MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Tổng quan về lipase Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.3) thuộc lớp hydrolase, là enzyme hoạt động tốt tại bề mặt liên pha dầu – nƣớc. Tiềm năng xúc tác của lipase đƣợc biết đến từ năm 1930 theo công trình công bố của JBS Haldane và cộng sự [38]. Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng khác nhau nhƣ thủy phân, chuyển ester, tổng hợp ester.
Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride tạo glycerol và acid béo, đây là phản ứng đặc trƣng của lipase. Ngoài ra, trong điều kiện ít nƣớc, lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester. Các phản ứng xúc tác bởi lipase [106] đƣợc thể hiện nhƣ sau: (1) Phản ứng thủy phân (2) Phản ứng tổng hợp Phản ứng ester hóa Phản ứng amid hóa Phản ứng tổng hợp thioester 6 (3) Phản ứng chuyển ester Phản ứng thế gốc acid Phản ứng thế gốc amin Phản ứng thế gốc ancol Phản ứng chuyển vị ester 1. Nguồn thu nhận lipase Lipase đƣợc phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật.
Lipase vi sinh vật đã đƣợc một số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp. Lipase chịu nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus cũng đã đƣợc chiết tách bởi Diaza và cộng sự năm 2006 [41]. Ở động vật, lipase đƣợc thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn, và một số loại cá. Lipase ở động vật đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa lipid.
Một số tác giả đã thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12]. Trong các loại côn tr ng, lipase đƣợc tìm thấy trong cơ, huyết tƣơng, ống tiêu hóa và các tuyến nƣớc bọt. Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng khi xét đến những ƣu điểm nhƣ giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng đƣợc chấp nhận và có thể ứng dụng trực tiếp nhƣ là chất xúc tác sinh học sau quá trình tinh sạch sơ bộ [33], [75]. 7 Nguồn lipase từ thực vật rất đa dạng và phong phú, có thể thu nhận từ các nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần quy trình nuôi cấy nghiêm ngặt nhƣ lipase từ vi sinh vật.
Lipase chủ yếu hiện diện ở dạng dự trữ trong các mô của các hạt đang phát triển hoặc đặc biệt ở những nơi chứa lƣợng lớn triacylglycerol. Hoạt động lipase của hạt tăng lên trong suốt quá trình nảy mầm vì triacylglycerol cần đƣợc chuyển hoá thành glycerol và các acid béo bằng phản ứng thủy phân bởi lipase, sau đó các chất này đƣợc chuyển hoá tiếp thành các phân tử đƣờng hòa tan, vận chuyển đến các mô đang phát triển để cung cấp nguồn carbon và năng lƣợng hỗ trợ cho sự phát triển của cây non [91]. Lipase từ một số loại hạt cũng đã đƣợc các tác giả nghiên cứu chiết tách nhƣ phôi dừa (Cocos nucifera linn) [43], hạt của hoa hƣớng dƣơng [103], hạt lupin vàng nảy mầm [28], hạt nguyệt quế [59], hạt hạnh nhân [126]. Lipase cũng đƣợc nghiên cứu ở một số loại ngũ cốc nhƣ các loại đậu nành [73], yến mạch [64], cám gạo [62].
Ngoài ra lipase từ thực vật cũng có ở phần mủ của một số loại quả nhƣ mủ đu đủ [17], mủ sung [53], mủ xƣơng rồng [52]. Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase Ngày nay, hàng trăm loại lipase đã đƣợc xác định cấu trúc không gian 3 chiều trong cơ sở dữ liệu protein. Lipase từ các nguồn gốc khác nhau, thƣờng khác nhau về kích thƣớc phân tử và có rất ít các trình tự tƣơng đồng. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu các lipase đã đƣợc kết tinh cho thấy hầu hết chúng là những protein có cấu trúc α/β với một trung tâm là các cấu trúc gấp nếp β đƣợc bao quanh bởi một số dải xoắn α [106].
Theo Abdelmonaem và cộng sự (2011), mô hình enzyme Arabidopsis thaliana lipase đã đƣợc xác định có dạng monomer dạng α/β bao gồm 8 chuỗi gấp β xen lẫn với 22 chuỗi xoắn α. Lipase này cũng có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc lipase từ động vật và vi khuẩn, nhƣng chỉ khác nhau về số lƣợng của chuỗi xoắn α và gấp nếp β.1 thể hiện cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]. Trung tâm hoạt động của lipase đƣợc hình thành bởi bộ ba xúc tác bao gồm các acid amin: serine, histidine và acid aspartic/acid glutamic [72]. Trung tâm hoạt 8 động của cả lipase và protease tƣơng tự nhau về mặt hóa học nhƣng có cấu trúc khác nhau.
Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76] Hình 1. Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase và lipase [101] Chú thích: (a) Tấn công nucleophin của nhóm –OH serine vào carbon của liên kết 9 ester; (b) tứ diện trung gian; (c) acyl-enzyme trung gian và tấn công nucleophilic bằng nƣớc; (d) tứ diện trung gian; (e) enzyme tự do Do sự giống nhau của bộ ba xúc tác đƣợc tìm thấy trong lipase so với những gì đƣợc quan sát trong serine protease, nên cơ chế xúc tác lipase đƣợc cho là tƣơng tự nhƣ xúc tác của serine protease [60]. Cơ chế phản ứng xúc tác thủy phân bởi lipase đƣợc thể hiện ở Hình 1. Phản ứng bắt đầu do nhóm -OH của serine thuộc trung tâm hoạt động enzyme tấn công nucleophin vào carbon của liên kết ester trong cơ chất tạo thành phức acyl - enzyme và giải phóng ancol từ lipid.
