XÁC ĐỊNH VAI TRÒ CỦA HPV VÀ CÁC BIẾN THỂ TRONG UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN TRUNG ƯƠNG

Nghiên cứu vai trò của HPV và các biến thể trong ung thư cổ tử cung tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Tìm hiểu sâu hơn về mối liên hệ giữa HPV và ung thư CTC.

• Tác giả: Hoàng Xuân Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Bá Quyết
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Sản phụ khoa
• Đề tài: Xác Định Vai Trò Của HPV Và Các Biến Thể Trong Ung Thư Cổ Tử Cung Tại Bệnh Viện Phụ Sản Trung Ương
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm về HPV
• 1.2. Đặc điểm cấu trúc HPV
• 1.3. Chức năng các gen HPV
• 1.4. Dịch tễ học nhiễm HPV
• 1.5. HPV và cơ chế bệnh sinh gây ung thư cổ tử cung
• 1.6. Chẩn đoán nhiễm HPV
• 1.7. Tỷ lệ nhiễm HPV
• 1.7.1. Trên thế giới
• 1.7.2. Tại Việt Nam
• 1.8. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư cổ tử cung
• 1.8.1. Những biểu hiện tổn thương ở cổ tử cung
• 1.8.2. Tổn thương lành tính
• 1.8.3. Các khối u lành tính cổ tử cung
• 1.8.4. Các tổn thương nghi ngờ cổ tử cung
• 1.8.5. Ung thư cổ tử cung
• 1.9. Tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung
• 1.10. Chẩn đoán tiền ung thư và ung thư cổ tử cung
• 1.11. Các yếu liên quan tới ung thư cổ tử cung
• 1.12. Các tuýp HPV và các biến thể trong ung thư cổ tử cung
• 1.13. Các tuýp huyết thanh và phân loại HPV
• 1.14. Các biến thể trong ung thư cổ tử cung
• 1.15. Mối quan hệ giữa các biến thể HPV và sinh bệnh ung thư cổ tử cung
• 1.16. Phân loại biến thể HPV: theo dòng dõi và dòng dõi con
• 1.17. Nhóm alpha-PV ở người với các dòng biến thể
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn
• 2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.7. Cỡ mẫu và kỹ thuật chọn mẫu nghiên cứu
• 2.8. Qui trình nghiên cứu
• 2.9. Biến số, chỉ số nghiên cứu
• 2.10. Phương pháp thu thập số liệu và một số kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.11. Tiêu chí chẩn đoán lâm sàng UTCTC
• 2.12. Tiêu chí chẩn đoán cận lâm sàng ung thư cổ tử cung
• 2.13. Nhận định kết quả tế bào học và mô bệnh học
• 2.14. Nhận định kết quả xét nghiệm HPV nguy cơ cao và genotype
• 2.15. Phương pháp xử lí số liệu
• 2.16. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu y sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư cổ tử cung
• 3.2. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Đặc điểm lâm sàng UTCTC
• 3.4. Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân UTCTC
• 3.5. Các tuýp HPV và các biến thể trong ung thư cổ tử cung
• 3.6. Genotype của HPV
• 3.7. Mối liên quan giữa các genotype của HPV và các yếu tố nguy cơ
• 3.8. Đặc điểm gen E6, E7 và L1 của HPV16 và HPV18 ở bệnh nhân UTCTC
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
• 4.2. Tiền sử sản phụ khoa
• 4.3. Lý do vào viện của đối tượng nghiên cứu
• 4.4. Phân bố giai đoạn UTCTC
• 4.5. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
• 4.6. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
• 4.7. Đặc điểm cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
• 4.8. Xác định các tuýp HPV và các biến thể trong ung thư cổ tử cung
• 4.9. Các tuýp và phân bố các tuýp HPV của đối tượng nghiên cứu
• 4.10. Mối liên quan giữa các genotype của HPV và các yếu tố nguy cơ
• 4.11. Đặc điểm gen E6, E7 và L1 của HPV 16 và HPV 18
• 4.12. Những hạn chế của đề tài nghiên cứu
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên cứu Vai trò của HPV trong Ung thư CTC

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, đặc biệt ở phụ nữ. HPV (Human Papillomavirus) được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh này. Nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương tập trung vào việc làm sáng tỏ vai trò của HPV và các biến thể HPV trong sự phát triển của UTCTC. Việc hiểu rõ các chủng HPV phổ biến và cách chúng ảnh hưởng đến tế bào cổ tử cung là rất quan trọng để phát triển các phương pháp tầm soát và điều trị hiệu quả hơn. Nghiên cứu này có ý nghĩa lớn trong việc cải thiện sức khỏe phụ nữ và giảm tỷ lệ mắc UTCTC tại Việt Nam. Dữ liệu dịch tễ học cho thấy nhiễm trùng dai dẳng với HPV nguy cơ cao (HPV16 và HPV18) có thể dẫn đến tăng sản không điển hình và UTCTC.13-16

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu biến thể HPV

Nghiên cứu về biến thể HPV rất quan trọng vì các biến thể khác nhau có thể có khả năng gây ung thư khác nhau. Xác định các biến thể phổ biến tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương giúp các bác sĩ có thể dự đoán nguy cơ mắc UTCTC và đưa ra các biện pháp phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị phù hợp. Việc giải trình tự gen HPV giúp xác định rõ hơn các biến thể và mối liên quan của chúng với các giai đoạn phát triển của UTCTC.

1.2. Mục tiêu của nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương

Nghiên cứu này tập trung vào việc mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của UTCTC tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Đồng thời, nó xác định các loại HPV và biến thể HPV hiện diện trong các mẫu bệnh phẩm. Kết quả này có thể giúp cải thiện các chiến lược tầm soát và điều trị UTCTC, đặc biệt là trong bối cảnh cụ thể của Việt Nam. Nghiên cứu cũng hướng đến cung cấp thêm các dữ liệu về phân nhóm và dưới nhóm của HPV16 và 18, E6, E7 và L1 ở tế bào UTCTC.

II. Thách thức HPV và Ung thư Cổ tử cung tại Việt Nam

Mặc dù có các chương trình tầm soát và tiêm phòng HPV, UTCTC vẫn là một vấn đề sức khỏe đáng lo ngại tại Việt Nam. Tỷ lệ mắc bệnh còn cao và có xu hướng gia tăng. Việc tiếp cận các dịch vụ tầm soát và tiêm phòng còn hạn chế ở một số vùng. Bên cạnh đó, kiến thức về HPV và UTCTC còn hạn chế trong cộng đồng. Nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương giúp xác định các yếu tố nguy cơ và các chủng HPV phổ biến, từ đó có thể xây dựng các chương trình phòng ngừa và tầm soát hiệu quả hơn. Theo Nguyễn Thị Phương Mai nghiên cứu 188 bệnh nhân ung thư CTC thì tỷ lệ nhiễm HPV là 89,4%.

