Nghiên cứu tỷ lệ biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong ung thư đại trực tràng

Luận án tiến sĩ phân tích tỷ lệ biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong carcinôm tuyến đại trực tràng, cung cấp hiểu biết sâu về cơ chế bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Hồng Phong
• Người hướng dẫn: Huỳnh Quyết Thắng
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh và pháp y
• Đề tài: Nghiên cứu tỷ lệ các biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.2. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TRONG BỆNH SINH CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG
• 1.3. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA CARCINÔM ĐẠI - TRỰC TRÀNG
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ GEN, PROTEIN LIÊN QUAN ĐƢỜNG TRUYỀN TÍN HIỆU HẠ NGUỒN EGFR
• 1.5. TỔNG QUAN ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3. Y ĐỨC
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG
• 3.2. BIỂU HIỆN PROTEIN PTEN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG
• 3.3. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA
• 4. CHƯƠNG 4
• 4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG
• 4.2. BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN PTEN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC, LÂM SÀNG
• 4.3. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU
• PHỤ LỤC 2: PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Tóm tắt

I. Tỷ lệ biến đổi phân tử trong ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu tập trung vào tỷ lệ biến đổi phân tử của các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong ung thư đại trực tràng. Các biến đổi này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh và tiên lượng bệnh. KRAS và NRAS là các gen liên quan đến đường truyền tín hiệu RAS/RAF/MAPK, trong khi PIK3CA và PTEN tham gia vào đường PI3K/PTEN/Akt. BRAF cũng là một gen quan trọng trong quá trình tăng sinh tế bào. Các đột biến ở các gen này có thể dẫn đến kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích EGFR.

1.1. Vai trò của KRAS và NRAS

KRAS và NRAS là hai gen thường xuyên bị đột biến trong ung thư đại trực tràng. Các đột biến này làm tăng hoạt động của đường truyền tín hiệu RAS/RAF/MAPK, dẫn đến tăng sinh tế bào không kiểm soát. Nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến KRAS xuất hiện ở khoảng 40-50% bệnh nhân, trong khi NRAS ít phổ biến hơn. Các đột biến này cũng liên quan đến khả năng kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích EGFR.

1.2. Đột biến BRAF và PIK3CA

BRAF và PIK3CA là hai gen khác có tỷ lệ đột biến đáng kể trong ung thư đại trực tràng. Đột biến BRAF thường liên quan đến tiên lượng xấu và khả năng kháng thuốc. PIK3CA đóng vai trò trong đường truyền tín hiệu PI3K/PTEN/Akt, và các đột biến ở gen này có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng đột biến PIK3CA có thể là yếu tố thuận lợi cho việc sử dụng aspirin trong điều trị hỗ trợ.

II. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu về tỷ lệ biến đổi phân tử của các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán ung thư và điều trị ung thư. Các biến đổi này được sử dụng như dấu ấn sinh học để tiên đoán đáp ứng điều trị với các liệu pháp nhắm trúng đích. Đặc biệt, đột biến KRAS và NRAS là các yếu tố tiên lượng kháng thuốc cetuximab và panitumumab.

2.1. Chẩn đoán phân tử

Việc xác định đột biến gen trong ung thư đại trực tràng giúp cải thiện độ chính xác của chẩn đoán ung thư. Các kỹ thuật như giải trình tự gen Sanger được sử dụng để phát hiện các đột biến mới. Nghiên cứu này cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân tích sinh học phân tử trong việc xác định các biến đổi gen liên quan đến bệnh.

2.2. Điều trị nhắm trúng đích

Các đột biến gen như KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN có vai trò quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị ung thư. Bệnh nhân có đột biến KRAS hoặc NRAS thường không đáp ứng với các liệu pháp nhắm trúng đích EGFR. Ngược lại, đột biến PIK3CA có thể là yếu tố thuận lợi cho việc sử dụng aspirin trong điều trị hỗ trợ.

III. Ý nghĩa tiên lượng và thực tiễn

Nghiên cứu về tỷ lệ biến đổi phân tử trong ung thư đại trực tràng không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh mà còn có ý nghĩa tiên lượng bệnh. Các đột biến ở KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN liên quan đến tiên lượng xấu và khả năng tái phát bệnh. Nghiên cứu này cũng góp phần vào việc phát triển các phương pháp y học chính xác trong điều trị ung thư đại trực tràng.

