MỞ ĐẦU Ngày nay, việc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Do các hợp chất thiên nhiên có nhiều ứng dụng trong mọi lĩnh vực của đời sống xã hội, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược, thực phẩm và thực phẩm chức năng. Phần lớn các hợp chất thuốc và các thực phẩm chức năng hiện nay đều có nguồn từ thiên nhiên. Ngoài ra, các hợp chất thiên nhiên thường có ít độc tính và nguồn nguyên liệu lại dễ kiếm, dễ tái sinh sử dụng, có khả năng phát triển thành các ngành công nghiệp bền vững.
Tuy nhiên, các hợp chất thiên nhiên thường có cấu trúc phức tạp, với nhiều mảng cấu trúc, nhiều trung tâm lập thể phức tạp với cấu hình không gian đa dạng, nên việc phân tích cấu trúc các hợp chất thiên nhiên cần nhiều kết hợp nhiều công cụ phân tích cấu trúc khác nhau. Nhiệm vụ phân tích cấu trúc này là dữ liệu đầu vào quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng sau này của các hợp chất thiên nhiên. Hiện nay, có nhiều phương pháp hóa lý khác nhau để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Kết quả phân tích thường tổ hợp của nhiều phương pháp cho biết các thông tin về nhóm chức như phổ IR, về công thức phân tử như phổ MS, về khung cấu trúc như NMR, về không gian cấu trúc như các phổ 2 chiều.
Các dữ liệu này sẽ tổ hợp lại bổ sung các thông tin cho nhau để cuối cùng nhà khoa học có thể quy gán chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất. Chi Fissistigma có nhiều loài làm dược liệu quý có trong nhiều bài thuốc dân gian của các dân tộc sinh sống ở Đông Nam Á, Trung Quốc và Ấn độ để điều trị nhiều loại bệnh thông thường. Các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học gần đây cho thấy, chi Fissistigma có nhiều hoạt tính sinh học lý thú như kháng khuẩn, nấm, chống oxy hóa, đặc biệt là kháng viêm và chống ung thư. Do đó, chi này là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nghiên 1 cứu phát triển thuốc.
Luận văn thạc sỹ này tập trung vào phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên polyphenol-glycoside từ cây Fissistigma balansae bằng các phương pháp phổ hiện đại như NMR, MS nhằm khẳng định cấu trúc không gian phức tạp của các hợp chất này để có những dữ liệu đầu cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa dược. Các phương pháp phổ hiện đại xác định cấu trúc 1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Hiện nay, có nhiều phương pháp dùng để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ, trong đó phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những phương pháp hiện đại ứng dụng để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, hợp chất phức và các hợp chất lai giữa vô cơ và hữu cơ. Phương pháp này thường được phân tích các chất tan trong các dung môi, gần đây người ta có nhiều chương trình và phương pháp thực nghiệm khác nhau mà phương pháp này có thể được đo trong dung môi hoặc không cần dung môi, hoặc đo trực tiếp dưới các dạng mẫu rắn khác nhau như polime.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên hiện tượng cộng hưởng của hạt nhân khi được đặt trong từ trường ngoài. Chỉ có hạt nhân có spin hạt nhân là số lẻ (đồng vị lẻ) mới bị cộng hưởng bởi từ trường bên ngoài. Các hạt nhân khác của các nguyên tố khác nhau thì cộng hưởng ở các từ trường khác nhau. Các hạt nhân của cùng một nguyên tố nhưng có mật độ điện tử khác nhau (tham gia vào các nhóm liên kết khác nhau) thì cộng hưởng ở các từ trường khác nhau.
Cường độ của tín hiệu thể hiện số lượng các nguyên tố tương đương về lớp electron hay tương đương về mật độ điện tích. Sự tách tinh vi của các đỉnh tín hiệu thể hiện sự tương tác khác nhau hay thể hiện không gian phức tạp của các nhóm nguyên tố tham gia cộng hưởng. Kết quả của phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho chúng ta các dữ liệu chính để xây dựng khung cấu trúc của các hợp chất cần nghiên cứu [1- 4]. Ví dụ sau đây sẽ mô tả nguyên lý của phương pháp này, ở điều kiện bình thường hạt nhân có điện tích và tích điện dương, hạt nhân luôn luôn chuyển động xung quanh trục của nó nghĩa là điện tích này chuyển động xung 3 quanh trục và tạo thành một trường riêng (µ ⃗ ) của hạt nhân.
