.5.8. Đưa siRNA vào trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 2.5.9. Phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 2.5.10. Đếm tế bào theo dòng chảy
• 2.5.11. Xác định sự di cư tế bào
• 2.5.12. ELISA phân tích nồng độ cytokine
• 2.5.13. Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.1. Chỉ số sinh hóa máu bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.2. Phân tích sự biểu hiện một số gen deubiquitinase trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.3. Mức độ biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.4. Biểu hiện một số gen kiểm soát miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.5. Phân tích đột biến gen JAK2 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.6. Phân tích đột biến gen CYLD trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.7. Phân tích đột biến gen A20 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.8. Phân tích đột biến gen Cezanne trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.9. Kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.1.10. Sự tiết cytokine và kháng nguyên ung thư ở bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 3.2. Kết quả nghiên cứu trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.2. A20 điều hòa kiểu hình miễn dịch tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.3. A20 điều hòa sự tiết cytokine
• 3.2.4. A20 điều hòa sự di cư tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.5. Protein A20 điều hòa quá trình apoptosis tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.6. Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 3.2.7. Otubain-1 điều hòa các sản phẩm cytokine
• 3.2.8. Otubain-1 điều hòa tín hiệu trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 4. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN
• 4.1. Đa hình và biểu hiện gen deubiquitinase, gen JAK2 và kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn
• 4.2. Biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn
• 4.3. Vai trò gen A20 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 4.4. Vai trò gen Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục tài liệu

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vai Trò Của Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Bệnh tăng hồng cầu vô căn (THCVC) là một trong những bệnh lý nghiêm trọng liên quan đến sự tăng sinh bất thường của tế bào máu. Nhóm gen mã hóa deubiquitinase (DUB) như A20, Otubain-1, CYLD và Cezanne đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh học của tế bào. Nghiên cứu này nhằm làm rõ vai trò của nhóm gen DUB trong bệnh THCVC, từ đó mở ra hướng đi mới trong điều trị.

1.1. Khái Niệm Về Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Nhóm gen mã hóa deubiquitinase (DUB) có chức năng chính là khử chuỗi polyubiquitin từ protein, từ đó điều hòa hoạt động của chúng. Các gen như A20 và CYLD không chỉ tham gia vào quá trình khử mà còn ảnh hưởng đến sự phát triển của khối u và điều hòa miễn dịch.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Deubiquitinase Trong Bệnh Tăng Hồng Cầu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biểu hiện bất thường của các gen DUB có thể dẫn đến sự gia tăng tế bào hồng cầu trong bệnh THCVC. Điều này cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa gen DUB và sự phát triển của bệnh lý này.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Bệnh Tăng Hồng Cầu Vô Căn

Bệnh THCVC vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh. Sự phức tạp trong biểu hiện gen và các tín hiệu phân tử liên quan đến bệnh lý này làm cho việc nghiên cứu trở nên khó khăn. Cần có những phương pháp nghiên cứu mới để làm rõ hơn về vai trò của nhóm gen DUB.

2.1. Những Khó Khăn Trong Việc Xác Định Nguyên Nhân Bệnh

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về bệnh THCVC, nhưng nguyên nhân chính xác vẫn chưa được xác định. Sự đa dạng trong biểu hiện gen và các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh.

2.2. Thách Thức Trong Việc Điều Trị Bệnh Tăng Hồng Cầu

Việc điều trị bệnh THCVC gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp trong cơ chế bệnh sinh. Các phương pháp điều trị hiện tại chưa đạt hiệu quả cao, cần có những nghiên cứu sâu hơn về gen DUB để tìm ra giải pháp hiệu quả.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Vai Trò Của Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại như real-time PCR và phân tích di truyền để xác định mức độ biểu hiện của các gen DUB trong bệnh nhân THCVC. Các mẫu tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được thu thập và phân tích để làm rõ vai trò của nhóm gen này.

3.1. Phương Pháp Thu Thập Mẫu Và Phân Tích Gen

Mẫu PBMC được thu thập từ bệnh nhân THCVC và người khỏe mạnh. Sử dụng phương pháp real-time PCR để xác định mức độ biểu hiện của các gen DUB và các gen tín hiệu liên quan.

3.2. Phân Tích Di Truyền Của Gen DUB

Phân tích di truyền được thực hiện để xác định các đa hình gen trong nhóm gen DUB. Điều này giúp làm rõ mối liên hệ giữa các biến thể gen và sự phát triển của bệnh THCVC.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh nhân THCVC có sự biểu hiện bất thường của các gen DUB như A20 và CYLD. Nồng độ cytokine như IL-6 và TNF-α cũng tăng cao, cho thấy mối liên hệ giữa gen DUB và tình trạng viêm trong bệnh lý này.

4.1. Biểu Hiện Gen DUB Ở Bệnh Nhân THCVC

Nghiên cứu chỉ ra rằng các gen DUB như A20 và CYLD có biểu hiện thấp hơn so với người khỏe mạnh. Điều này có thể dẫn đến sự gia tăng tế bào hồng cầu và tình trạng viêm trong bệnh THCVC.

4.2. Tác Động Của Cytokine Trong Bệnh Tăng Hồng Cầu

Nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α tăng cao ở bệnh nhân THCVC cho thấy sự tham gia của các gen DUB trong quá trình viêm và phát triển bệnh. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong điều trị bệnh.

