ĐẶT VẤN ĐỀ Các phân tử nhỏ có thể được định nghĩa là các phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp có kích thước thường nhỏ hơn 1000 Da. Danh mục này bao gồm nhiều loại hợp chất hóa học khác nhau, có nguồn gốc tự nhiên hoặc dược phẩm, nhiều hợp chất trong số đó có liên quan đến sinh học, dược lý hoặc môi trường, điều này làm cho việc phát hiện và định lượng các phân tử này trở nên quan trọng trong nhiều lĩnh vực. Đương nhiên, gần như mọi tế bào đều chứa tập hợp từ 100 đến 200 phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp khác nhau, bao gồm các axit amin phổ biến, nucleotide, đường và các dẫn xuất phosphoryl hóa của chúng. Mặt khác, các phân tử tổng hợp nhỏ, do con người tạo ra hoặc được sản xuất bằng sinh học tổng hợp, đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm phân tích dược phẩm, lâm sàng, môi trường hoặc thực phẩm.
Nhiều phân tử nhỏ là chất gây ô nhiễm nổi tiếng trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các sản phẩm nông nghiệp khác. Thông thường, nhiều phân tử nhỏ được phát hiện bằng phương pháp sắc ký cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, do chi phí cao, thiết bị đo đạc cồng kềnh và yêu cầu chuyên môn cao, các phương pháp này không phù hợp cho mọi mục đích. Ngược lại, cảm biến sinh học có thể cung cấp một giải pháp thay thế rẻ hơn và nhanh hơn.
Vô số cảm biến sinh học và xét nghiệm phân tích sinh học khác nhau đã được công bố cho nhiều nhóm chất phân tích phân tử nhỏ khác nhau, từ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) truyền thống và xét nghiệm dòng chảy bên đến vi mạch và huỳnh quang hoặc cảm biến điện hóa. Một số ưu điểm của cảm biến sinh học so với các phương pháp cổ điển để phát hiện phân tử nhỏ bao gồm theo dõi thời gian thực, độ đặc hiệu cao, thời gian phản hồi nhanh, giảm tiêu thụ dung môi hữu cơ và thao tác lấy mẫu, tính di động, nhỏ gọn và dễ vận hành mà không cần nhân viên có tay nghề. Việc phát triển các cảm biến sinh học để phát hiện phân tử nhỏ thể hiện những thách thức cụ thể mà có thể không phải là vấn đề với các chất phân tích lớn hơn. Thứ nhất, các phân tử nhỏ là mục tiêu thách thức đối với nhiều yếu tố nhận dạng, đặc biệt là đối với các kháng thể vì chỉ riêng các phân tử nhỏ không thể kích thích hệ thống miễn dịch chịu trách nhiệm sản xuất kháng thể.
Do đó, các kháng thể đặc hiệu với phân tử nhỏ thường được chọn bằng cách sử dụng phân tử nhỏ này được liên hợp với phân tử mang lớn hơn, điều này đôi khi tạo ra các kháng thể đặc hiệu cho liên hợp hơn là cho các phân tử nhỏ tự do. Do kích thước nhỏ của chúng, các đoạn kháng thể tái tổ hợp có thể góp phần làm giảm liên kết không đặc hiệu và cản trở Steric thấp hơn so với kháng thể nguyên vẹn. Tuy nhiên, kháng thể tái tổ hợp hiếm khi thể hiện ái lực tốt hơn hoặc thậm chí tương tự so với kháng thể thông thường, điều này hạn chế việc sử dụng chúng để phát hiện các phân tử nhỏ có nồng độ thấp và do đó yêu cầu các yếu tố nhận biết phải có ái lực cao. 1 Công nghệ polyme in phân tử (MIP) cho phép thiết kế và chế tạo các đầu thu sinh học nhân tạo có tính chọn lọc và độ đặc hiệu được xác định trước, ứng dụng trong các lĩnh vực phân tách, phân tích, xúc tác hay cảm biến sinh hóa.