2.1. Rào cản trong tầm soát và phòng ngừa UTCTC

Một số rào cản chính bao gồm chi phí xét nghiệm HPV, thiếu kiến thức về lợi ích của việc tầm soát, và sự e ngại khi đến khám bệnh. Việc cải thiện nhận thức cộng đồng và tăng cường khả năng tiếp cận các dịch vụ y tế là rất quan trọng để giảm tỷ lệ mắc UTCTC. Các chương trình giáo dục sức khỏe cần tập trung vào việc giải thích rõ ràng về HPV, cách lây truyền và tầm quan trọng của việc tiêm phòng.

2.2. Sự cần thiết của nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ

Nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ như quan hệ tình dục sớm, nhiều bạn tình, hút thuốc lá và suy giảm miễn dịch có thể giúp xác định những người có nguy cơ cao mắc UTCTC. Từ đó, có thể tập trung các nguồn lực để tầm soát và điều trị cho những đối tượng này. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ giữa các yếu tố di truyền và nguy cơ mắc UTCTC.

III. Phương pháp PCR Xác định chính xác HPV và biến thể

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ để phát hiện và xác định các loại HPV và biến thể HPV. PCR cho phép nhân bản một đoạn DNA cụ thể, giúp các nhà nghiên cứu có thể phân tích và xác định các chủng HPV khác nhau. Việc sử dụng PCR trong nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương giúp đảm bảo độ chính xác cao trong việc xác định các chủng HPV liên quan đến UTCTC. Chẩn đoán HPV bằng PCR là phương pháp tin cậy để phát hiện nhiễm HPV và các tuýp nguy cơ cao có thể gây ra UTCTC.

3.1. Ưu điểm của phương pháp PCR trong nghiên cứu HPV

Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện các chủng HPV ngay cả khi chúng có mặt với số lượng rất nhỏ. PCR cũng có thể được sử dụng để xác định nhiều chủng HPV cùng một lúc, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Ngoài ra, PCR có thể được sử dụng trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau, bao gồm tế bào cổ tử cung và mô sinh thiết.

3.2. Ứng dụng của PCR trong chẩn đoán lâm sàng UTCTC

Trong chẩn đoán lâm sàng, PCR có thể được sử dụng để xác định xem một phụ nữ có bị nhiễm HPV hay không, và nếu có, thì chủng HPV nào. Thông tin này có thể giúp bác sĩ đưa ra quyết định về việc tầm soát và điều trị UTCTC. PCR cũng có thể được sử dụng để theo dõi hiệu quả điều trị UTCTC và phát hiện tái phát.

IV. Giải trình tự gen HPV Bí quyết phát hiện đột biến liên quan

Giải trình tự gen HPV là một phương pháp tiên tiến cho phép xác định trình tự nucleotide của bộ gen HPV. Thông qua giải trình tự gen, các nhà nghiên cứu có thể phát hiện các đột biến gen HPV và các biến thể HPV khác nhau. Nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương sử dụng giải trình tự gen để xác định các đột biến và biến thể HPV liên quan đến UTCTC, từ đó có thể hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Tế bào UTCTC do HPV sinh ra chủ yếu qua gen trung gian E6, E7 và L1.

4.1. Tầm quan trọng của việc phân tích đột biến gen E6 E7 L1

Các gen E6, E7 và L1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây ung thư của HPV. Các đột biến trong các gen này có thể ảnh hưởng đến khả năng gây ung thư của HPV. Việc phân tích các đột biến trong các gen này có thể giúp xác định các biến thể HPV có nguy cơ gây UTCTC cao hơn.

4.2. Kết quả giải trình tự gen HPV giúp ích gì cho điều trị

Kết quả giải trình tự gen HPV có thể giúp các bác sĩ lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân. Ví dụ, một số biến thể HPV có thể đáp ứng tốt hơn với một số loại thuốc nhất định. Thông tin này có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.

V. Ứng dụng Tầm soát HPV cải thiện tiên lượng UTCTC ra sao

Tầm soát ung thư cổ tử cung đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm. Việc tầm soát thường bao gồm xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (Pap smear) và xét nghiệm HPV. Nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tầm soát thường xuyên để cải thiện tiên lượng ung thư cổ tử cung. Điều trị CIN cho phép khỏi bệnh hoàn toàn và bảo tồn được chức năng sinh sản.

5.1. Lợi ích của việc kết hợp Pap smear và xét nghiệm HPV

Việc kết hợp cả hai xét nghiệm giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của việc tầm soát. Xét nghiệm HPV có thể phát hiện HPV trước khi có bất kỳ thay đổi tế bào nào, trong khi Pap smear có thể phát hiện các tế bào bất thường. Việc kết hợp hai xét nghiệm giúp phát hiện UTCTC sớm hơn và cải thiện tiên lượng.

5.2. Ảnh hưởng của tầm soát thường xuyên đến tỷ lệ tử vong UTCTC

Tầm soát thường xuyên giúp phát hiện UTCTC ở giai đoạn sớm, khi bệnh có thể được điều trị hiệu quả hơn. Điều này dẫn đến cải thiện tiên lượng và giảm tỷ lệ tử vong do UTCTC. Các chương trình tầm soát quốc gia nên được triển khai rộng rãi để đảm bảo rằng tất cả phụ nữ đều có cơ hội được tầm soát UTCTC.

VI. Tương lai Nghiên cứu HPV mở ra hướng điều trị ung thư CTC

Nghiên cứu về HPV và biến thể HPV đang mở ra những hướng điều trị mới cho UTCTC. Các nhà khoa học đang nghiên cứu các loại thuốc mới có thể nhắm mục tiêu trực tiếp vào HPV và các tế bào ung thư do HPV gây ra. Nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương đóng góp vào sự hiểu biết sâu sắc hơn về HPV và mở đường cho các phương pháp điều trị UTCTC hiệu quả hơn trong tương lai.

6.1. Triển vọng của liệu pháp nhắm mục tiêu vào HPV

Liệu pháp nhắm mục tiêu vào HPV có tiềm năng điều trị UTCTC mà không gây ra nhiều tác dụng phụ như các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị và xạ trị. Các loại thuốc mới đang được phát triển có thể ức chế sự nhân lên của HPV hoặc tiêu diệt các tế bào ung thư do HPV gây ra.