V. Kết Luận Về Vai Trò Của Nhóm Gen Mã Hóa Deubiquitinase

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm gen mã hóa deubiquitinase có vai trò quan trọng trong bệnh tăng hồng cầu vô căn. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của các gen này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Gen DUB

Nghiên cứu về nhóm gen DUB cần được tiếp tục để làm rõ hơn về vai trò của chúng trong bệnh lý. Điều này có thể dẫn đến những phát hiện mới trong điều trị bệnh THCVC và các bệnh máu ác tính khác.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân THCVC và giảm thiểu các biến chứng liên quan.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tăng hồng cầu vô căn (Polycythemia vera - THCVC) là bệnh lý ác tính thuộc nhóm tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasms - MPNs) không mang nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph- âm tính), đặc trưng bởi sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào dòng tủy trong tủy xương, dẫn đến gia tăng số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu trong máu ngoại vi. Lượng hồng cầu tăng cao làm tăng độ nhớt của máu, giảm tốc độ tuần hoàn và gia tăng nguy cơ biến cố tắc mạch, huyết khối. Về mặt di truyền học phân tử, đột biến điểm soma V617F trên exon 14 của gen JAK2 (rs77375493) làm tăng hoạt tính phosphoryl hóa của kinase JAK2 được xác định là nguyên nhân chính, xuất hiện ở trên 90% số ca THCVC. Tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh phân tử đầy đủ của THCVC vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, đặc biệt là vai trò của các gen điều hòa sau dịch mã và biến đổi miễn dịch tế bào.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là sự thiếu hụt các dữ liệu thực nghiệm về mức độ biểu hiện và các biến thể di truyền của nhóm gen mã hóa deubiquitinase (DUB) — bao gồm A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1, Otubain-2 — cũng như mối liên hệ giữa các enzyme khử ubiquitin này với các con đường truyền tín hiệu nội bào (STAT, SHP, IκB-α), các điểm kiểm soát miễn dịch (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1) và chức năng của tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) trên bệnh nhân THCVC tại Việt Nam.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định vai trò của gen A20 và gen Otubain-1 trong việc điều hòa chức năng sinh học của tế bào PBMC bao gồm sự thuần thục, sự biệt hóa, tiết cytokine, di cư và sự chết apoptosis.
2. Xác định mức độ biểu hiện mRNA và đa hình của một số gen mã hóa deubiquitinase, gen tín hiệu liên quan và kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân THCVC so với người khỏe mạnh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Nghiên cứu được thực hiện trên 77 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh THCVC và 55 mẫu đối chứng từ người tình nguyện hiến máu khỏe mạnh. Ngoài ra, tế bào PBMC phân lập từ 150 ml máu của người hiến khỏe mạnh được sử dụng cho các thử nghiệm can thiệp gen chức năng in vitro.
• Phạm vi không gian và thời gian: Các nghiên cứu thực nghiệm di truyền, tế bào và miễn dịch được thực hiện tại Viện Nghiên cứu hệ gen và Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh THCVC, miễn dịch tế bào máu và sinh học phân tử của nhóm enzyme deubiquitinase:

• Phân loại và bệnh sinh THCVC: Bệnh được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp vào nhóm 6 bệnh tăng sinh tủy ác tính, cùng với tăng tiểu cầu tiền phát (ET), xơ tủy nguyên phát (PM), bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML), bạch cầu mạn dòng bạch cầu trung tính (CNL) và bạch cầu mạn dòng bạch cầu ái toan. Nghiên cứu của Bench và cộng sự (2003) thiết lập vai trò chỉ thị của đột biến JAK2 V617F trong chẩn đoán sớm THCVC. Các nghiên cứu tiếp theo xác định thêm đột biến trên exon 12 của JAK2 (chiếm 2-3% ca bệnh không mang V617F) và đột biến trên gen CALR ở exon 9 (Misa Imai và cộng sự, 2013). Tại Việt Nam, hướng dẫn chẩn đoán của Bộ Y tế theo Quyết định số 1494/QĐ-BYT (2015) và Quyết định số 1832/QĐ-BYT (2022) đều quy định tiêu chuẩn xác định đột biến JAK2 V617F hoặc JAK2 exon 12; các khảo sát dịch tễ huyết học như nghiên cứu trên 30 bệnh nhân THCVC nguyên phát (Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 2013) đã mô tả đặc điểm lâm sàng và tỷ lệ đột biến JAK2.

• Kiểu hình miễn dịch và tế bào PBMC: Kornberg A. và cộng sự chứng minh bạch cầu đơn nhân ở bệnh nhân THCVC tăng sinh yếu tố mô (TF) gấp 21 lần sau kích thích endotoxin, liên quan đến nguy cơ huyết khối. Các nghiên cứu về điểm kiểm soát miễn dịch như phát hiện của Kuro-o và cộng sự (1997) về gen chống lão hóa Klotho, Triebel và cộng sự (1990) về LAG3, cùng các công trình về PD1 và CTLA4 chỉ ra vai trò của các phân tử này trong việc duy trì dung nạp miễn dịch và điều hòa phản ứng của tế bào lympho T.