Sau đó, phức acyl - enzyme bị thủy phân và lipase tự do đƣợc giải phóng trở lại. Tính đặc hiệu của lipase Mỗi loại lipase xúc tác chuyển hóa một loại cơ chất nhất định hay một kiểu phản ứng hóa học nhất định, đó chính là tính đặc hiệu của lipase. Theo Villeneuve (2003) và cộng sự, tính đặc hiệu của lipase có thể chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau: - Đặc hiệu cơ chất: cơ chất tự nhiên của lipase là glycerol ester. Lipase không những xúc tác thủy phân triacylglycerol (TAG), mà còn thủy phân di- và monoacylglycerol và thậm chí là phospholipid [25].
Điều này thể hiện lipase xúc tác trên các cơ chất glycerol ester có các chuỗi acid béo dài hoặc ngắn khác nhau. Tính đặc hiệu cơ chất đƣợc xác định bằng cách ủ enzyme với cơ chất và xác định hoạt độ enzyme. Cơ chất đƣợc sử dụng là các ester của p–nitrophenyl có chiều dài chuỗi carbon khác nhau. Trong một số nghiên cứu, cơ chất triglyceride với các chuỗi acid béo bão hòa, chƣa bão hòa khác nhau cũng đƣợc sử dụng để xác định tính đặc hiệu cơ chất của lipase.
Theo nghiên cứu của S. Abdekafi và cộng sự cho thấy enzyme chiết tách từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu cơ chất trên tributyrin với hoạt độ cao nhất (168 ± 9,8 U/mg) so với cơ chất trioctanoin (14 ± 3,0 U/mg) và dầu oliu (8 ± 1,3 U/mg) [17]. - Đặc hiệu vị trí (Regioselective): lipase chỉ thủy phân triacylglycerol ở vị trí liên kết C1 và C3 của glycerol, tạo ra acid béo, 2-monoacylglycerol và 1,2 hoặc 2,3 - 10 diacylglycerol, hai chất này không bền, chuyển nhóm acyl tạo sản phẩm 1,3 - diacylglycerol và 1- hoặc 3–monoacylglycerol. Đối với lipase không có tính đặc hiệu vị trí, chúng xúc tác thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành các acid béo và glycerol một cách ngẫu nhiên, tạo mono- và diacylglycerol là sản phẩm trung gian (Hình 1.
Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1, sn 3 [25] - Đặc hiệu quang học: lipase thể hiện khả năng phân biệt các dạng đồng phân trong hỗn hợp đồng phân quang học [25]. Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác Lipase là enzyme xúc tác thủy phân dầu/chất béo trong hệ dị thể và phản ứng diễn ra tại bề mặt liên pha dầu và nƣớc, do đó tốc độ phản ứng phụ thuộc phần lớn vào bề mặt liên pha [101]. Để tạo đƣợc bề mặt liên pha lớn, các hệ phản ứng khác nhau đã đƣợc nghiên cứu trong quá trình thủy phân dầu cá sử dụng lipase để xúc tác nhƣ hệ nhũ tƣơng và hệ 2 pha. - Hệ nhũ tƣơng: là hỗn hợp của hai chất lỏng không tan lẫn nhau.
Một chất (pha phân tán) đƣợc phân tán trong chất kia. Chất nhũ hóa thƣờng là chất ổn định làm bền hệ nhũ tƣơng, thƣờng là chất hoạt động bề mặt. Hạn chế chính của hệ này đối với quá trình thủy phân lipid là cần năng lƣợng lớn cho quá trình đồng hóa để tạo hệ phân tán mịn với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt thích hợp và cho quá 11 trình ly tâm tách sản phẩm, cơ chất sau phản ứng [58]. Hai loại chất lỏng khác nhau có thể tạo nên hai loại hệ nhũ tƣơng, ví dụ nhƣ nƣớc và dầu có thể tạo thành các nhũ tƣơng nhƣ nƣớc trong dầu và dầu trong nƣớc [71].
- Hệ 2 pha: là hệ trong đó tồn tại hai pha lỏng riêng biệt và các pha không trộn lẫn với nhau, chỉ các chất phản ứng hoặc sản phẩm có thể di chuyển từ pha này sang pha khác. Quá trình thủy phân dầu đƣợc tiến hành trong hệ 2 pha iso - octan/nƣớc để khắc phục một số hạn chế của hệ nhũ tƣơng. Trong hệ này, các enzyme thủy phân dễ dàng hơn và cần ít chi phí hơn. Vì cơ chất dầu đƣợc hòa tan trong iso - octan và trộn với enzyme trong pha nƣớc bằng cách khuấy trộn mà không cần năng lƣợng lớn để tạo hệ nhũ tƣơng.
Ƣu điểm của hệ này là dễ dàng phân tách chất xúc tác và sản phẩm, giảm sự ức chế của cơ chất hoặc sản phẩm. Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có thể làm biến tính enzyme khi xúc tác [29]. Lipase thực vật 1. Khả năng xúc tác của lipase thực vật Lipase thực vật đƣợc tìm thấy ở hầu hết các hạt có dầu.
Lipase có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp nhiều loại cơ chất khác nhau. Lipase từ thực vật có một số ƣu điểm vƣợt trội hơn so với lipase từ động vật, vi sinh vật bao gồm: có tính đặc hiệu cao, giá thành thấp và đƣợc thu nhận từ những nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần đến công nghệ biến đổi gen để tạo ra [25]. Lipase thực vật đƣợc chiết tách thô từ các nguồn sẵn có nhƣ các loại hạt, mủ các loại quả, phụ phẩm nông nghiệp có thể đƣợc ứng dụng trực tiếp ngay trong thực phẩm mà không độc hại đối với con ngƣời. Do đó, việc khai thác nguồn enzyme lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm năng đem lại những lợi ích lớn về mặt kinh tế cho ngành công nghệ enzyme.
