MỞ ĐẦU Chitosan là một sản phẩm deacetyl của chitin - polymer tự nhiên có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua,. Chitosan không độc hại và có nhiều đặc tính sinh học quan trọng như: tương hợp sinh học, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hoá, kích thích cơ chế phòng vệ ở thực vật,. nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống như lĩnh vực thực phẩm, y dược, nông nghiệp, bảo vệ môi trường, … [137], [138], [204]. Tuy vậy, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, chỉ hòa tan trong môi trường acid và khi tan tạo ra dung dịch có độ nhớt cao nên khó sử dụng trong thực tế.
Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy từ chitosan có thể thủy phân tạo thành chitosan có trọng lượng phân tử nhỏ với nhiều nhóm NH2 tự do và hòa tan trong nước [86], [201]. Do đặc điểm trên, chitosan có khối lượng phân tử nhỏ có nhiều đặc tính sinh học cao hơn chitosan như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kích thích sinh trưởng nên được sử dụng trong nhiều lĩnh vực hơn, đặc biệt là trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng và bảo quản rau quả sau thu hoạch [61], [138], [164], [206], [210]. Hiện có một số phương pháp cắt mạch chitosan tạo ra chitosan trọng lượng phân tử nhỏ, hòa tan trong nước như phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng enzyme,. Trong đó, phương pháp cắt mạch bằng hóa học hiện đang được nhiều nhà khoa học sử dụng do có lợi thế là dễ ứng dụng ở qui mô công nghiệp và thời gian thủy phân ngắn [119], [139], [163], [198], [199], [205].
Việt Nam là một trong những nước nông nghiệp có nhiều loại sản phẩm rau quả không chỉ được tiêu dùng trong nước mà còn được xuất khẩu ra nước ngoài. Theo thống kê của Cục Chế biến và Phát triển thị trường nông sản (Bộ NNPTNT), giá trị xuất khẩu rau quả 10 tháng năm 2018 ước đạt 3,3 tỷ USD, tăng 15,5% so với cùng kỳ năm 2017. Tuy nhiên, việc xuất khẩu rau quả của Việt Nam hiện chưa tương xứng với tiềm năng vốn có của đất nước. Nguyên nhân chủ yếu là do rau quả dễ bị hư hỏng sau thu hoạch do tác động của vi khuẩn, nấm mốc,.
Trong số đó, bệnh thán thư là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng trên một số rau quả như xoài, chuối, đu đủ, cà chua, ớt. tác nhân gây bệnh là vi nấm Colletotrichum spp. Vi nấm Colletotrichum spp. thường nhiễm trên quả từ lúc còn non đến khi thu hoạch, bảo quản và vận chuyển.
2 Bệnh thường xuất hiện ban đầu với những đốm nhỏ hình tròn có màu nâu hoặc nâu đen sau lan ra và cuối cùng gây thối hỏng rau quả [18], [60], [70], [182]. Để khống chế bệnh thán thư phát triển trên rau quả sau thu hoạch, người ta thường xử lý rau quả bằng các loại thuốc diệt nấm tổng hợp như Imazalil, Benomyl,. [18], [85], [183] dẫn tới việc lạm dụng thuốc hoá học gây nên mối nguy đối với sức khỏe của người tiêu dùng cũng như gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Để khắc phục tình trạng lạm dụng hóa chất, các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến các tác nhân sinh học, có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại, có hoạt tính kháng nấm phòng trừ bệnh thán thư trên rau quả,.
Trong đó, chitosan và đặc biệt là chitosan khối lượng phân tử thấp đã được một số nhà nghiên cứu rất quan tâm. Chitosan khối lượng phân tử thấp có khả năng kháng nấm cao và dễ tạo màng bám trên rau quả nên giúp hạn chế sự biến đổi sau thu hoạch và kéo dài thời gian bảo quản rau quả [41], [48], [49], [127], [128], [130], [155], [207]. Tuy thế, hiện có rất ít các công trình công bố về lĩnh vực này. Do vậy việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp.
gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch” là cần thiết. * Mục tiêu của luận án Tạo được chitosan khối lượng phân tử thấp, tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide. * Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu tối ưu hoá quá trình thu nhận WSC (water-soluble chitosan) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch sử dụng hydrogen peroxide. 2) Phân lập và định danh một số chủng Colletotrichum spp.
gây bệnh thán thư trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch. 3) Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch bằng chế phẩm WSC ở điều kiện in vitro và in vivo. 4) Đánh giá khả năng bảo quản xoài, chuối và ớt sau thu hoạch bằng WSC.
3 * Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa việc thu nhận WSC từ chitosan thương mại bằng phương pháp cắt mạch sử dụng hydrogen peroxide và sử dụng WSC để kháng bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) nhằm kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối và ớt. Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ minh chứng và bổ sung lý thuyết về kỹ thuật sản xuất chitosan tan trong nước, có hoạt tính sinh học kháng bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là tiền đề để các doanh nghiệp sử dụng WSC trong phòng chống bệnh thán thư nhằm kéo dài thời gian bảo quản rau quả sau thu hoạch - đây chính là cơ sở để tạo ra một nền nông nghiệp “sạch” bền vững hướng tới đẩy mạnh xuất khẩu rau quả. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC 1.