• Nhóm enzyme Deubiquitinase (DUB) và các tín hiệu phân tử:

  • Gen A20 (TNFAIP3): Hoạt động như enzyme chỉnh sửa ubiquitin kép (chứa miền OTU khử ubiquitin liên kết K63 và miền ngón tay kẽm ZnF ligase), ức chế hoạt hóa NF-κB và STAT1 (Nguyễn Thị Xuân và cộng sự). Nghiên cứu của Masahiro Marshall Nakagawa và cộng sự chứng minh thiếu hụt A20 trong tế bào gốc tạo máu (HSC) dẫn đến tăng sinh tủy và tự viêm.
  • Gen CYLD: Là DUB thuộc họ USP đặc hiệu khử chuỗi polyubiquitin K63 và M1, ức chế tín hiệu NF-κB, JNK và Wnt/β-catenin. Melania Tesio và cộng sự (2015) chỉ ra CYLD tương tác với TRAF2 để duy trì trạng thái ngủ của HSC, ngăn chặn cạn kiệt tế bào gốc.
  • Gen Otubain-1: Được Borodovsky và cộng sự (2002) phát hiện; Durocher (2010) và Weiner và cộng sự làm rõ cơ chế ức chế kép (độc lập xúc tác và phụ thuộc enzyme liên hợp E2). Xiaofei Zhou và cộng sự (2019) chứng minh Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào T CD8 và NK; Nguyễn Thị Xuân và cộng sự chỉ ra Otubain-1 ức chế phosphoryl hóa kéo dài p38MAPK trong tế bào tua.
  • Gen Cezanne (OTUD7B): David Komander và cộng sự (2012) xác định Cezanne là DUB đầu tiên ưu tiên phân cắt liên kết polyubiquitin Lys11, đối kháng quá trình thoái hóa protein phân bào của phức hợp ligase E3 APC/C.

Vị trí của luận án: Trong khi các nghiên cứu trong nước chủ yếu dừng lại ở mô tả dịch tễ và xét nghiệm đột biến JAK2, và các nghiên cứu quốc tế chưa khảo sát đồng thời mối liên hệ giữa DUB với đáp ứng miễn dịch tế bào trên THCVC, luận án này là công trình đầu tiên phân tích có hệ thống mức độ biểu hiện và biến thể di truyền của 5 gen DUB (A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1, Otubain-2), 4 gen kiểm soát miễn dịch (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1), các chất truyền tin nội bào (STAT1, 3, 5, 6, SHP1, 2, IκB-α) trên bệnh nhân THCVC, kết hợp thực nghiệm can thiệp siRNA trên tế bào PBMC.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Luận án dựa trên lý thuyết điều hòa sau dịch mã thông qua con đường ubiquitin-proteasome và quá trình khử ubiquitin bởi các enzyme DUB trong kiểm soát tín hiệu sống sót, tăng sinh và biệt hóa tế bào tạo máu. Sự biến đổi hoạt tính hoặc đột biến của các DUB (A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1) dẫn đến rối loạn chu trình phosphoryl hóa của phức hợp IKK/IκB-α/NF-κB, con đường JAK-STAT và MAPK, làm mất cân bằng quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis), thúc đẩy các phản ứng tiền viêm mạn tính và biến đổi kiểu hình các quần thể tế bào miễn dịch ngoại vi (T-CD4+, T-CD8+, Th1, Treg, NK, B).

Phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng kết hợp các kỹ thuật sinh học phân tử, tế bào học, miễn dịch học và tin sinh học:

1. Thu thập mẫu và xử lý tế bào:

   • Thu mẫu máu toàn phần từ 77 bệnh nhân THCVC và 55 người khỏe mạnh. Phân tách huyết tương phục vụ đo hóa sinh và cytokine.
   • Phân lập PBMC bằng kỹ thuật ly tâm phân lớp theo thang tỷ trọng sử dụng dung dịch Ficoll-Paque. Nuôi cấy tế bào PBMC phục vụ thử nghiệm in vitro.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử và di truyền:

   • Tách chiết DNA tổng số bằng bộ kít thương mại và tách RNA tổng số bằng hóa chất Trizol.
   • Tổng hợp chuỗi bổ sung cDNA từ RNA bằng enzyme phiên mã ngược.
   • Kỹ thuật Real-Time PCR (định lượng biểu hiện tương đối mRNA) cho các nhóm gen DUB (A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD, Cezanne), gen kiểm soát miễn dịch (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1) và gen truyền tín hiệu (SHP-1, SHP-2, IκB-α, STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6).
   • Giải trình tự gen trực tiếp theo phương pháp Sanger (Sanger sequencing) để phát hiện và xác thực các đột biến, đa hình đơn nucleotide (SNP) trên các gen JAK2, CYLD, A20 và Cezanne.

3. Phân tích tin sinh học (Bioinformatics):

   • Đánh giá khả năng gây bệnh và ảnh hưởng của các biến thể nucleotide tại các vị trí ghép nối (splice site) bằng các thuật toán và phần mềm chuyên dụng: SD-Score và MaxEntScan; tra cứu dữ liệu hệ gen từ GeneCards.

4. Can thiệp gen in vitro bằng siRNA:

   • Chuyển nạp đoạn RNA can thiệp nhỏ (siRNA-A20 và siRNA-Otubain-1) vào tế bào PBMC nuôi cấy nhằm bất hoạt chọn lọc biểu hiện gen A20 và Otubain-1, từ đó đối chiếu với mẫu đối chứng không can thiệp.

5. Phân tích kiểu hình tế bào và miễn dịch:

   • Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry) sử dụng các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang đặc hiệu để phân tích các dấu ấn bề mặt và nội bào: CD3, CD4, CD8, CD11b, CD19, CD25, CD40, CD44, CD56, Foxp3.
   • Đánh giá apoptosis bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang sử dụng Annexin V, kháng thể kháng Caspase-3 hoạt hóa và thuốc nhuộm Propidium Iodide (PI) trên Flow cytometry.
   • Thử nghiệm đánh giá sự di cư của tế bào PBMC qua màng lọc (cell migration assay).
   • Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) để định lượng nồng độ các cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70) và dấu ấn ung thư CA125 trong huyết thanh và dịch nổi nuôi cấy.