MIP thường sử dụng ma trận polyme kết hợp giữa chất cần phân tích và các gốc monome (monomer). Sau khi loại bỏ các chất phân tích (được gọi là khuôn mẫu) màng polyme sẽ xuất hiện các khuôn nhận dạng phân tử rất mạnh. Tại một số vị trí của khuôn có đính các liên kết có tính chọn lọc tương tự như đầu thu sinh học tự nhiên như kháng nguyên, kháng thể hoặc enzyme. Độ chọn lọc của MIP khá cao do dựa vào các yếu tố hình dạng, kích thước và các nhóm chức hóa học của chất phân tích.
Chính vì vậy, MIP không chỉ nhận diện các chất sinh học mà còn đặc biệt hữu ích với các chất hóa học. Ưu điểm của đầu thu sinh học nhân tạo MIP có độ bền và ổn định cao hơn so với các đầu thu sinh học tự nhiên trong các môi trường khắc nghiệt như độ pH quá cao hoặc quá thấp, áp suất cao hay nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp. MIP có thể sử dụng được trong nhiều tháng mà không có tổn thất về hiệu quả sử dụng cũng như yêu cầu bảo quản đơn giản hơn so với chất sinh học tự nhiên. Do những đặc tính này, MIP đã thu hút sự chú ý ngày càng tăng của các nhà nghiên cứu thông qua số lượng các bài báo tăng hàng năm.
MIP được xem như lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn cho các đối tác sinh học của chúng để phát triển các hướng mới trong các lĩnh vực nghiên cứu đa ngành như sắc ký, công nghệ sinh học, khoa học môi trường, an toàn thực phẩm và đặc biệt trong cảm biến sinh học. Tuy nhiên, việc ứng dụng MIP trong cảm biến sinh học vẫn còn tồn tại một số hạn chế cần khắc phục trước khi đưa ra sản phẩm thương mại. Trước hết, tính không đồng nhất của các vị trí liên kết có thể gây ra tương tác không đặc hiệu và do đó làm giảm chất lượng của tín hiệu. Để khắc phục vấn đề này, một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tổ hợp và tính toán để lựa chọn tỷ lệ monome và phân tử chất phân tích.
Thứ hai, tính chất ngẫu nhiên của quá trình polyme hóa cũng có thể ảnh hưởng đến tính đồng nhất trong việc phân bố các khuôn in trong mạng polyme, gây ra sự biến thiên không mong muốn trong khuếch tán. Để khắc phục nhược điểm này, một số phương pháp đã được áp dụng để cải thiện MIP như chuyển đổi chuỗi phân mảnh bổ sung đảo ngược (Reversible addition-fragmentation chain transfer), phản ứng trùng hợp chuyển hóa gốc nguyên tử (atom transfer radical polymeisation), khởi tạo lắng đọng hơi hóa học (Initiated chemical vapour deposition) và gắn hóa học (click-chemistry). Ngoài ra, một số phương pháp mới cũng đã được phát triển như cấu trúc lõi-vỏ, vật liệu composit lai giữa hữu cơ và vô cơ, kỹ thuật màng mỏng và quang khắc “mềm” (soft-photolithography) để tạo khuôn. Để tăng cường tín hiệu của cảm biến và mở rộng phạm vi ứng dụng, một số hình mẫu của cảm biến ứng dụng MIP đã được phát triển bao gồm đơn chất phân tích trên nhiều đế, đa chất phân tích trên mảng đế đơn, chíp vi dòng và các hệ thống lab - on - valve.
