ĐẶT VẤN ĐỀ Trong kho tàng thực vật và cây thuốc Việt Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh của người Việt, tượng trưng cho sự tinh khiết và trường thọ. Cây Sen mọc ở ao hồ, có ở khắp mọi miền đất nước, đặc biệt là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở của những cánh đồng Sen. Sen là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí, có giá trị sinh học cao. Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc từ dưới bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất nên củ, lá, hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay”.
Với sự tiến bộ của y học và khoa học kỹ thuật, thêm nhiều tác dụng dược lý quý giá của cây Sen đã được tìm ra như giảm co thắt cơ trơn [1], cầm máu [1], [12], kháng HIV [58], kháng serotonin [50], điều trị cao huyết áp [30], chống loạn nhịp tim [59], tiểu đường [35], hạ cholesterol [56], chống oxy hoá [14], [31], [44], [55], chống ung thư [42]… Trong đó, các alakaloid và flavonoid là những thành phần chính đóng góp vào các tác dụng sinh học đó. Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học phân tích, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, tiêu chuẩn hóa một số thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong cây Sen, nhằm tìm ra hướng điều trị mới hiệu quả, an toàn cũng như kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu và các chế phẩm từ Sen. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay việc sử dụng tâm Sen làm thuốc trong đông y hay các chế phẩm bào chế từ tâm Sen như thuốc viên uống, cao thuốc, các loại trà… hầu như là ở dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần. Việc xác định thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học với hàm lượng là bao nhiêu thì vẫn còn đang bỏ ngỏ do việc nghiên cứu các thành phần hóa học, tiêu chuẩn hóa các alkaloid, flavonoid này bằng kỹ thuật sắc ký hiện đại trên tâm Sen Việt Nam dùng làm chất chuẩn đối chiếu để khảo sát tác dụng sinh học cũng như việc định tính, định lượng chưa được thực hiện.
2 Do đó nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và tiêu chuẩn hóa thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong tâm Sen Việt Nam là một yêu cầu rất cần thiết nhằm góp phần bổ sung dữ liệu thành phần hóa học, nghiên cứu tác dụng sinh học, đồng thời nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu quí, được sử dụng rộng rãi trong nước, ứng dụng trong đảm bảo chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ tâm Sen mang lại hiệu quả điều trị cao và an toàn trong công tác chăm sóc sức khỏe nhân dân. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký phân tích thành phần hóa học tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae)". Với mục tiêu: - Chiết xuất, phân lập thành phần alkaloid, flavonoid có trong tâm sen Việt Nam. - Xác định độ tinh khiết các chất phân lập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang (HPLC/PDA).
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng phương pháp phổ học: NMR, MS, UV-VIS. Ý nghĩa: - Bổ sung vào cơ sở dữ liệu thành phần hoá học của cây Sen Việt Nam. - Cơ sở cho công tác tiêu chuẩn hoá chất lượng tâm Sen, góp phần nâng cao chất lượng các sản phẩm từ tâm Sen trên thị trường. - Tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về định lượng, thử tác dụng sinh học của tâm Sen sau này.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY SEN 1. Tên gọi và vị trí phân loại [1], [12] - Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn. - Tên đồng nghĩa: Nelumbium nelumbo (L.
- Tên khác: Liên, Quỳ, Ngậu (Tày), Bó bua (Thái), Lìn ngó (Dao). - Tên nước ngoài: Sacred lotus, Chinese water-lily, Indian lotus, Egypian bean. - Vị trí phân loại Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp: Magnoliopsida (Ngọc Lan) Phân lớp: Nelumbonidae (Sen) Bộ: Nelumbonales (Sen) Họ: Nelumbonaceae (Sen) Chi: Nelumbo Loài: Nelumbo nucifera Gaertn Chi Nelumbo có 2 loài là Nelumbo nucifera Gaertn. – Sen hồng và Nelumbo lutea Willd.
Các loài trong chi Nelumbo có hoa rất giống với loài hoa súng (họ Nymphaeaceae), nhưng lá 2 loài có đặc điểm riêng. Lá súng có vết khía hình chữ V đặc trưng từ mép lá vào tâm trong khi lá Sen có hình khiên hay tròn. Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbo lutea Willd.