6. Đạo đức nghiên cứu y sinh:

   • Đề tài được thông qua bởi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh, bảo đảm tính tự nguyện và bảo mật thông tin của các đối tượng tham gia.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở dữ liệu lý thuyết và thực nghiệm về:

• Đặc điểm lâm sàng, huyết học và cơ chế bệnh sinh của THCVC; vai trò của đột biến JAK2 V617F và các biến thể liên quan (JAK2 exon 12, CALR, MPL).
• Cấu trúc, quần thể thành phần và chức năng sinh học của PBMC (tế bào lympho T-CD4, T-CD8, tế bào B, tế bào NK, tế bào tua, tế bào gốc tạo máu HSC); các chất chỉ điểm apoptosis (Annexin V, Caspase-3, PI) và các thụ thể điểm kiểm soát miễn dịch (Klotho, PD-1, LAG-3, CTLA-4).
• Đặc tính cấu trúc, cơ chế tác dụng và con đường tín hiệu chịu sự điều hòa của 4 gen DUB chính (A20, Otubain-1, CYLD, Cezanne).
• Bức tranh tổng quan về tình hình nghiên cứu THCVC trong nước và quốc tế, xác định rõ nhu cầu khảo sát các gen DUB và miễn dịch tế bào.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết:

• Tiêu chuẩn lựa chọn 77 bệnh nhân THCVC và 55 mẫu chứng khỏe mạnh.
• Danh mục hóa chất, sinh phẩm, cặp mồi PCR/Real-Time PCR, siRNA và thiết bị phân tích (máy giải trình tự Sanger, hệ thống Real-Time PCR, máy đo dòng chảy Flow cytometer, máy đọc ELISA).
• Chi tiết 14 quy trình thao tác chuẩn: từ xét nghiệm sinh hóa máu, tách chiết DNA/RNA, tổng hợp cDNA, khuếch đại gen, giải trình tự Sanger, chuyển siRNA, nhuộm tế bào huỳnh quang đến xử lý số liệu tin sinh học và chuẩn mực đạo đức y sinh.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Kết quả thực nghiệm được trình bày thành hai nội dung chính:

1. Kết quả trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn

• Chỉ số sinh hóa máu: Xác định tỷ lệ bệnh nhân THCVC có các chỉ số hồng cầu, hematocrit, bạch cầu và các chỉ số sinh hóa máu tăng cao hơn so với người khỏe mạnh.
• Mức độ biểu hiện mRNA các gen DUB và miễn dịch:
  • Nhóm gen DUB: Bệnh nhân THCVC có sự suy giảm biểu hiện (bất hoạt tương đối) rõ rệt của các gen A20, CYLD và Cezanne so với nhóm chứng khỏe mạnh ($p < 0,05$).
  • Gen kiểm soát miễn dịch: Biểu hiện gen Klotho giảm mạnh ở bệnh nhân THCVC, trong khi các gen LAG3, CTLA4, PD1 có xu hướng biến đổi phản ánh tình trạng ức chế miễn dịch.
  • Gen truyền tín hiệu: Ghi nhận sự thay đổi biểu hiện của các yếu tố phiên mã họ STAT (STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6) và các phosphatase SHP-1, SHP-2.
• Phân tích đột biến và đa hình đơn nucleotide (SNP):
  • Gen JAK2: Tỷ lệ cao bệnh nhân mang đột biến JAK2 V617F.
  • Gen CYLD: Xác định được 11 SNP trên gen CYLD, trong đó phát hiện biến thể mới p.W736G nằm trên exon 15. Phân tích tin sinh học bằng phần mềm SD-Score và MaxEntScan chỉ ra SNP vùng ghép nối c.2483+6 T>G có khả năng cao gây biến đổi chức năng gắn nối exon và liên quan đến cơ chế gây bệnh. Đáng chú ý, nhóm bệnh nhân mang SNP p.W736G đồng thời mang nhiều SNP khác trên CYLD, nhưng không xuất hiện SNP trên gen A20 hay Cezanne.
  • Gen A20 và Cezanne: Xác định tần số phân bố các kiểu gen và alen của các SNP trên bệnh nhân và nhóm chứng.
• Kiểu hình miễn dịch và cytokine huyết thanh:
  • Tỷ lệ các tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg CD4+CD25+Foxp3+) trong máu tuần hoàn của bệnh nhân THCVC tăng cao có ý nghĩa thống kê so với người khỏe mạnh.
  • Phân tích ELISA ghi nhận nồng độ cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α trong huyết thanh bệnh nhân THCVC tăng cao rõ rệt; định lượng nồng độ dấu ấn CA125.

2. Kết quả can thiệp gen trên tế bào PBMC in vitro

• Vai trò của gen A20:
  • Bất hoạt gen A20 bằng siRNA dẫn đến tăng cường sự hoạt hóa của tế bào T (tăng tỷ lệ CD3+CD25+), tế bào B (tăng CD19+CD25+) và tủy bào (tăng CD11b+CD40+).
  • Làm tăng giải phóng các cytokine tiền viêm TNF-α và IL-1β vào môi trường nuôi cấy.
  • Gia tăng khả năng di chuyển (di cư) của tế bào PBMC và làm thay đổi tỷ lệ tế bào đi vào chu trình chết apoptosis.
• Vai trò của gen Otubain-1:
  • Bất hoạt gen Otubain-1 bằng siRNA dẫn đến tăng cường hoạt hóa tế bào diệt tự nhiên NK (tăng tỷ lệ CD56+CD44+).
  • Làm biến đổi nồng độ các cytokine do PBMC tiết ra.
  • Ức chế mức độ biểu hiện của các phân tử tín hiệu nội bào quan trọng bao gồm SHP-1 và STAT-6.