3.1. Tiên lượng bệnh

Các đột biến gen như KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN có liên quan đến tiên lượng bệnh. Đột biến BRAF thường liên quan đến tiên lượng xấu, trong khi mất biểu hiện PTEN cũng là yếu tố tiên lượng không thuận lợi. Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng để dự đoán diễn tiến bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có giá trị thực tiễn cao trong việc áp dụng y học chính xác vào điều trị ung thư đại trực tràng. Việc xác định các đột biến gen giúp cá nhân hóa phương pháp điều trị, từ đó cải thiện hiệu quả và giảm tác dụng phụ. Đây là bước tiến quan trọng trong việc nâng cao chất lượng điều trị cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư đại - trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đáng kể trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (GLOBOCAN 2012), toàn cầu ghi nhận khoảng 1,36 triệu trường hợp mắc mới và 694.000 ca tử vong do ung thư đại - trực tràng mỗi năm, đứng hàng thứ 5 trong các nguyên nhân tử vong do ung thư. Tại Việt Nam năm 2012, bệnh lý này đứng hàng thứ tư về số lượng mắc mới (khoảng 8.768 ca) và tử vong (khoảng 5.976 ca) ở cả hai giới; số ca lưu hành 5 năm ghi nhận đến năm 2010 là 18.844 ca, chiếm 8,9% tổng số bệnh nhân ung thư.

Trong thực hành điều trị ung thư đại - trực tràng giai đoạn tiến xa hoặc di căn, các liệu pháp nhắm trúng đích phân tử thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) bằng các kháng thể đơn dòng như cetuximab và panitumumab kết hợp với các phác đồ hóa trị chuẩn (như FOLFOX hoặc FOLFIRI) đã chứng minh khả năng cải thiện thời gian sống còn. Tuy nhiên, việc xác định biểu hiện protein EGFR đơn thuần bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch không phản ánh chính xác khả năng đáp ứng điều trị: tỷ lệ đáp ứng ở nhóm có EGFR dương tính chỉ đạt dưới 25%, trong khi một số trường hợp EGFR âm tính trên hóa mô miễn dịch vẫn ghi nhận đáp ứng lâm sàng. Các nghiên cứu sinh học phân tử quốc tế đã chứng minh rằng các đột biến tăng chức năng ở các gen thuộc dòng thác truyền tín hiệu hạ nguồn EGFR (gồm lộ trình RAS/RAF/MAPK và PI3K/PTEN/Akt) hoặc sự mất biểu hiện protein đè nén u PTEN là nguyên nhân chính gây ra tình trạng kháng thuốc đối với cetuximab và panitumumab. Bên cạnh đó, tình trạng đột biến gen PIK3CA còn là dấu ấn phân tử liên quan đến hiệu quả điều trị hỗ trợ bằng aspirin nhằm hạn chế tái phát.

Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án được thực hiện, các khảo sát về đột biến phân tử trong ung thư đại - trực tràng còn hạn chế. Phần lớn các công trình trước đây chỉ tập trung vào gen KRAS và sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen (chỉ phát hiện các đột biến đã biết, không phát hiện được đột biến mới). Việc khảo sát đồng thời các đột biến trên các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA kết hợp với đánh giá biểu hiện của protein PTEN bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger trực tiếp và hóa mô miễn dịch chưa được thực hiện đầy đủ trên quần thể bệnh nhân trong nước.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Hồng Phong, chuyên ngành Giải phẫu bệnh và pháp y (Mã số: 62720105), thực hiện tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2017 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Huỳnh Quyết Thắng và TS.BS. Hoàng Anh Vũ, mang tên: "Nghiên cứu tỷ lệ các biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng".

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể gồm hai nội dung:

1. Khảo sát một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng.
2. Xác định tỷ lệ đột biến KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, tình trạng mất biểu hiện protein PTEN và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm các mẫu mô carcinôm tuyến đại - trực tràng được chẩn đoán mô bệnh học, thu thập và phân tích tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cùng các cơ sở y tế liên kết, áp dụng quy chuẩn phân loại mô bệnh học của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2010) và hệ thống phân kỳ giai đoạn TNM.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các cơ sở lý luận kinh điển và cập nhật về dịch tễ học, cơ chế sinh bệnh học phân tử và đặc điểm bệnh học giải phẫu của ung thư đại - trực tràng:

• Về dịch tễ học: Điểm lại các công bố quốc tế từ IARC/GLOBOCAN (Ferlay J. và cộng sự, 2012) về sự khác biệt xuất độ chuẩn theo tuổi giữa các khu vực địa lý (cao nhất ở Úc, New Zealand, Bắc Âu; thấp nhất ở Tây Phi); ghi nhận của Jemal A. (2011), Center M.M. (2009); cùng các dữ liệu trong nước của Nguyễn Bá Đức và cộng sự (2007) tại Hà Nội, Huỳnh Quyết Thắng và cộng sự (2010) tại Cần Thơ về thứ hạng mắc và tử vong theo giới tính.
• Về cơ chế bệnh sinh phân tử: Luận án hệ thống hóa ba lộ trình sinh ung thư đại - trực tràng chính:
  1. Lộ trình bất ổn định nhiễm sắc thể (BOĐNST / CIN): Dựa trên mô hình chuỗi biến đổi nhiều giai đoạn của Vogelstein B. và cộng sự (1988, 2013), Fearon E.R. (1990), Worthley D.L. (2007), Pino M.S. (2010), đi từ ổ tuyến bất thường niêm mạc (ACF) đến u tuyến sớm, u tuyến tiến triển và ung thư xâm lấn thông qua sự tích lũy biến đổi tại các gen APC (5q21), KRAS (12p12), mất đoạn 18q (SMAD2, SMAD4, DCC) và đột biến/mất dị hợp tử gen p53 (17p13), cùng các khiếm khuyết trạm kiểm soát phân bào (hBUB1, hBUBR1).
  2. Lộ trình bất ổn định vi vệ tinh (BOCVVT / MSI): Dựa trên các công trình của Thibodeau S.N. (1993), Ionov Y. (1993), Boland C.R. và Goel A. (2010), Rustgi A.K. (2007), mô tả sự suy giảm chức năng hệ thống sửa lỗi bắt cặp sai (SLBCS / MMR) gồm 7 protein thiết yếu (MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, PMS2) hoạt động theo các phức hợp dị phối tử. Tình trạng này dẫn tới hội chứng ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp (HNPCC / Lynch syndrome) do đột biến dòng mầm, hoặc dạng ung thư rải rác ngẫu nhiên do bất hoạt biểu sinh gen MLH1 hoặc methyl hóa gen MGMT.
  3. Lộ trình kiểu hình methyl hóa đảo CpG (CIMP / Serrated pathway): Dựa trên nghiên cứu của Toyota M. (1999), Issa J.P. (2004), Jass J.R. (2007), Leggett B. và Whitehall V. (2010), phân tích hiện tượng giảm methyl hóa toàn bộ bộ gen kết hợp tăng methyl hóa chọn lọc vùng promoter của các gen đè nén u (như p16, MLH1, các dấu ấn họ MINT).
• Về đường truyền tín hiệu hạ nguồn EGFR và đột biến gen: Luận án đối chiếu các nghiên cứu của Lievre A. (2006), Karapetis C.S. (2008), Amado R.G. (2008), Van Cutsem E. (2009), De Roock W. (2010), Krasinskas A.M. (2011), Vaughn C.P. (2011), Loupakis F. (2009), Tong J.H. (2014) và cơ sở dữ liệu COSMIC của Viện Sanger (2016). Các công trình này xác định rằng đột biến tại exon 2 (codon 12, 13), exon 3 (codon 61), exon 4 (codon 117, 146) của KRAS và NRAS, đột biến exon 15 (V600E, K601E) của BRAF, đột biến exon 9 và exon 20 của PIK3CA, cũng như sự mất biểu hiện protein PTEN (Sawai H., 2008; Mao C., 2013) có giá trị tiên đoán đáp ứng kém với thuốc ức chế EGFR. Ngoài ra, các công bố của Chan A.T. (2012), Liao X. (2012) khẳng định đột biến PIK3CA liên quan đến hiệu quả dự phòng tái phát của aspirin.
• Tại Việt Nam: Các tác giả Hồ Hữu Thọ (2012), Bùi Ánh Tuyết (2013), Tạ Thành Văn (2014) đã báo cáo tỷ lệ đột biến KRAS bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen. Hoàng Anh Vũ (2013) là nghiên cứu đầu tiên áp dụng giải trình tự Sanger trực tiếp để khảo sát gen KRAS.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là thực hiện khảo sát đồng bộ toàn bộ bảng dấu ấn gồm 4 gen (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA) bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger trực tiếp (tiêu chuẩn vàng cho phép phát hiện mọi đột biến điểm và đột biến mới) kết hợp kỹ thuật COLD-PCR và xác định tỷ lệ mất biểu hiện protein PTEN bằng hóa mô miễn dịch, từ đó thiết lập bức tranh phân tử đầy đủ và phân tích mối tương quan của các dấu ấn này với các đặc điểm bệnh học lâm sàng tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các lộ trình phân tử