6.2. Vai trò của vaccine HPV trong tương lai phòng ngừa UTCTC

Vaccine HPV đã chứng minh hiệu quả trong việc phòng ngừa nhiễm HPV và giảm nguy cơ mắc UTCTC. Việc tiêm phòng HPV cho trẻ em gái và trẻ em trai có thể giúp giảm đáng kể tỷ lệ mắc UTCTC trong tương lai. Các nghiên cứu tiếp tục được tiến hành để cải thiện hiệu quả của vaccine HPV và mở rộng phạm vi bảo vệ chống lại các chủng HPV khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu ung thư cổ tử cung (UTCTC) trong kỷ nguyên y học bộ gen đòi hỏi sự chuyển dịch mô thức từ việc xác định định tính sự hiện diện của virus sang phân tích chi tiết cấu trúc phân tử và phả hệ di truyền học. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Hoàng Xuân Sơn với tiêu đề "Xác định vai trò của HPV và các biến thể trong ung thư cổ tử cung tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương" (Chuyên ngành Sản phụ khoa, Mã số: 92702105, Trường Đại học Y Hà Nội, năm 2024, dưới sự hướng dẫn của PGS. Vũ Bá Quyết và PGS. Nguyễn Vũ Trung) đã thiết lập một bước tiến khoa học quan trọng trong việc khảo sát dịch tễ học phân tử và đặc tính đột biến gen của Human Papillomavirus (HPV) tại Việt Nam.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trọng yếu mà công trình giải quyết xuất phát từ thực tế: mặc dù vai trò gây ung thư của các phân tuýp nguy cơ cao (High-risk HPV - HR-HPV) như HPV16 và HPV18 đã được khẳng định trên toàn cầu, các dữ liệu vi mô về phổ đột biến của các gen sinh ung then chốt ($E6, E7$) và gen vỏ cấu trúc ($L1$), cũng như phân bố dòng dõi (lineage/sublineage) của virus trên bệnh nhân UTCTC Việt Nam vẫn còn phân tán và chưa đồng bộ. Như tác giả đã nêu rõ: "Hiện nay, vẫn còn ít nghiên cứu tại Việt Nam về sự biến đổi của biến thể của HPV 16 và 18 ở những bệnh nhân UTCTC. Để làm rõ hơn nữa mối liên quan giữa biến thể gen của HPV 16 và 18 cùng với đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của ung thư cổ tử cung... chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu".

Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Đặc điểm dịch tễ học phân tử, tỷ lệ nhiễm đơn/đồng nhiễm các genotype HPV và mối tương quan với tổn thương lâm sàng, mô bệnh học của bệnh nhân UTCTC tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương diễn ra như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cấu trúc phả hệ di truyền, các biến thể dòng dõi (sublineages) và phổ đột biến điểm đơn nucleotide (SNPs) trên các gen $E6, E7, L1$ của chủng HPV16 và HPV18 phân lập tại Việt Nam có đặc điểm gì đặc thù so với các chủng chuẩn quốc tế?
• Giả thuyết khoa học 1 (H1): Sự phân bố của các genotype HPV nguy cơ cao và các biến thể dòng dõi phụ (sublineage) có mối liên hệ mật thiết với mức độ tiến triển ác tính, phân loại mô bệnh học (ung thư biểu mô vảy so với ung thư biểu mô tuyến) và giai đoạn lâm sàng theo FIGO 2018.
• Giả thuyết khoa học 2 (H2): Các đột biến thay thế nucleotide đặc hiệu trên gen sinh ung $E6$ (điển hình như đột biến T350G/L83V) và gen $E7, L1$ làm gia tăng tính sinh ung và sự bền vững của nhiễm trùng thông qua việc tối ưu hóa cơ chế bất hoạt các protein ức chế khối u $p53$ và $pRb$.

Khung lý thuyết của luận án được định vị dựa trên ba trụ cột: (1) Thuyết Sinh ung thư do Virus (Viral Oncogenesis Theory) của Harald zur Hausen; (2) Cơ chế ức chế khối u hai bước (Two-hit hypothesis) và tương tác protein thoái giáng $p53/pRb$; (3) Thuyết Cố định Dòng dõi và Tiến hóa Đa hình Virus (Viral Lineage Fixation & Phylogenomics Framework) của Bernard và Burk. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên mẫu bệnh nhân UTCTC nhập viện và điều trị tại Khoa Phụ ung thư - Bệnh viện Phụ sản Trung ương trong giai đoạn từ ngày 01/01/2017 đến ngày 31/12/2020, tích hợp công nghệ xét nghiệm định tính tự động Cobas 4800 (Roche) và giải trình tự gen Sanger trực tiếp.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế và trong nước ghi nhận sự phát triển sâu rộng trong việc giải mã vai trò của HPV đối với quá trình sinh bệnh học của biểu mô cổ tử cung. Theo nghiên cứu tổng hợp kinh điển của Muñoz và cộng sự (2003) tại 9 quốc gia trên thế giới, 14 tuýp HPV thuộc nhóm nguy cơ cao bao gồm HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 được xác định là nguyên nhân căn nguyên hàng đầu, trong đó "HPV16, 18 gây 70% UTCTC" và "trên 90% các trường hợp UTCTC có sự hiện diện của nhóm HPV có nguy cơ cao". Nghiên cứu quy mô của F. Xavier Bosch (1997, 1999) đã chứng minh tỷ lệ hiện diện của HPV DNA trong mô ung thư cổ tử cung xâm lấn lên tới 99,7%, xác lập HPV là yếu tố căn nguyên tuyệt đối cần thiết cho sự phát sinh khối u.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ học của Vũ Thị Hoàng Lan (2012) trên 4.500 phụ nữ ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV dao động từ 6,13% đến 10,2% giữa các vùng miền, với các kiểu gen phổ biến nhất là HPV16, 18 và 58. Trần Thị Lợi và cộng sự (2010) tại TP. Hồ Chí Minh xác định tỷ lệ nhiễm HPV là 10,84% (nguy cơ cao chiếm 9,1%). Nghiên cứu của Phạm Thọ Dược trên 1.072 phụ nữ Đắk Lắk ghi nhận tỷ lệ nhiễm 11,8% với sự chiếm ưu thế của HPV16 (28,6%), HPV18 (22,1%) và HPV58 (15,6%). Về mặt phả hệ học, Nguyễn Thị Phương Mai khi phân tích 188 bệnh nhân UTCTC đã chỉ ra 89,4% dương tính HPV, trong đó HPV16 chiếm 43,5%, HPV18 chiếm 16,2% và "có 94% các trường hợp nhiễm HPV16 thuộc lineage European".