Chỉ số / Đối tượng phân tích	Nhóm bệnh nhân THCVC	Nhóm chứng khỏe mạnh / PBMC đối chứng	Ảnh hưởng khi bất hoạt gen in vitro (siRNA)
Biểu hiện gen DUB (A20, CYLD, Cezanne)	Giảm biểu hiện rõ rệt	Mức biểu hiện bình thường	—
Biến thể gen CYLD	Xuất hiện SNP mới p.W736G (exon 15) và c.2483+6 T>G	Không mang biến thể gây bệnh	—
Biểu hiện gen Klotho	Giảm biểu hiện rõ rệt	Biểu hiện bình thường	—
Cytokine huyết thanh (IL-6, TNF-α)	Tăng cao đáng kể	Nồng độ sinh lý bình thường	Tăng tiết TNF-α, IL-1β khi bất hoạt A20
Quần thể T hoạt hóa, Th1, Treg	Gia tăng tỷ lệ trong máu	Tỷ lệ quần thể bình thường	Tăng hoạt hóa T, B, tủy bào khi bất hoạt A20
Tế bào NK (CD56+CD44+)	Biến đổi chức năng	Tỷ lệ quần thể bình thường	Tăng hoạt hóa khi bất hoạt Otubain-1
Phân tử tín hiệu (SHP1, STAT6)	Biến đổi trong tế bào	Trạng thái bình thường	Bị ức chế biểu hiện khi bất hoạt Otubain-1

Chương 4: Thảo luận

Tác giả thảo luận các cơ chế phân tử liên kết giữa dữ liệu di truyền và miễn dịch:

• Sự suy giảm biểu hiện của các DUB (A20, CYLD, Cezanne) giải thích cho hiện tượng tăng cường phản ứng viêm mạn tính và tăng sinh tế bào ở bệnh nhân THCVC, do mất đi cơ chế ức chế ngược con đường NF-κB.
• Đa hình CYLD p.W736G và c.2483+6 T>G cung cấp bằng chứng về sự tổn thương cấu trúc gen DUB liên quan đến bệnh lý.
• Sự gia tăng tế bào Treg và Th1 trong máu ngoại vi tạo ra vi môi trường ức chế miễn dịch đối kháng, tạo điều kiện cho tế bào tủy ác tính tồn tại và phát triển.
• Các kết quả can thiệp siRNA khẳng định A20 và Otubain-1 là các phân tử kiểm soát then chốt đối với sự hoạt hóa tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích ứng.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết luận cốt lõi theo mục tiêu nghiên cứu và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Phát hiện biến thể di truyền mới: Xác định được 11 SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC, trong đó phát hiện biến thể mới p.W736G thuộc exon 15 và SNP c.2483+6 T>G được dự đoán bằng công cụ tin sinh học là có khả năng cao liên quan đến bệnh sinh THCVC. Bệnh nhân mang SNP p.W736G có nhiều SNP tích lũy trong gen CYLD nhưng không xuất hiện đồng thời trên gen A20 hay Cezanne.
2. Làm rõ đặc điểm biểu hiện gen DUB và điểm kiểm soát miễn dịch: Chứng minh bệnh nhân THCVC có sự suy giảm biểu hiện (bất hoạt) của các gen A20, CYLD, Cezanne và Klotho; đi kèm sự gia tăng nồng độ cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α trong huyết thanh.
3. Mô tả biến đổi quần thể miễn dịch tế bào: Xác định sự gia tăng có ý nghĩa thống kê của số lượng tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg) trong máu tuần hoàn bệnh nhân THCVC, chỉ ra trạng thái rối loạn đáp ứng miễn dịch của cơ thể.
4. Xác định chức năng sinh học thực nghiệm của A20 và Otubain-1:
   • Chứng minh gen A20 có vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào lympho T (CD3+CD25+), lympho B (CD19+CD25+) và tủy bào (CD11b+CD40+), đồng thời ức chế giải phóng TNF-α, IL-1β và kiểm soát sự di cư của tế bào PBMC.
   • Chứng minh gen Otubain-1 có vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (CD56+CD44+) và điều hòa ức chế biểu hiện của các phân tử tín hiệu nội bào SHP-1 và STAT-6.

Đóng góp về mặt thực tiễn và kiến nghị giải pháp

• Bổ sung cơ sở dữ liệu sinh học phân tử phục vụ công tác chẩn đoán phân tử THCVC song song với xét nghiệm JAK2 V617F truyền thống.
• Đề xuất định hướng ứng dụng các chỉ thị phân tử về deubiquitinase (CYLD, A20, Otubain-1) và các thụ thể điểm kiểm soát miễn dịch trong nghiên cứu phát triển các liệu pháp điều trị trúng đích kết hợp điều hòa miễn dịch cho bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Nghiên cứu được thực hiện trên cỡ mẫu gồm 77 bệnh nhân THCVC và 55 mẫu đối chứng khỏe mạnh; các phân tích đa hình di truyền tập trung vào các đoạn gen và exon trọng điểm thay vì giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) hay toàn bộ vùng mã hóa (WES).
• Các thử nghiệm can thiệp chức năng gen A20 và Otubain-1 mới được triển khai ở quy mô in vitro trên tế bào PBMC sơ cấp, chưa mở rộng đánh giá trên các mô hình động vật biến đổi gen in vivo để khảo sát toàn diện quá trình tạo máu dài hạn.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử chuyên sâu về cách thức biến thể CYLD p.W736G làm thay đổi hoạt tính enzyme deubiquitinase và ảnh hưởng đến tương tác với các protein liên kết (như TRAF2, NEMO).
• Nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng kết hợp giữa thuốc ức chế JAK2 với các phân tử tác động lên con đường deubiquitinase và thụ thể kiểm soát miễn dịch nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và hạn chế tái phát ở bệnh nhân THCVC.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học, Miễn dịch học và Huyết học. Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về phân lập tế bào PBMC bằng Ficoll, chuyển nạp siRNA trên tế bào sơ cấp, phân tích đa kênh Flow cytometry và đánh giá đột biến bằng Sanger kết hợp công cụ tin sinh học (SD-Score, MaxEntScan).
• Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia huyết học - truyền máu: Cung cấp thêm góc nhìn bệnh học phân tử về sự biến đổi miễn dịch tế bào (sự tăng cao của tế bào Treg, Th1, IL-6, TNF-α) và vai trò của các DUB ngoài đột biến JAK2 V617F trên bệnh nhân THCVC.
• Các nhà phát triển thuốc sinh học: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về hai mục tiêu tiềm năng A20 và Otubain-1 trong việc điều hòa dòng tín hiệu viêm và chức năng tế bào miễn dịch.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ đột biến gen JAK2 V617F được ghi nhận như thế nào ở bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn theo luận án?
Đột biến JAK2 V617F (rs77375493 trên exon 14) làm tăng khả năng phosphoryl hóa của kinase JAK2 và được ghi nhận xuất hiện ở trên 90% số trường hợp bệnh nhân đa hồng cầu / tăng hồng cầu vô căn, đóng vai trò là dấu ấn phân tử quan trọng trong tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh.