Sen hồng và Sen trắng 4 1. Đặc điểm thực vật [1], [12], [29] Sen là loài cây thân thảo, mọc ở dưới nước. Thân rễ hình trụ mọc bò dài trong bùn, thường gọi là ngó sen hay ngẫu tiết. Lá sen mọc lên khỏi mặt nước, mép lá uốn lượn.
Cuống lá dài 1-1,5m, màu xanh, hình trụ, nhiều gai nhỏ, đính giữa phiến lá. Phiến lá hình khiên, to, đường kính 60 - 70 cm, có gân tỏa tròn. Hoa đơn độc, to, màu trắng hay đỏ hồng, đều, lưỡng tính, có mùi thơm. Quả bế màu xanh, hình bầu dục, chứa một hạt, không nội nhũ.
Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 cm, phần ngoài mỏng, cứng, màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà, bên trong có tâm Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá mầm. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến và công dụng [1], [12], [29], [45] - Lá sen (Folium Nelumbinis - liên diệp): lá bánh tẻ, thu hái vào mùa thu, bỏ cuống, phơi khô. Lá Sen khi tươi dùng để làm thuốc giải thử hay chữa cảm nắng. Lá Sen còn có tác dụng cầm máu: chảy máu cam, trĩ ra máu, xuất huyết dưới da, tử cung xuất huyết.
Khi dùng cần sao cháy, sắc uống. Ngoài ra còn tác dụng an thần, chống tim loạn nhịp, có thể phối hợp với bình vôi, lá vông. Hạt Sen, trong thành phần chứa nhiều tinh bột, nhiều acid amin không thay thế: treolin, methionin, phenylalanin, leucin, isoleusin, các acid béo: acid miristic, palmitic, oleic, linoleic, linolenic. có tác dụng bổ tỳ, kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon cơm, hoặc bổ thận trong trường hợp thận kém gây đái dầm ở trẻ em, di tinh ở nam giới.
Ngoài ra, hạt Sen còn dùng trong trường hợp trẻ em bị còi xương, suy dinh dưỡng, chậm lớn. - Tâm sen (Plumula Nelumbinis - liên tâm): chồi mầm nằm giữa hạt sen, có vị rất đắng, có tác dụng an thần, gây ngủ và hạ huyết áp. Để tăng tác dụng, có thể phối hợp với một số vị thuốc an thần khác, như lá vông, bình vôi, bá tử nhân. - Gương Sen (Receptaculum Nelumbinis - liên phòng): đã lấy quả đem phơi khô.
Gương Sen sau khi thu hái, phơi khô, khi dùng thì thái nhỏ, sao cháy, sắc uống để chữa các trường hợp chảy máu, như chảy máu cam, trĩ ra máu. 5 - Tua Sen (Stamen Nelumbinis - liên tu): chỉ nhị của hoa, bỏ đầu, phơi khô, sao đen, có tác dụng cầm máu, nhất là đường niệu, dùng trị di tinh nam giới. - Ngó Sen (Nodus Nelumbinis rhizomatis): thu hái quanh năm, làm thuốc cầm máu, chữa đại tiện ra máu, nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết. Ngày nay với nhiều nghiên cứu hiện đại, người ta đã phát hiện ra rất nhiều tác dụng sinh học có giá trị của Sen như kháng viêm [37], cải thiện thiếu máu cục bộ gan [27], cải thiện trí nhớ [38], giảm xơ hóa phổi [62], chống béo phì [39], kháng sốt rét và kháng nấm [51].
HÓA HỌC VỀ TÂM SEN 1. Thành phần hóa học của tâm Sen 1. Alkaloid [1], [14], [22] Hàm lượng alkaloid toàn phần trong tâm Sen khoảng 0,85-0,96%. Alkaloid trong tâm Sen thuộc 4 khung alkaloid chính: bisbenzylisoquinolin, benzylisoquinolin, aporphin và tetrahydroisoquinolin.