Tuy nhiên, cảm biến MIP vẫn cần các giải pháp thỏa đáng về cách thức chúng có thể được sản xuất và tích hợp một cách kinh tế vào các thiết bị hiện tại. Do đó, nghiên cứu trong luận án tập trung vào việc khắc phục hạn chế của công nghệ MIP ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa phổ tổng trở EIS phát hiện các phân tử nhỏ với chiến lược sử dụng điện cực phủ hạt nano vàng. 2 Các phân tử nhỏ được lựa chọn nghiên cứu bao gồm protein (sarcosine, 17β- estradiol), kháng nguyên Enrofloxacin và kháng sinh (Chloramphenicol, Ciproflocaxin, Norfloxacin). Đây là các chỉ dấu phân tử nhỏ đánh giá mức độ chẩn đoán bệnh, chẩn đoán việc sử dụng hoóc môn tăng trưởng và kháng sinh trong thực phẩm.
Sarcosine hay còn gọi là N-methyl glysine là chất được sinh ra trong quá trình chuyển hóa và phân giải Glysine. Năm 2009, Sreekumar và nhóm đã công bố kết quả nghiên cứu được công nhận rộng rãi về vai trò tiềm năng của sarcosine để phát hiện và chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến [129]. Nhóm nghiên cứu đã thực hiện các thực nghiệm kiểm tra so sánh khả năng chẩn đoán chính xác giữa Sarcosine và PSA với các bệnh nhân có chỉ số PSA trong dải xám (4 -10 ng/mL). Kết quả thu được cho thấy Sarcosine có chỉ số AUC cao hơn so với PSA.
Cho nên đây là một chỉ dấu sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến. 17β-estradiol, khi được tiêu thụ sẽ trải qua quá trình trao đổi chất, một số tích tụ trong các mô có ái lực và một số khác sẽ bị đào thải ra khỏi cơ thể theo đường nước tiểu. Các hợp chất bài tiết đó được phát hiện trong nước thải ở nồng độ thấp, từ vài ng/ L đến μg/ L. Điều đáng chú ý là một số nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy các tác dụng phụ liên quan đến các chất gây rối loạn nội tiết trong nước thải, bao gồm quá trình nữ hóa cá đực, giảm số lượng tinh trùng, chậm rối loạn chức năng sinh sản, vitellogenin và giảm sự nở trứng ở cá [137], [141], [142].
Ở người, estradiol có thể gây ung thư vú và tinh hoàn, thay đổi nội tiết tố, giảm khả năng sinh sản của nam giới và các vấn đề sức khỏe khác [136]. Tại Việt Nam thì một lượng lớn dược phẩm được sử dụng trên động vật bao gồm kháng sinh, vitamin và các thuốc diệt ký sinh trùng. Trong đó, kháng sinh chiếm tới 70%. Chăn nuôi lợn và gia cầm thường được bổ sung kháng sinh như Tetracycline và Tylosin còn trong nuôi trồng thủy sản là các kháng sinh nhóm Quinolones và Sulfonamides.Có khoảng 700g kháng sinh được sử dụng trên mỗi tấn cá trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, cao gấp 7 lần so với các quốc gia khác (Báo cáo từ Cục Quản lý Thực phẩm, Hà Lan, 2009, mã VWA/BuR/2009/13186).
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp, tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa hợp lý. Việc lựa chọn kháng sinh cũng như liều dùng dựa chủ yếu trên kinh nghiệm (chiếm 44%), 33% theo hướng dẫn của bác sĩ thú y và 17% theo nhà sản xuất. Nhiều chủ hộ chăn nuôi không tuân thủ quy chế về việc ngừng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch sản phẩm từ động vật. Trong 4 tháng năm 2014, có tổng cộng 11 lô tôm Việt Nam bị 2 thị trường lớn là EU và Nhật Bản phát hiện dư lượng Oxytetraxycline.
Trong đó, số lô tôm bị cảnh báo ở Nhật là 6 còn ở EU là 5 (số lô tôm bị phát hiện dư lượng kháng sinh Oxytetraxycline ở EU chỉ là 2 trong cả năm 2013). Các lô tôm bị cảnh báo có dư lượng thấp nhất là 0,3 ppm và cao nhất là 2,1 ppm (mức giới hạn cho phép đói với kháng sinh này ở EU là 0,1 ppm, ở Nhật là 0,2 ppm).