Các tranh luận khoa học lớn trong y văn tập trung vào hai luồng quan điểm đối nghịch:

1. Luồng quan điểm 1: Mức độ ác tính và khả năng xâm lấn của UTCTC chủ yếu bị chi phối bởi kiểu gen (genotype) và tải lượng virus, trong đó các biến thể vi mô (sublineages/SNPs) chỉ là những đa hình trung tính phát sinh ngẫu nhiên trong quá trình sao chép bộ gen.
2. Luồng quan điểm 2 (Được ủng hộ bởi Bernard 1994, Burk 2013, Mirabello 2017): Các biến thể trong cùng một kiểu gen có sự khác biệt rõ rệt về độc lực sinh học. Cụ thể, các dòng không phải châu Âu (Non-European lineages: B, C, D) và nhánh châu Á (A4) của HPV16 thể hiện khả năng gắn kết phối tử bất thường, gia tăng nguy cơ tiến triển thành tổn thương biểu mô mức độ cao (CIN3) và ung thư xâm lấn gấp 2 đến 10 lần so với dòng nguyên mẫu châu Âu (A1).

Luận án của Hoàng Xuân Sơn đã định vị chính xác khoảng trống này bằng cách mở rộng phân tích không chỉ dừng lại ở việc định tuýp thông thường mà tiến sâu vào cấu trúc phả hệ đa vùng ($E6, E7, L1$) của hai tuýp độc lực cao nhất là HPV16 và HPV18. So với các nghiên cứu quốc tế lớn như nghiên cứu thuần tập tại Costa Rica (Schiffman et al.) hay các khảo cứu phả hệ tại Đài Loan và Brazil (Xi et al., Freitas et al.), công trình cung cấp bằng chứng trực tiếp tại quần thể lâm sàng Việt Nam, đóng góp dữ liệu đối sánh quan trọng cho bản đồ phả hệ virus HPV khu vực Đông Nam Á.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm mô hình sinh ung thư phân tử thông qua các luận điểm lý thuyết:

• Tái khẳng định và cụ thể hóa Thuyết Cố định Dòng dõi (Lineage Fixation): Bộ gen HPV sao chép dựa vào hệ thống enzyme polymerase của tế bào vật chủ với cơ chế đọc sửa nghiêm ngặt, dẫn đến tỷ lệ đột biến tự nhiên rất thấp. Tuy nhiên, sự tích lũy tuần tự của các đột biến điểm đa hình (SNPs) tại các vùng gen sớm đã tạo nên các dòng phụ có khả năng thích ứng mô học và trốn tránh miễn dịch vượt trội.
• Làm rõ cơ chế can thiệp chu trình tế bào của Oncoprotein E6 và E7: Luận án phân tích chi tiết cơ chế protein E6 tạo phức hệ với E6AP (E6-associated protein) đóng vai trò như một ubiquitin ligase gây thoái giáng thụ thể ức chế khối u $p53$, đồng thời gắn kết protein domain PDZ phá hủy cấu trúc liên kết tế bào. Đối với protein E7, motif nhận diện $LXCXE$ bộc lộ ái lực cao gấp 10 lần ở các tuýp nguy cơ cao so với nguy cơ thấp, cạnh tranh vị trí gắn kết trên phức hợp $pRb-E2F$, giải phóng yếu tố phiên mã $E2F$ tự do thúc đẩy tế bào vượt qua điểm kiểm soát $G1/S$ mà không cần quá trình phosphoryl hóa $pRb$ sinh lý.
• Mô hình hóa tương tác tích hợp bộ gen: Sự đứt gãy hoặc mất đoạn gen điều hòa $E2$ khi DNA virus tích hợp vào nhiễm sắc thể người làm triệt tiêu chức năng ức chế chuyển mã tự nhiên của E2, dẫn đến sự biểu hiện quá mức không kiểm soát của hai gen sinh ung $E6$ và $E7$.

Các mệnh đề lý thuyết được xác lập:

• Mệnh đề 1 (P1): Tần suất xuất hiện của đột biến T350G trên gen $E6$ của HPV16 có tương quan đồng biến với khả năng tồn tại dai dẳng của virus và mức độ xâm lấn mô đệm sâu.
• Mệnh đề 2 (P2): Các biến thể dòng phụ $A4$ (Asian) và $D$ (Asian-American) của HPV16 mang các đột biến tái sắp xếp nucleotide trên vùng promoter và protein cấu trúc $L1$, tạo ra ưu thế chọn lọc trong việc né tránh đáp ứng interferon của tế bào biểu mô vật chủ.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trục tiếp cận:

1. Trục Phân tử - Phả hệ học (Phylogenetic Axis): Giải trình tự nucleotide đa đoạn ($E6, E7, L1$) để xác định chính xác các sublineage ($A1, A2, A3, A4, D1, D3$ cho HPV16; $A1$ cho HPV18), khắc phục sự thiếu hụt độ phân giải khi chỉ phân tích đơn độc khung đọc mở $L1$.
2. Trục Bệnh học Tế bào & Mô bệnh (Pathological Axis): Đối chiếu phân loại tế bào học Bethesda (2014) và chẩn đoán mô bệnh học theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2018) giữa các nhóm ung thư tế bào vảy (SCC), ung thư biểu mô tuyến (Adenocarcinoma) và các biến thể hiếm gặp.
3. Trục Giai đoạn Lâm sàng (Clinical Axis): Chuẩn hóa mức độ lan tràn của khối u dựa trên hệ thống phân loại giai đoạn của Liên đoàn Sản Phụ khoa Quốc tế (FIGO 2018).

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được giới hạn nghiêm ngặt trong quần thể bệnh nhân nữ được chẩn đoán xác định UTCTC nguyên phát, có kết quả mô bệnh học khẳng định và mẫu bệnh phẩm đạt chuẩn chất lượng cho khuếch đại sinh học phân tử.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án vận dụng thế giới quan thực chứng (positivism) với phương pháp tiếp cận định lượng y sinh học chuẩn xác. Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thu thập số liệu tiến cứu được triển khai chặt chẽ nhằm đánh giá thực trạng nhiễm genotype HPV và giải mã cấu trúc phân tử của virus trên nhóm bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Thiết kế đa tầng (multi-level design) bao quát:

• Tầng 1 (Tế bào & Phân tử): Định genotype HPV bằng PCR thời gian thực và phân tích trình tự chuỗi gen $E6, E7, L1$.
• Tầng 2 (Mô bệnh học): Sinh thiết khối u cổ tử cung, nhuộm HE, đọc kết quả tiêu bản theo tiêu chuẩn WHO 2018.
• Tầng 3 (Lâm sàng): Đánh giá giai đoạn bệnh theo hệ thống FIGO 2018 qua thăm khám phụ khoa chuyên sâu và chẩn đoán hình ảnh.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình lựa chọn đối tượng và phân tích mẫu tuân thủ tiêu chuẩn chất lượng cao:

• Tiêu chuẩn lựa chọn:
  1. Bệnh nhân nữ được chẩn đoán xác định UTCTC và điều trị tại Khoa Phụ ung thư, Bệnh viện Phụ sản Trung ương từ 01/01/2017 đến 31/12/2020.
  2. Kết quả mô bệnh học được thực hiện và hội chẩn tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
  3. Mẫu phết tế bào/mô sinh thiết dương tính với HPV16, HPV18 hoặc nhóm 12 tuýp nguy cơ cao bằng hệ thống Cobas 4800 (Roche Molecular Systems) và còn lưu trữ đạt chuẩn.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân không được xét nghiệm HPV bằng hệ thống Cobas 4800 chuẩn; hồ sơ bệnh án thiếu hụt thông tin lâm sàng; mẫu bệnh phẩm hoại tử hoặc DNA bị thoái hóa không đủ điều kiện chạy giải trình tự gen.
• Kỹ thuật thu thập và khuếch đại phân tử:
  • Tách chiết DNA tự động và phát hiện định tính HPV bằng Cobas 4800 (sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng gen $L1$ kết hợp chứng nội $\beta$-globin).
  • Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) khuếch đại đoạn đặc hiệu gen $E6, E7$ và $L1$ của HPV16 và HPV18 sử dụng các cặp mồi chuyên biệt.
  • Giải trình tự chuỗi DNA hai chiều theo phương pháp Sanger trên hệ thống máy phân tích di truyền tự động (ABI 3500 Genetic Analyzer).
• Kiểm soát tính giá trị và độ tin cậy: Sử dụng đối chứng âm (nước cất siêu sạch) và đối chứng dương (mẫu chuẩn HPV đã biết trình tự) trong mọi mẻ phản ứng PCR. Kết quả giải trình tự được kiểm tra độ tin cậy thông qua chỉ số chất lượng chromatogram (phổ đồ peak rõ, không chồng đỉnh).

Data và phân tích

• Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài: Chuỗi nucleotide sau khi giải mã được căn chỉnh (alignment) với trình tự tham chiếu chuẩn của Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) bằng phần mềm chuyên dụng BioEdit và ClustalW.
• Cây phả hệ phân tử (Phylogenetic tree) được xây dựng dựa trên phương pháp Maximum Likelihood hoặc Neighbor-Joining với kiểm định lặp lại Bootstrap 1.000 lần bằng phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis).
• Xử lý thống kê y học: Toàn bộ dữ liệu lâm sàng và sinh học phân tử được quản lý và xử lý trên phần mềm SPSS phiên bản nâng cao. Áp dụng các thuật toán kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$), kiểm định chính xác của Fisher (Fisher's exact test) để so sánh các tỷ lệ; tính toán tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) với khoảng tin cậy 95% ($95%CI$) nhằm xác định mức độ liên quan giữa các sublineage/đột biến gen với giai đoạn lâm sàng và phân loại mô bệnh học. Ngưỡng ý nghĩa thống kê được thiết lập tại giá trị $p < 0,05$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Dựa trên phân tích phả hệ di truyền và dịch tễ học phân tử, luận án đã mang lại những phát hiện đột phá:

1. Phổ phân bố genotype HPV vượt trội: Tỷ lệ nhiễm HPV nguy cơ cao ở bệnh nhân UTCTC tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương chiếm tỷ lệ tuyệt đối, trong đó HPV16 và HPV18 tiếp tục là hai kiểu gen chiếm ưu thế chủ đạo, tái khẳng định mô hình dịch tễ của vùng Đông Nam Á nhưng có sự phân hóa rõ nét giữa thể ung thư biểu mô vảy và ung thư biểu mô tuyến.
2. Cấu trúc phả hệ đa dạng của HPV16: Phân tích trình tự gen $E6, E7, L1$ xác định sự lưu hành của nhiều dòng dõi phụ (sublineages) thuộc cả hai nhóm lớn: dòng châu Âu (European - Lineage A gồm các biến thể $A1, A2, A3, A4$) và dòng ngoài châu Âu (Non-European gồm các nhánh châu Á - Mỹ $D1, D3$). Sự xuất hiện của biến thể $A4$ (Asian lineage) và $D3$ chiếm tỷ lệ đáng kể trong các ca xâm lấn sâu.
3. Phát hiện các đột biến điểm đa hình đặc trưng (SNPs): Luận án ghi nhận tỷ lệ cao đột biến thay thế nucleotide $350 T>G$ trên gen $E6$ của HPV16 (dẫn đến đột biến thay đổi acid amin Leucine thành Valine tại codon 83 - L83V). Đột biến này liên quan có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) với khả năng tồn tại dai dẳng của virus và giai đoạn bệnh tiến triển nặng.
4. Đặc điểm đột biến trên gen $E7$ và $L1$: Phát hiện đột biến $647 A>G$ trên gen $E7$ và đột biến $7060 G>A$ trên khung đọc mở $L1$ của HPV16. Các đột biến trên gen cấu trúc $L1$ cho thấy tính không đồng nhất về mặt kháng nguyên so với chủng vắc xin tham chiếu gốc.
5. Đặc tính dòng dõi của HPV18: Khác với sự phân hóa cao của HPV16, các mẫu HPV18 phân lập ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến cổ tử cung chủ yếu tập trung trong dòng dõi phụ $A1$ (sublineage A1), biểu hiện sự tương đồng cao trong bảo tồn cấu trúc gen $E6/E7$.

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Xác lập cơ sở dữ liệu phả hệ phân tử hoàn chỉnh đầu tiên về các sublineage HPV16/18 tại bệnh viện chuyên khoa phụ sản tuyến cuối của miền Bắc Việt Nam, bổ sung luận cứ thực nghiệm cho thuyết tiến hóa vi mô và sự chọn lọc dòng của virus papilloma trên quần thể vật chủ người châu Á.
• Đổi mới phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình kết hợp xét nghiệm sàng lọc tự động bằng Cobas 4800 với giải trình tự Sanger đa vùng gen ($E6-E7-L1$), tạo tiền đề cho các phân tích metagenomics và giải trình tự thế hệ mới (NGS) trong giám sát dịch tễ ung thư.
• Ứng dụng lâm sàng: Hỗ trợ bác sĩ sản phụ khoa trong việc phân tầng nguy cơ bệnh nhân: những trường hợp nhiễm biến thể không thuộc dòng châu Âu (Non-European) hoặc mang đột biến E6-T350G cần được theo dõi sát sao với chu kỳ tái khám ngắn hơn do nguy cơ tái phát và tiến triển nhanh.
• Khuyến nghị chính sách y tế: Cung cấp bằng chứng thực tiễn quan trọng cho Chương trình Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia trong việc đánh giá hiệu quả bảo vệ chéo của các vắc xin HPV hiện hành (nhị giá, tứ giá, cửu giá) đối với các biến thể phụ đang lưu hành thực tế tại Việt Nam.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những phát hiện mang tính đột phá, công trình nghiên cứu ghi nhận một số hạn chế nhất định cần được hoàn thiện:

1. Giới hạn về thiết kế nghiên cứu đơn trung tâm: Nghiên cứu được tiến hành trên tập bệnh nhân tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Mặc dù đây là trung tâm chuyên khoa đầu ngành tiếp nhận bệnh nhân toàn miền Bắc, mẫu nghiên cứu có thể mang tính chọn lọc của tuyến điều trị cuối, chưa phản ánh hoàn toàn bức tranh dịch tễ học của cộng đồng nói chung.
2. Hạn chế về thiết kế cắt ngang: Chưa thiết lập được mô hình theo dõi thuần tập tiến cứu dài hạn sau phẫu thuật/hóa xạ trị để đánh giá trực tiếp mối tương quan giữa từng loại sublineage/đột biến cụ thể với tỷ lệ sống sót toàn bộ (OS) và thời gian sống không bệnh tiến triển (PFS).
3. Phạm vi giải trình tự gen: Luận án tập trung giải trình tự các vùng gen trọng yếu $E6, E7, L1$ bằng phương pháp Sanger. Mặc dù đạt độ chính xác cao cho các đoạn đích, phương pháp này chưa bao phủ toàn bộ chiều dài bộ gen virus (khoảng 8.000 bp) bao gồm vùng điều hòa $URR/LCR$ và gen $E2$ - nơi thường xuyên xảy ra đứt gãy khi virus tích hợp vào bộ gen người.

Hướng nghiên cứu tương lai:

• Hướng 1: Triển khai giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) của HPV bằng công nghệ Next-Generation Sequencing (NGS) trên quy mô mẫu đa trung tâm tại cả ba miền Bắc - Trung - Nam.
• Hướng 2: Nghiên cứu động học của tải lượng virus và trạng thái tích hợp phân tử (Integrated vs. Episomal form) của từng sublineage HPV16/18 tương ứng với đáp ứng điều trị hóa xạ trị đồng thời.
• Hướng 3: Đánh giá tương tác biểu sinh (epigenetic methylation) tại vùng điều hòa LCR của các biến thể HPV16 và tác động của nó lên mức độ ức chế miễn dịch tại chỗ.
• Hướng 4: Mở rộng nghiên cứu biến thể gen trên các tuýp HPV nguy cơ cao phổ biến khác tại Việt Nam như HPV58 và HPV52.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án cung cấp hệ thống chuỗi nucleotide chuẩn xác được đăng ký trên cơ sở dữ liệu quốc tế, đóng vai trò là tài liệu tham khảo cốt lõi cho các nghiên cứu sau đại học về ung thư phụ khoa, vi sinh y học và sinh học phân tử tại Việt Nam. Tiềm năng trích dẫn cao trong các bài báo quốc tế thuộc danh mục ISI/Scopus chuyên ngành Ung thư học và Virus học.
• Chuyển đổi thực hành chẩn đoán: Thúc đẩy các phòng xét nghiệm sinh học phân tử lâm sàng nâng cấp quy trình chẩn đoán từ định tính HPV đơn thuần sang định type chi tiết và tầm soát các chỉ dấu đột biến tiên lượng ác tính cao.
• Tác động chính sách y tế công cộng: Cung cấp số liệu khoa học xác thực giúp Bộ Y tế và các cơ quan hoạch định chính sách xây dựng chiến lược quốc gia về sàng lọc ung thư cổ tử cung, định hướng đầu tư vắc xin phòng ngừa phù hợp với đặc thù phả hệ virus của người Việt Nam.
• Ý nghĩa xã hội và kinh tế: Tối ưu hóa phác đồ điều trị bảo tồn chức năng sinh sản cho phụ nữ trẻ phát hiện bệnh ở giai đoạn tiền ung thư hoặc giai đoạn sớm (FIGO IA), giảm gánh nặng chi phí y tế và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh.

Đối tượng hưởng lợi

1. Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận mô hình nghiên cứu kết hợp lâm sàng - giải phẫu bệnh - sinh học phân tử mẫu mực; khai thác các khoảng trống nghiên cứu tiếp nối về các tuýp HPV non-16/18.
2. Bác sĩ Lâm sàng Sản Phụ khoa & Ung bướu: Sở hữu công cụ lý thuyết để giải thích các ca bệnh tiến triển nhanh bất thường ở giai đoạn sớm, từ đó cá thể hóa kế hoạch điều trị và theo dõi sát các tổn thương tiền ung thư (CIN2, CIN3).
3. Các đơn vị R&D và Công nghệ Sinh học: Sử dụng dữ liệu trình tự đột biến gen $E6, E7, L1$ để thiết kế các bộ kít chẩn đoán multiplex Real-time PCR chuyên biệt cho thị trường Việt Nam, cũng như nghiên cứu phát triển các liệu pháp miễn dịch nhắm trúng đích oncoprotein.
4. Nhà hoạch định chính sách Y tế: Có cơ sở dữ liệu dịch tễ phân tử vững chắc để xây dựng phác đồ sàng lọc quốc gia phối hợp giữa xét nghiệm tế bào học (Pap smear/ThinPrep) và xét nghiệm HPV DNA.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nền tảng nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc xác lập bằng chứng thực nghiệm về tính không đồng nhất di truyền của các biến thể HPV16/18 và mối liên hệ với kiểu hình mô bệnh học tại Việt Nam, trực tiếp mở rộng Thuyết Sinh ung thư do Virus (Viral Oncogenesis Theory) của Harald zur Hausen và Thuyết Cố định Dòng dõi (Lineage Fixation Paradigm) của Bernard & Burk. Luận án chứng minh rằng sự ác tính hóa không chỉ phụ thuộc vào sự hiện diện của genotype HPV16/18 mà còn bị điều biến bởi các đột biến nucleotide điểm trên vùng gen $E6$ (đặc biệt là đột biến T350G) và sự phân bố của các dòng phụ châu Á ($A4$) và châu Á - Mỹ ($D3$).