2. Biến thể di truyền mới nào trên gen CYLD đã được luận án phát hiện ở bệnh nhân THCVC?
Luận án đã phát hiện 11 SNP trên gen CYLD, trong đó có biến thể mới p.W736G nằm trên exon 15 chưa từng được công bố trước đó, và biến thể vùng ghép nối c.2483+6 T>G được các phần mềm tin sinh học (SD-Score, MaxEntScan) dự đoán là có khả năng cao liên quan đến cơ chế gây bệnh.

3. Mức độ biểu hiện của các gen DUB và các cytokine huyết thanh thay đổi ra sao ở bệnh nhân THCVC?
Bệnh nhân THCVC có sự suy giảm biểu hiện (bất hoạt) rõ rệt của các gen deubiquitinase gồm A20, CYLD, Cezanne và gen chống lão hóa Klotho; đồng thời có sự gia tăng đáng kể nồng độ của các cytokine tiền viêm trong huyết thanh gồm IL-6 và TNF-α so với người khỏe mạnh.

4. Quần thể tế bào miễn dịch nào gia tăng trong máu tuần hoàn của bệnh nhân THCVC?
Kết quả phân tích dòng chảy (Flow cytometry) cho thấy bệnh nhân THCVC có sự gia tăng đáng kể số lượng tế bào lympho T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và đặc biệt là tế bào T điều hòa (Treg), tạo ra trạng thái bất lợi cho đáp ứng miễn dịch chống khối u của cơ thể.

5. Thử nghiệm bất hoạt gen bằng siRNA in vitro đã chứng minh vai trò gì của gen A20 và Otubain-1?
Bất hoạt A20 làm tăng hoạt hóa tế bào T (CD3+CD25+), tế bào B (CD19+CD25+), tủy bào (CD11b+CD40+), tăng tiết TNF-α, IL-1β và tăng di cư tế bào PBMC. Trong khi đó, bất hoạt Otubain-1 làm tăng hoạt hóa tế bào NK (CD56+CD44+) và ức chế biểu hiện của các phân tử truyền tín hiệu SHP-1 và STAT-6.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Thị Trang đã làm sáng tỏ vai trò sinh học phân tử của nhóm gen mã hóa deubiquitinase (A20, CYLD, Cezanne, Otubain-1) và các tín hiệu phân tử liên quan trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn tại Việt Nam. Công trình đã phát hiện biến thể di truyền mới p.W736G trên gen CYLD, xác định tình trạng suy giảm biểu hiện của các gen DUB đi kèm với sự tăng sinh các cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-α) và các quần thể tế bào T hoạt hóa, Th1, Treg ở bệnh nhân. Đồng thời, các thử nghiệm can thiệp siRNA in vitro đã chứng minh vai trò trực tiếp của A20 và Otubain-1 trong điều hòa chức năng, sự di cư, tiết cytokine và con đường tín hiệu của tế bào PBMC, tạo cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp điều trị trúng đích trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về bệnh tăng hồng cầu vô căn 1.1 Khái quát bệnh tăng hồng cầu vô căn Bệnh tăng hồng cầu vô căn (Polycythaemia vera- PV) là bệnh ung thư máu thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy ác tính (Myeloproliferative neoplasms- MPNs), đặc trưng bởi sự tăng sinh quá mức các tế bào dòng tủy trưởng thành và chưa trưởng thành. Sự tăng sinh quá mức các tế bào dòng tủy dẫn tới sự tăng sinh vượt mức của các tế bào máu bao gồm: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) bệnh tăng sinh tủy được phân làm 6 loại bệnh bao gồm: bệnh đa hồng cầu hay còn gọi là bệnh THCVC, tăng tiểu cầu tiền phát (essential thrombocythaemia- ET) và xơ tủy nguyên phát (primary myelofibrosis- PM) được phân loại cùng với bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (chronic myelogenous leukaemia- CML), bạch cầu mạn dòng bạch cầu trung tính và bạch cầu mạn dòng bạch cầu ái toan (chronic neutrophilic leukaemia- CNL) [1]. Tăng sinh tủy là nhóm bệnh phát triển chậm trong đó mỗi loại bệnh trong nhóm đều ảnh hưởng tới nhiều loại tế bào máu khác nhau.