Khung bisbenzylisoquinolin Bảng 1. Cấu trúc của các alkaloid tâm Sen nhân bisbenzylisoquinolin R R1 R2 Neferin CH3 H CH3 Liensinin CH3 H H Isoliensinin H H CH3 Khung benzyisoquinolin Bảng 1. Cấu trúc các alkaloid tâm Sen nhân benzylisoquinolin R1 R2 R3 Armepavine CH3 CH3 CH3 N-methylcoclaurine CH3 H CH3 N-methylisococlaurine H CH3 CH3 6 Lotusin Demethylcoclaurin Hình 1. Cấu trúc của lotusin và demethylcoclaurin Bảng 1.
Cấu trúc hóa học alkaloid tâm Sen khung aporphin, proaporphin R1 R2 R3 Nuciferine CH3 CH3 CH3 N-nor-nuciferine CH3 CH3 H O-nor-nuciferine H CH3 CH3 Roemerine -CH2- CH3 Anonaine -CH2- H Dehydronuciferine CH3 CH3 CH3 Dehydroroemerine -CH2- CH3 Dehydroanonaine -CH2- H Pronuciferine Liriodenine Hình 1. Cấu trúc của pronuciferine và liriodenine Với khung tetrahydroisoquinolin, có một alkaloid đã biết là methylcorypallin. Ngoài ra trong tâm Sen còn có một proto alkaloid kiểu phenylalkylamin là cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol. Cấu trúc của methylcorypallin Hình 1.
Cấu trúc của cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol Tính chất lý hóa của một số alkaloid chính trong tâm Sen - Neferin: C38 H44N2O6. Bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 60-61oC. Dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước.
Dạng rắn màu trắng vô định hình. Nhiệt độ nóng chảy 95-99oC. Liensinin dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước. Dịch dầu không màu hoặc tinh thể vàng nhạt.
Nhiệt độ nóng chảy 69-71oC. Isoliensinin dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước. Flavonoid [1] Flavonol chiếm phần lớn thành phần flavonoid tâm sen, bao gồm: kaempferol, isoquercitrin, hyperosid, rutin, kaempferol-3-O-robinobiosid, isorhamnetin-3-O- rutinose. Ngoài ra còn có flavanol là catechin.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học tâm Sen Cuối thế kỷ XIX, Greshoffetal đã công bố về sự có mặt của alkaloid trong tâm Sen. Sau đó là nhiều nghiên cứu về tâm Sen đã được công bố trên thế giới. Tổng hợp các nghiên cứu về chiết xuất phân lập tâm Sen TT Năm Tác giả Nghiên cứu hóa học về Tâm sen 1 1962 Chao Tse – Phân lập liensinine, kết tinh dưới dạng muối Yuan và cộng sự liensinine perchlorate từ phân đoạn alkaloid [16]. 2 1964 Masao Tomita, Phân lập isoliensinine bằng cách kết tinh dưới và cộng sự [36].
dạng muối isoliensinine HCl. 3 1966 Hiroshi Xác định cấu trúc liensinine bẳng phổ cộng Furukawa [21]. hưởng từ hạt nhân (NMR), phân lập nuciferine, pronuciferine và lotusine. 4 1970 Tsang – Hsiung Phân lập methylcorypalline và neferine từ và Chi Minh – phân đoạn non – phenolic.
5 1970 Hideo Phân lập lotusine và demethylcoclaurine bằng Kohiyama, và sắc ký trao đổi ion. 6 1991 Wang J, Hu Phân lập và xác định cấu trúc lotusine, X, Yin W, Cai H nuciferine, neferine, pronuciferine, liensinine, [52]. 7 2000 Wang Jialing Phân lập liensinine và isoliensinine (kết tinh [53]. dưới dạng liensinine perchlorate và isoliensinine hydrochloric lần lượt trong methanol và benzen – ethylacetate (95:5)).
8 2003 Jian Yang, Phân lập neferine, isoliensinine và xác định Kailan Zhou cấu trúc bằng NMR. 9 2004 Pan Yuanjiang Phân lập neferine, liensinine, Isoliensinine và cộng sự [41]. bằng sắc ký ngược dòng liên tục.