Tiếp tục, đặt hạt ⃗ ) thì sinh ra một lực làm lệch hướng nhân này vào vào một từ trường ngoài (𝐵 ⃗ ) thì các momen từ của hạt nhân [4]. Nếu cố định tần số của từ trường ngoài (𝐵 nguyên tố khác nhau sẽ có giá trị cộng hưởng này khác nhau. Mô tả tính chất từ của hạt nhân Như mô tả ở trên, thì đại lượng đặc trưng cho khả năng cộng hưởng của một nguyên tố hoặc một nhóm nguyên tố tương đương được gọi là độ chuyển dịch hóa học (ppm): Nguyên nhân xuất hiện giá trị này là các hạt nhân khác nhau có mật độ điện tử hay lớp vỏ electron khác nhau, nói cách khác là hằng số che chắn (σ) khác nhau, vì thực tế từ trường ngoài B0 tới được hạt nhân đã bị hao hụt chỉ còn B’ vì tương tác với từ trường của các electron (Be), do vậy các nguyên tố khác nhau sẽ cộng hưởng ở các từ trường khác nhau. Trong trường hợp cùng một nguyên tố thì chúng tham gia vào các nhóm chức khác nhau, nhóm liên kết khác nhau thì mật độ điện tử hay hằng số che chắn (σ) cũng sẽ khác nhau nên giá trị cộng hưởng là khác nhau [1-4].
Mô tả sự hình thành hằng số chắn Trong các hợp chất hữu cơ thì tetramethylsilan (TMS) có hằng số chắn lớn, do mật độ điện tử lớn, người ta thường quy ước độ dịch chuyển hóa học của proton cũng như carbon trong TMS là mốc số 0. Như vậy để xác định được giá trị độ dịch chuyển dịch hóa học (δ ppm) của một nguyên tố X bất kỳ là so sánh độ chênh lệch với giá trị ở mốc là độ dịch chuyển hóa học của TMS. Độ dịch chuyển hóa học, không phụ thuộc vào cường độ từ trường bên ngoài. Độ dịch chuyển hóa học không có thứ nguyên, được hiểu là phần triệu (10-6) ký hiệu là ppm [3].10 6 a ppm 0 νTMS, νX là tần số cộng hưởng của TMS và hạt nhân, ν0 là tần số cộng hưởng của máy phổ.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của paracetamol Nguyên tử 1H, 13C ở các vị trí khác nhau trong khung cấu trúc hóa học sẽ có mật độ điện tử khác nhau nên có giá trị hằng số chắn σ khác nhau nghĩa là độ dịch chuyển hóa học sẽ khác nhau.
Do TMS là chất có hằng số chắn rất lớn, nên hầu hết các hợp chất hữu cơ đều có hằng số chắn nhỏ hơn TMS nên proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3]. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát.4: Hằng số tương tác spin-spin J: 6 Do hạt nhân của các proton luôn có từ trường riêng, nên từ trường này tương tác với các proton bên cạnh, sự tương tác này làm các đỉnh phổ tách ra khỏi nhau, người ta gọi tương tác này là tương tác spin-spin. Hằng số tương tác được xác định bằng khoảng cách giữa các đỉnh tín hiệu bị tách. Thứ nguyên của hằng số tương tác J là Hz[2].5: Cách xác định hằng số tương tác spin-spin (J) Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J cho ta thông tin về vị trí trương đối của các hạt nhân, hoặc tương quan cấu trúc của các nhóm nguyên tử hay nhóm chức với nhau.6: Hằng số J ứng dụng phân tích cấu hình của axit betulinic 1.
Phương pháp phổ khối lượng (MS) Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là: Các hợp chất hữu cơ (mẫu phân tích) bị bắn phá bởi dòng electron (hoặc điện tích, laser…) có năng lượng cao (70eV), làm các điện tử ở orbital phân tử ngoài cùng bị bứt ra tạo thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e, các ion này không bền và phân mảnh nhờ sự đứt gãy liên kết tạo thành các ion mảnh nhỏ hơn. Quá trình phân mảnh ion tuân theo nguyên tắc bảo toàn khối lượng và điện tích: M+ e- → M++ 2e- AB + e- → AB+. Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Sau khi phân tách 8 các ion này theo số khối thì ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối lượng này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [1,4]. Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc.
Phổ khối lượng của 3,4-dimethoxyacetophenone [4] Các ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng sau đó vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng [1-4]. Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.
Chi Fissistigma Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật rất đa dạng và phong phú. Đây là nguồn dược liệu quí giá phục vụ sức khỏe và cuộc sống con người. Chi Fissistigma thuộc họ Na (Annonaceae) và được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm. Việt Nam có khoảng 23 loài thuộc chi Fissistigma.