Ba trong số các bệnh tăng sinh tủy bao gồm THCVC, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy nguyên phát có đặc điểm chung là không chứa nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) là nhiễm sắc thể số 22 có chứa tổ hợp gen BCR-ABL1 [2]. Tế bào ác tính trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn (https://www.net/rumanahameed1/polycythemia-vera-rumana) Bệnh THCVC là bệnh phổ biến nhất trong nhóm bệnh tăng sinh tủy với đặc điểm là sự tăng lên bất thường của số lượng tế bào hồng cầu (Hình 1. Đây là bệnh phát sinh trong quá trình rối loạn hình thành tế bào gốc tạo máu, tuy nhiên ban đầu 6 bệnh có thể có những biểu hiện như tăng hồng cầu, tăng bạch cầu và tăng tiểu cầu hay sự kết hợp của các triệu chứng trên với lách to hay xơ tủy nguyên phát [3]. Tại Hoa Kỳ, báo cáo dịch tễ năm 2014 cho thấy có 148.000 người đang mắc bệnh THCVC với tỷ lệ rơi vào khoảng 2,5-10 người/ 100.

Bệnh THCVC là bệnh có tỷ lệ mắc và sống sót sau 5 năm phụ thuộc vào độ tuổi. Ở Châu Âu, số liệu thống kê từ những năm 1995 đến 2002 cho thấy, tỷ lệ sống sau 5 năm của THCVC là 84,8% (81,5–87,5%) và tỷ lệ sống sót tương đối giảm xuống còn 79,4% ở những người 70 tuổi [4]. Đến thời điểm hiện tại các nhà khoa học vẫn chưa có sự đồng thuận trong chẩn đoán và điều trị chứng bệnh THCVC [5, 6].2 Một số nghiên cứu về kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn Bệnh THCVC được đặc trưng bởi sự dư thừa hồng cầu và sự tham gia chủ yếu của dòng hồng cầu với sự tăng sinh ấy có thể thay đổi các dòng megakaryocytic hoặc bạch cầu hạt [7]. Năm 2015, nghiên cứu trên 20 bệnh nhân dương tính với JAK2V617F trong đó 14 bệnh nhân mắc bệnh THCVC và 6 bệnh nhân mắc bệch tăng tiểu cầu tiền phát (ET) đã chỉ ra rằng, interferon-α thay đổi rõ rệt số lượng tế bào T điều hòa (CD4+ CD25+ Foxp3+), tế bào NK và tế bào DC [8].

Nghiên cứu khác chỉ ra rằng tỷ lệ tế bào NK tăng lên ở bệnh nhân THCVC so với nhóm khỏe mạnh, mặc dù khả năng gây độc tế bào của tế bào NK ở bệnh nhân THCVC so với người khỏe mạnh là tương tự nhau [9]. Bệnh nhân THCVC có số lượng tăng các tế bào T CD8+ nhớ cùng với sự biểu hiện của phân tử MHC-1 trên bề mặt tế bào giảm đi, chính vì thế khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bị giảm đi đáng kể [10]. Đột biến JAK2V617F được phát hiện trong tất cả các tế bào dòng tủy và một số ít tế bào dòng lympho. Điều này đã đặt ra câu hỏi cho các nghiên cứu trên bệnh THCVC rằng liệu đột biến này có tần suất xảy ra khác biệt trên tế bào dòng lympho và dòng tủy hay không? Nghiên cứu về sự hiện diện của đột biến JAK2V617F trong các tế bào máu ngoại vi từ bệnh THCVC đã phát hiện ra rằng đột biến JAK2V617F trong tế bào B và NK xảy ra ở một số ít bệnh nhân mắc bệnh THCVC.

Bên cạnh đó, đột biến JAK2V617F cũng được phát hiện trong tất cả các tế bào T có nguồn gốc từ tế bào CD34+ bệnh THCVC [11]. Ngoài ra, nghiên cứu 7 trên tế bào NK từ chuột đột biến JAK2V617F đã chỉ ra rằng, tế bào NK trên chuột đột biến có khả năng tăng sinh và hoạt hóa thấp hơn so với tế bào NK kiểu dại. Ngoài ra, tế bào NK từ chuột đột biến JAK2V617F thiếu khả năng điều hòa miễn dịch, do đó hoạt động của hệ miễn dịch trong những con chuột này không bình thường [13]. Tiếp đó, sự thay đổi biểu hiện một số gen như gen CASP2, CASP3, DAPK1, ALG2 của tế bào CD34+ từ tủy xương của bệnh nhân THCVC đã được chỉ ra liên quan đến sự phát triển ác tính của tế bào gốc tạo máu trong bệnh THCVC.

Trong số các gen thay đổi biểu hiện, gen quy định các yếu tố tăng trưởng kích thích xơ hóa (TGF-β1, TGF-β2, BMP-2 và VEGF) được biểu hiện ở mức cao hơn đáng kể trong các tế bào CD34+ trong bệnh THCVC [12].3 Một số nghiên cứu về đột biến gen trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn Nhiều nghiên cứu ở cấp độ phân tử trên những bệnh nhân THCVC để có thể hiểu thêm về cơ chế bệnh sinh, từ đó tìm ra được phương pháp trị liệu phù hợp. Nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã cho thấy một số kết quả về các đột biến gen xuất hiện trong bệnh THCVC. Hầu hết các bệnh nhân THCVC đều cho thấy sự xuất hiện của đột biến trên gen JAK2 và đó chính là đột biến JAK2 V617F [14]. Đột biến JAK2 V617F được coi là một marker cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh THCVC.