Giới thiệu về chitosan và chitosan hoà tan trong nước Chitosan là một polyme có nguồn gốc từ chitin - một loại polymer sinh học phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, lần đầu tiên được biết đến vào năm 1884. Trong tự nhiên, chất chitosan rất hiếm và chỉ có ở màng tế bào nấm mốc thuộc họ Zygemyceces và ở vài loài côn trùng như thành bụng của các mối chúa, ở một vài loại tảo. Ngoài ra nó có nhiều trong vỏ động vật giáp xác tôm, cua, ghẹ và mai mực. Vì vậy vỏ tôm cua ghẹ là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất chitin-chitosan và dẫn xuất của chúng.
Cấu tạo hoá học của chitosan tương tự với cellulose, chỉ khác một nhóm chức ở vị trí C2 của mỗi đơn vị D-glucose (thay nhóm hydroxyl ở cellulose bằng nhóm amino ở chitosan), nhưng tính chất của chúng lại khác nhau. Tên hoá học của chitosan là: Poly-b-(1,4)-D-glucosamine, hay còn gọi là poly-b- (1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Công thức cấu tạo: CH2OH CH2O CH2O O H O O H O O OH O OH OH O NH2 NH2 NH2 Công thức phân tử: (C6H11O4N)n Tuy nhiên trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan. Vì vậy công thức chính xác của chitosan được thể hiện như sau [15], [137]: CH2OH CH2OH O O O O O OH OH NH2 n NHCOCH3 m Trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa-DD (Degree of deacetylation).
Là một polysaccharides với khối lượng phân tử lớn, chitosan dễ tan trong dung dịch acid HCl, acid lactic, acid acetic loãng (1% hoặc 0,1M) và một số acid hữu cơ 5 khác, không tan trong cồn, môi trường trung tính và kiềm. Tính tan của chitosan thường được kiểm tra trong dung dịch 1% hoặc 0,1M acid acetic. Độ hòa tan của chitosan là một thông số rất khó kiểm soát, bởi vì nó phụ thuộc nhiều vào mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử, nồng độ ion, pH, sự phân bố của các nhóm acetyl trong mạch polymer của chitosan, cũng như phương pháp, điều kiện tách chiết, thu hồi và sấy chitosan. Ngoài ra, độ hòa tan của chitosan còn phụ thuộc vào liên kết hydro hình thành giữa các nhóm hydroxyl (-OH) trong cấu trúc của chitosan [6].
Khác với chitosan, sản phẩm thủy phân của chitosan có thể hòa tan trong nước do mạch phân tử ngắn và có mặt của các nhóm NH2 tự do có trong các mắt xích D- glucosamine. Tùy thuộc mức độ polymer hóa (degree of polymerization-DP) của quá trình thủy phân chitosan có thể chia sản phẩm thủy phân chitosan thành 2 loại: chitosan có khối lượng phân tử thấp (low molecular weight chitosan-LMWC) và chitosan oligosaccharides (oligochitosan). Oligochitosan có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn LMWC do có độ DP thấp hơn (thường DP từ 2 - 10, khối lượng phân tử dưới 10 kDa), tuy nhiên việc phân biệt LMWC và oligochitosan thông qua DP không rõ ràng [138]. Các phương pháp thuỷ phân cắt mạch chitosan Tương tự các polysaccharide khác, do tồn tại các liên kết β-1,4 glycoside không bền trong mạch phân tử nên chitosan cũng có thể bị thuỷ phân cắt mạch bằng các tác nhân vật lý, hoá học và enzyme.
Để điều chế LMWC và oligochitosan, 2 phương pháp hóa học và enzyme đã được nghiên cứu, ứng dụng phổ biến. Trong đó, phương pháp thủy phân bằng hóa học đang được sử dụng chủ yếu ở qui mô công nghiệp. Phương pháp thủy phân cắt mạch chitosan bằng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học và vật lý nhờ giảm thiểu khả năng biến đổi hóa học không có lợi và tăng hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân. Chitosan với các mức độ DD khác nhau có thể chia thành 4 loại dựa vào sự phân bố ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside trong cấu trúc của chúng, bao gồm: chitosan với những liên kết giữa 2 đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc-GlcNAc), giữa N-acetyl-D-glucosamine và D-glucosamine (GlcNAc-GlcN), giữa D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine (GlcN-GlcNAc), và giữa 2 đơn phân D-glucosamine (GlcN-GlcN).
Các kiểu liên kết này có thể bị thủy phân bởi nhiều loại enzyme khác nhau. Tuy vậy do tính đặc hiệu 6 của các enzyme thủy phân chitosan (có khả năng cắt đứt 4 kiểu liên kết trong mạch chitosan đã được deacetyl từng phần) phụ thuộc rất lớn đến độ DD của chitosan, tính đồng nhất của đầu khử và không khử của mạch chitosan. Chính điều này đã làm hạn chế khả năng ứng dụng ở qui mô công nghiệp của phương pháp enzyme [45], [46]. Cho đến nay một loạt các enzyme chitosanase đã công bố chủ yếu được chiết xuất từ 2 nguồn: nấm mốc và vi khuẩn.
Ngoài ra các đặc tính hóa sinh của một số chitosanase từ các vi sinh vật khác cũng được tóm lược bởi Xia và cộng sự [205]. Trong số đó chitosanase chiết xuất từ Bacillus pumilus BN-262 được nhiều nhóm tác giả sử dụng trong nghiên cứu sản xuất LMWC và oligochitosan cho kết quả rất khả quan. Chitinase cũng đã được xác nhận như một enzyme có khả năng thủy phân chitosan với độ deacetyl khác nhau do tồn tại các gốc N-acetyl-D-glucosamine trong mạch phân tử chitosan [46].