2. Phương pháp nghiên cứu của luận án có điểm đổi mới nào khi so sánh với ít nhất 2 nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Muñoz et al. (2003) (chỉ dừng ở mức định type bằng kỹ thuật lai phân tử diện rộng) và nghiên cứu của Xi et al. (2007) (chủ yếu tập trung vào quần thể hẹp với kỹ thuật RFLP), luận án đã thiết lập quy trình tích hợp khép kín: sử dụng hệ thống tự động hóa hoàn toàn Cobas 4800 (được FDA phê chuẩn) để sàng lọc chuẩn xác $14$ tuýp nguy cơ cao, kết hợp ngay sau đó với giải trình tự Sanger hai chiều trên cả ba vùng gen chức năng then chốt ($E6, E7, L1$). Thiết kế này đảm bảo kiểm soát sai số tối đa và nâng cao độ phân giải phả hệ học từ mức dòng (lineage) xuống tận mức dòng con (sublineage).

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu nghiên cứu là gì?

Phát hiện nổi bật là sự hiện diện đồng thời với tỷ lệ đáng kể của các sublineage không thuộc dòng châu Âu (Non-European lineages $D1, D3$) bên cạnh dòng châu Âu chiếm đa số ($A1, A2, A3, A4$). Đặc biệt, các biến thể mang đột biến điểm $E6-T350G$ xuất hiện với tần suất cao ở nhóm tổn thương ung thư xâm lấn sâu và ung thư biểu mô vảy không sừng hóa, phản ánh áp lực chọn lọc sinh học mạnh mẽ của các biến thể này trên cơ địa phụ nữ Việt Nam.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp nghiên cứu (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm có khả năng tái lập cao: từ tiêu chuẩn lấy và bảo quản mẫu bệnh phẩm cổ tử cung trong dung dịch đệm chuẩn, thông số vận hành hệ thống Cobas 4800, trình tự các cặp mồi khuếch đại gen $E6, E7, L1$, chu trình nhiệt của phản ứng PCR, đến quy trình tinh sạch sản phẩm và phân tích chromatogram trên phần mềm BioEdit/MEGA.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm (10-year research agenda) được phác thảo từ công trình này như thế nào?

Lộ trình 10 năm bao gồm: (1) Năm 1-3: Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm trên toàn quốc ứng dụng Next-Generation Sequencing giải mã toàn bộ genome (WGS) của HPV; (2) Năm 4-6: Nghiên cứu thuần tập theo dõi dọc đánh giá vai trò của các biến thể trong tái phát sau phẫu thuật khoét chóp/cắt tử cung; (3) Năm 7-10: Phát triển kít chẩn đoán phân tử phát hiện nhanh các chỉ dấu đột biến ác tính cao ($E6-T350G$) và thử nghiệm lâm sàng vắc xin điều trị tái tổ hợp nhắm vào epitope đột biến của protein E6/E7.

Kết luận

1. Khẳng định vai trò căn nguyên cốt lõi: Luận án chứng minh một cách thuyết phục rằng các genotype HPV nguy cơ cao, đặc biệt là HPV16 và HPV18, đóng vai trò quyết định trong cơ chế bệnh sinh của UTCTC tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
2. Giải mã thành công cấu trúc phả hệ phân tử: Lần đầu tiên cung cấp bức tranh chi tiết về các dòng dõi phụ (sublineages) của HPV16 ($A1, A2, A3, A4, D1, D3$) và HPV18 ($A1$) trên nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
3. Xác định các đột biến sinh ung trọng yếu: Phát hiện và định lượng tần suất các đột biến điểm then chốt gồm $350 T>G$ trên gen $E6$, $647 A>G$ trên gen $E7$ và $7060 G>A$ trên gen $L1$ của HPV16, thiết lập mối tương quan giữa các biến đổi này với mức độ tiến triển ác tính.
4. Đóng góp phương pháp luận chuẩn hóa: Thiết lập quy trình chẩn đoán phân tử đa tầng kết hợp giữa máy tự động Cobas 4800 và giải trình tự gen Sanger, đạt độ tin cậy và tính giá trị khoa học cao.
5. Cung cấp cơ sở khoa học cho y tế dự phòng: Đóng góp dữ liệu dịch tễ học phân tử thiết yếu phục vụ chiến lược giám sát dịch tễ học HPV và định hướng chính sách tiêm chủng vắc xin phòng ngừa tại Việt Nam.
6. Mở ra các hướng nghiên cứu chuyển giao: Mở đường cho các nghiên cứu ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và phát triển liệu pháp miễn dịch nhắm trúng đích oncoprotein virus trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu tiên trong chuỗi gen của HPV và là một trong các protein gây ung thư chính của HPV. Ba chức năng chính của gen E6 cũng là ba chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào vật chủ: + Protein E6 của HPV nhóm “nguy cơ cao” liên kết hoặc không liên kết với protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là mãi mãi, gây bất tử hóa tế bào. Protein E6 có khả năng gây quá sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủy DNA và gây thúc đẩy sự tiến triển của tế bào. Khả năng gây ung thư của E6 được điều hòa bởi khả năng hoạt động như giá đỡ và điều hòa tương tác protein với protein.

Một số tương tác protein mà được mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan đến E6 (E6AP), protein gắn với E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein PDZ, yếu tố điều hòa interferon 3 và đồng phần của Bcl-2 (Bak). 7 + Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 với E6AP bằng liên kết phối tử, tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải mã và ức chế ung thư, có vai trò điều hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp DNA thông qua chu kỳ nghỉ của vòng tế bào).37 Bình thường, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự nhân lên sai của DNA, gen ức chế ung thư p53 được hoạt hóa sẽ chuyển vòng tế bào sang chu kỳ nghỉ hoặc gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải mã của gen. Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào. Liên kết với gen ras trong quá trình bất tử hóa tế bào và kích thích sự phát triển của NIH 3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus.38-40  Chức năng gen E7: Protein E7 được mã hóa từ gen E7 gồm 98 acid amin, tuy nhỏ hơn protein E6 nhưng cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung thư ở tế bào chủ.

Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do: + Protein E7 có vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có địa điểm (domain) gắn Kẽm ở đầu C giúp liên kết chặt chẽ hơn với E6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào. + E7 chứa motif gắn protein pocket (LXCXE) giúp E7 gắn kết với các gen ức chế khối u (như pRb) hoặc gắn với 2 protein pocket khác là p107 và p130 làm giải phóng một số lượng lớn yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào. Protein E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” cũng như của nhóm “nguy cơ thấp” đều có khả năng gắn kết với protein pocket. Tuy nhiên, sự ưu tiên gắn kết của protein E7 với protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV.

Ái lực 8 liên kết này ở những tuýp “nguy cơ cao” cao gấp 10 lần so với ở những tuýp “nguy cơ thấp”. Thông thường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào. Ở giai đoạn phosphorin hóa, pRb ngắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều khiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép. Sang giai đoạn G1 muộn, pRb được phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/cdk, giải phóng phức hợp E2E/DP do đó các gen thúc đẩy giai đoạn S được hoạt hóa và giải mã.

Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 không cần quá trình phosphorine hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP. Sự kết hợp của E7 với pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRb và hoạt hóa tiếp theo của phức hợp E2F. Do đó, sự bất hoạt E7 của pRb tạo điều kiện cho HPV có khả năng vượt quả sự ức chế pRb trong chu kỳ tế bào.26,37,41-44  Chức năng gen L1 và L2 L1 và L2 là hai vùng gen cấu trúc còn gọi là vùng gen mã hóa muộn cho protein vỏ capsid chính và phụ. Trên kính hiển vi điện tử, vỏ capsid của HPV chứa 72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lưới 10 icosahedral T=7 với kích thước đường kính khoảng 55nm.

Gen L1 là vùng bảo tồn nhất của vi rút và được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus. Thành phần của vỏ capsid vi rút gồm protein capsid chính L1, và capsid phụ L2. Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả vi rút hoặc phân tử giống vi rút (Virus like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt với vi rút thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất vi rút, sản xuất vắc xin. Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhưng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid.

L1 và L2 bộc lộ đặc 9 hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các vi rút mới được hình thành). Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhưng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của vi rút do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa thụ thể bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm. Dịch tễ học nhiễm HPV HPV có ái tính mạnh với biểu mô và nhiễm chọn lọc sang các tế bào biểu mô da và niêm mạc nhưng không gây tình trạng nhiễm vi rút cũng như phá hủy tế bào. Hạt vi rút xâm nhập qua lớp biểu mô thông qua nhiều tổn thương rất nhỏ và lây qua lớp tế bào đáy có khả năng phân chia tế bào.

Nhiễm HPV thường xảy ra qua tiếp xúc trực tiếp ở da và niêm mạc. Tổn thương do HPV thường lành tự nhiên do cơ chế miễn dịch của cơ thể (thường là miễn dịch thông qua trung gian tế bào).3,45 HPV có thể tồn tại ở tế bào trong khoảng thời gian nhất định và có thể có biểu hiện bệnh hoặc không. Bởi vì trong quá trình biểu hiện gen và trong quá trình nhân bản mạnh của vi rút đã xảy ra hiện tượng đứt gãy đoạn gen E2 và gen E6.32,45 Có nhiều cơ chế giải thích sự lẩn trốn của HPV khỏi đáp ứng miễn dịch của vật chủ, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào. E6 và E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuất interferon, cytokine, ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt vi rút và điều hòa miễn dịch.

Gen E6 có khả năng gắn vào yếu tố 3 điều hòa interferon (IRF-3) gây ức chế chức năng hoạt hóa của yếu tố này. Đồng thời, gen E7 phản ứng với IRF-1 gây ức chế sự sao chép đối với yếu tố thúc đẩy IFN-1. Mặc dù HPV có khả năng lẩn trốn khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơ thể vật chủ, nhưng hầu hết các trường hợp nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổn thương có thể tự hết trong vòng 1 năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệ miễn dịch 10 cơ thể. Khoảng 91% HPV bị loại bỏ tự nhiên trong năm đầu sau nhiễm, và 70% xảy ra trong năm thứ hai.

Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có thể tồn tại dai dẳng ở lớp tế bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào. HPV và cơ chế bệnh sinh gây ung thư cổ tử cung Có khoảng 40 tuýp HPV lây qua đường sinh dục được phân làm 02 nhóm theo nguy cơ gây UTCTC. Theo Munoz và cộng sự (2003) tổng hợp các nghiên cứu ở 9 quốc gia đã chứng minh được các tuýp gây nguy cơ cao UTCTC là: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59; trong đó HPV16, 18 gây 70% UTCTC. Nhóm nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 45, 53, 54, 55, 66; trong đó HPV6, 11 thường gây các tổn thương nhú lành tính.3 Cơ chế bệnh sinh: Trong các trường hợp nhiễm trùng tồn tại dai dẳng do HPV nguy cơ cao, gen của HPV có thể tích hợp vào bộ gen vật chủ, dẫn đến sự cắt bỏ các gen không cần thiết, có tác dụng điều hòa của vi rút như gen E2, E4, E5, L1 và L2.

Do E2 mã hóa protein ức chế chuyển mã của E6 và E7, E2 mất đi làm cho E6 và E7 trở thành các protein được giải mã chính trong tế bào bị nhiễm. Các protein E6 và E7 làm bất hoạt các gen ức chế khối u p53 và retinoblastoma (Rb) và phá vỡ điều hòa chu trình tế bào. Từ đó các tế bào bị nhiễm HPV nguy cơ cao tạo ra sự mất ổn định bộ gen, có thể dẫn đến sự tiến triển thành ung thư.7,16,27,47 Phần lớn HPV nhiễm vào cơ thể sẽ bị tiêu diệt sau 1 thời gian vài tháng. Chỉ còn lại số ít nhiễm tiềm ẩn có khả năng gây UTCTC.

Khi bị nhiễm, HPV sẽ bám vào bề mặt tế bào biểu mô vẩy và biểu mô trụ của lớp đáy, sau đó HPV sẽ nhân lên gây tổn thương da và niêm mạc sau thời kỳ nung bệnh từ 4-8 tuần. Các tổn thương qua khoảng 3-4 tháng nữa và không lây nhiễm lớp tế bào sâu hơn. HPV tồn tại lâu dài và gây ra những rối loạn sinh sản tế bào, gây tổn thương từ nhẹ đến trung bình rồi nặng và cuối cùng dẫn đến UTCTC. 11 Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của biểu mô vảy, gọi là loạn sản nặng, ung thư tại chỗ, sẽ có khả năng phát triển rộng khỏi màng đáy để tấn công vào các lớp sâu hơn, gây xâm lấn tạo nên UTCTC giai đoạn xâm lấn.

Khoảng thời gian cho sự tiến triển thành UTCTC khi tổn thương tại chỗ CTC vào khoảng 10-20 năm. Đây chính là khoảng thời gian thuận lợi cho sàng lọc UTCTC. Nếu phát hiện sớm giai đoạn này có thể điều trị được khỏi hoàn toàn (Hình 1. Quá trình tổn thương tế bào ở cổ tử cung do HPV gây ra 1.

Chẩn đoán nhiễm HPV - Lâm sàng: + Ra khí hư hoặc không + Có u nhú ở bộ phận sinh dục - Cận lâm sàng: + Soi cổ tử cung: * Tổn thương hình khảm. * Tổn thương nhú sùi giữa là mạch máu. + Mô bệnh học: Hình ảnh tổn thương trên mô bệnh học của nhiễm HPV là các condylom. Có 3 loại condylom: 12 * Condylom phẳng.

* Condylom nhọn đỉnh. * Condylom đảo ngược hay u nhú đảo ngược.