Kiểm tra đột biến JAK2 V617F được cho là cần thiết cho việc xác định và chẩn đoán sớm từ giai đoạn 1 của bệnh THCVC. Năm 2003 Bench và cộng sự đã đưa ra hướng dẫn riêng cho việc chẩn đoán chứng THCVC bằng việc xét nghiệm đột biến JAK2 V617F [15]. Ngoài đột biến JAK2 V617F, ở những bệnh nhân THCVC trên gen JAK2 cũng nhận thấy xuất hiện đột biến trên exon số 12. Không giống như đột JAK2 V617F xuất hiện ở hầu hết các bệnh nhân THCVC, đột biến trên exon số 12 của gen này chỉ nhận thấy ở 2% đến 3% các bệnh nhân THCVC.

Tuy nhiên so với đột biến JAK2 V617F, đột biến trên exon 12 của gen JAK2 có xu hướng trẻ hơn với nồng độ hemoglobin cao hơn, số lượng bạch cầu và tiểu cầu thấp hơn cùng với sự gia tăng hồng cầu mà không có bất thường về hình thái bạch cầu hạt [16]. 8 Bên cạnh đột biến trên gen JAK2, các đột biến trên gen Calretaculin (CALR) cũng được nghiên cứu và báo cáo ở trên những bệnh nhân THCVC. CALR nằm ở vị trí chromosome 19p13.2 và chứa 9 exon kéo dài 4,2 kb. Nghiên cứu trên đối tượng là chuột cho thấy, chuột bị loại bỏ CALR thường chết trước khi được sinh ra.

Chuột mất gen CALR sẽ bị suy tim hoặc tim chậm phát triển. Bên cạnh đó, nếu gen CALR biểu hiện quá mức cũng dẫn tới sự khiếm khuyết về tim sau khi sinh [17]. CALR có vai trò quan trọng và được cho là tham gia vào quá trình cân bằng Ca2+ nội môi, giúp phân giải các protein được sản xuất lỗi, bám dính tế bào, đáp ứng miễn dịch ung thư và thực bào. Bất thường của biểu hiện CALR đã được báo cáo trong các bệnh ung thư khác nhau [18].

Nghiên cứu của Misa Imai và cộng sự năm 2013 đã báo cáo đột biến CARL mới (mất và chèn ở exon 9) và JAK2 ở bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát. Trong tăng tiểu cầu nguyên phát, đột biến gen CALR có mức độ huyết sắc tố thấp hơn, số lượng bạch cầu thấp hơn, số lượng tiểu cầu cao hơn và khả năng sống sót tốt hơn so với đột biến trên gen JAK2 [19]. Cho đến nay, tất cả các đột biến CARL được tìm thấy trong tăng sinh tủy đều liên quan đến exon 9. Đột biến gen CALR hiếm khi xuất hiện ở bệnh THCVC còn đột biến gen MPL thì gần như không có.

Kể từ khi được miêu tả vào năm 1892 đến nay, hơn 125 năm đã qua nhưng nguyên nhân về bệnh tăng hồng cầu vô căn vẫn chưa hoàn toàn được sáng tỏ [20]. Bệnh THCVC được cho rằng xuất hiện do sự rối loạn trong quá trình hình thành các tế bào máu. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra cơ chế hình thành bệnh THCVC. Kết quả của nhiều nghiên cứu đưa ra cho thấy đột biến của gen JAK là một trong những nguyên nhân dẫn tới THCVC.

Đột biến gen JAK2-V617F gây tăng khả năng phosphoryl hóa của JAK2, dẫn tới tăng sinh quá mức của các tế bào dòng tủy [21]. Trên 90% người mắc bệnh đa hồng cầu nguyên phát đều có đột biến này. Nghiên cứu di truyền tế bào và đột biến gen JAK2 cho thấy các bất thường về di truyền tế bào trong THCVC không phải là biểu hiện đặc hiệu khi chưa tới 25% số bệnh nhân có bất thường về di truyền tế bào [21]. Sự bất thường trong kiểu nhân (karyotypic) thường gặp nhất ở những bệnh nhân mắc THCVC là mất đoạn 20q, trisomies 8 và 9, tuy nhiên tỷ lệ phát hiện gần như không đáng kể khi đánh giá bằng kỹ thuật sử dụng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH- Fluorescence in situ hybridization).

Tương tự, các nghiên cứu dựa trên kỹ thuật FISH 9 trong các tế bào tủy xương từ những bệnh nhân THCVC, với karyotype bình thường không cho thấy sự mất đoạn liên quan đến vùng nhiễm sắc thể 20q11 khi quan sát dưới kính hiển vi [22]. Nhiễm sắc thể 9p24 chứa gen JAK2, gần đây đã được chứng minh là mang đột biến điểm V617F soma ở exon 14 xuất hiện trong phần lớn bệnh nhân mắc bệnh THCVC [23]. Quá trình truyền tín hiệu của protein JAK2 [24] JAK (Janus kinases) là một họ protein truyền tín hiệu nội bào bao gồm bốn thành viên: JAK1, JAK2, JAK3 và Tyk2. JAK được kích hoạt khi xảy ra sự gắn của phối tử với các thụ thể trung gian.

Thông qua quá trình gắn của phối tử và thụ thể này làm thay đổi cấu trúc không gian của thụ thể truyền tin, hai protein JAK tiếp tục được đưa đến gần nhau, cho phép phosphoryl hóa giữa hai protein JAK và hoạt hóa phân tử JAK. Các protein JAK được kích hoạt sau đó phosphoryl hóa các mục tiêu bổ sung, bao gồm cả các thụ thể và các protein STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) là protein hoạt hóa phiên mã (Hình 1.