Hệ thống thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR / ErbB1 / HER1) thuộc họ thụ thể tyrosine kinase màng tế bào. Khi gắn kết với phối tử (EGF, TGF-α), thụ thể hình thành cấu trúc bắt cặp cùng loại (homodimerization) hoặc bắt cặp khác loại (heterodimerization), kích hoạt hoạt tính tyrosine kinase nội bào tự phosphoryl hóa, khởi phát hai lộ trình chính:

• Gen và protein KRAS, NRAS: Nằm trên nhiễm sắc thể 12p12.1 (KRAS) và 1p13 (NRAS). Mã hóa các protein GTPase 21 kDa đóng vai trò công tắc phân tử. Khi liên kết GTP (nhờ yếu tố trao đổi nucleotid Guanine - GEF như SOS1), protein ở trạng thái hoạt hóa; khi thủy phân GTP thành GDP (nhờ protein hoạt hóa GTPase - GAP), protein chuyển sang trạng thái bất hoạt. Đột biến điểm làm mất hoạt tính GTPase nội tại hoặc cản trở tương tác với GAP, dẫn đến protein bị khóa vĩnh viễn ở trạng thái hoạt động.
• Gen và protein BRAF: Nằm tại 7q34, mã hóa serine/threonine-protein kinase gồm 766 acid amin với 3 domain: RBD (gắn RAS), CRD (giàu cysteine) và KD (kinase domain). Đột biến (chủ yếu tại exon 15, điển hình là V600E hoặc K601E) làm tăng hoạt tính kinase độc lập với tín hiệu thượng nguồn từ RAS.
• Gen và protein PIK3CA: Nằm tại 3q26.32, gồm 21 exon, mã hóa tiểu đơn vị xúc tác p110α (1068 acid amin, 124 kDa) của phức hợp PI3K nhóm IA. Protein gồm 5 domain: p85-binding, RAS-binding, C2, Helical (thường đột biến ở exon 9, codon 542, 545) và Kinase (thường đột biến ở exon 20, codon 1047, 1055, 1057). PIK3CA xúc tác gắn gốc phosphate vào vị trí D3 của PIP2 tạo thành PIP3.
• Protein PTEN: Gen đè nén u tại 10q23.3, mã hóa enzym phosphatase kép có hoạt tính lipid phosphatase đặc hiệu, thực hiện khử phosphate tại vị trí D3 của PIP3 chuyển ngược thành PIP2, từ đó ức chế trực tiếp lộ trình sống còn tế bào Akt/mTOR. Mất biểu hiện PTEN dẫn đến việc tích tụ PIP3 và hoạt hóa quá mức Akt.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích tương quan.
• Mẫu nghiên cứu: Các khối nến mô bệnh học chứa bệnh phẩm carcinôm tuyến đại - trực tràng được phẫu thuật cắt bỏ, đã được cố định formalin và đúc khối paraffin.
• Phân tích giải phẫu bệnh - mô bệnh học: Nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) thường quy để xác định dạng mô học theo phân loại WHO 2010 (carcinôm tuyến không đặc hiệu, carcinôm tuyến dạng nhầy, carcinôm tế bào nhẫn, carcinôm dạng tủy, v.v.), phân độ mô học dựa trên tỷ lệ tạo cấu trúc ống tuyến (Độ 1: biệt hóa rõ >95%; Độ 2: biệt hóa vừa 50-95%; Độ 3: biệt hóa kém >0-<50%; Độ 4: không biệt hóa), đánh giá mức độ xâm lấn u (pT), di căn hạch vùng (pN) và di căn xa (pM) theo bảng phân loại TNM.
• Kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (IHC): Sử dụng kháng thể đơn dòng kháng PTEN trên các lát cắt mô bệnh phẩm để đánh giá sự hiện diện hoặc mất biểu hiện của protein PTEN tại nhân và bào tương của tế bào ung thư, đối chiếu với mô đệm hoặc niêm mạc lành làm chứng nội tại.
• Kỹ thuật Sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA từ vùng mô u trên lát cắt paraffin (được khoanh vùng bởi bác sĩ giải phẫu bệnh nhằm đảm bảo tỷ lệ tế bào u đạt tiêu chuẩn).
  • Kỹ thuật COLD-PCR (Co-amplification at Lower Denaturation temperature PCR) nhằm làm giàu các phân tử DNA mang đột biến hiếm hoặc tỷ lệ thấp trước khi giải trình tự.
  • Kỹ thuật Cycle Sequencing (chu kỳ luân nhiệt giải trình tự) và phân tích trình tự DNA trực tiếp bằng hệ thống điện di mao quản tự động theo nguyên lý Sanger trên các đoạn khuếch đại chứa các điểm nóng đột biến:
    • KRAS: Exon 2 (codon 12, 13), Exon 3 (codon 61), Exon 4 (codon 117, 146).
    • NRAS: Exon 2 (codon 12, 13), Exon 3 (codon 61).
    • BRAF: Exon 11 và Exon 15 (đặc biệt codon 600, 601).
    • PIK3CA: Exon 9 (vùng helical) và Exon 20 (vùng kinase).
• Xử lý số liệu: Thống kê mô tả (tần số, tỷ lệ phần trăm) và thống kê phân tích (kiểm định Chi bình phương hoặc Fisher's exact test) nhằm tìm mối liên quan giữa đột biến gen/mất biểu hiện protein với các thông số lâm sàng và giải phẫu bệnh.
• Y đức: Đề tài tuân thủ các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu y sinh học, sử dụng mẫu bệnh phẩm với phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu và mã hóa danh tính bệnh nhân.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày cơ sở lý thuyết toàn diện về giải phẫu bệnh, dịch tễ học và sinh học phân tử của ung thư đại - trực tràng:

• Phân tích chi tiết 3 lộ trình sinh ung thư: Lộ trình BOĐNST (chiếm 70-85% trường hợp, khởi đầu bằng bất thường APC, qua KRAS, mất 18q/SMAD4 và kết thúc bằng p53); Lộ trình BOCVVT (chiếm khoảng 15-20%, liên quan đến mất chức năng hệ thống sửa lỗi bắt cặp sai SLBCS gồm 7 protein MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, PMS2, phân tích trên bộ 5 dấu ấn vi vệ tinh tiêu chuẩn như BAT25); và Lộ trình methyl hóa đảo CpG (CIMP, liên quan đến lộ trình u răng cưa, tăng methyl hóa promoter của MLH1, p16, MGMT).
• Mô tả phân loại mô bệnh học theo WHO 2010 gồm 11 nhóm mô học: carcinôm tuyến không đặc hiệu (chiếm 90%), carcinôm tuyến dạng nhầy (>50% thể tích nhầy ngoại bào), carcinôm tế bào nhẫn (>50% tế bào nhẫn chứa không bào nhầy đẩy lệch nhân), carcinôm dạng tủy (tế bào nhân bọng, xâm nhập dày đặc lymphô bào, luôn đi kèm MSI-H), carcinôm tuyến loại trứng cá dạng sàng, carcinôm vi nhú, carcinôm tuyến răng cưa, carcinôm gai - tuyến, carcinôm tế bào hình thoi, carcinôm tế bào gai và carcinôm không biệt hóa.
• Phân tích cấu trúc phân tử và vị trí nhiễm sắc thể của các gen: KRAS (12p12.1), NRAS (1p13), BRAF (7q34), PIK3CA (3q26.32) và PTEN (10q23.3).
• Tổng hợp các kiểu đột biến điểm kinh điển của KRAS theo dữ liệu COSMIC trên exon 2 (codon 12 và 13):

Vị trí đột biến	Kiểu đột biến nucleotide	Kiểu biến đổi acid amin	Ký hiệu đột biến
Codon 12	GGT > GAT	Glycine > Aspartate	Gly12Asp (G12D)
	GGT > GTT	Glycine > Valine	Gly12Val (G12V)
	GGT > TGT	Glycine > Cysteine	Gly12Cys (G12C)
	GGT > CGT	Glycine > Arginine	Gly12Arg (G12R)
	GGT > GCT	Glycine > Alanine	Gly12Ala (G12A)
	GGT > AGT	Glycine > Serine	Gly12Ser (G12S)
Codon 13	GGC > GAC	Glycine > Aspartate	Gly13Asp (G13D)
	GGC > GCC	Glycine > Alanine	Gly13Ala (G13A)
	GGC > GTC	Glycine > Valine	Gly13Val (G13V)
	GGC > TGC	Glycine > Cysteine	Gly13Cys (G13C)
	GGC > CGC	Glycine > Arginine	Gly13Arg (G13R)
	GGC > AGC	Glycine > Serine	Gly13Ser (G13S)

• Phân loại hoạt tính kinase của các biến thể đột biến BRAF theo Wan (2004): Nhóm hoạt tính kinase cao (chiếm ưu thế: V600E, V600D, V600K, V600R, K601E, G469A, E586K) và nhóm hoạt tính kinase trung bình - thấp (R462I, I463S, G464E, G464V, G466A, G469E, N581S, F595L, L597V, T599I, A728V).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày cụ thể quy trình chọn mẫu, kỹ thuật thực nghiệm và kiểm soát chất lượng:

• Mô tả tiêu chuẩn chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn mẫu mô đúc khối paraffin đảm bảo đủ tiêu chuẩn vi thể để tách chiết DNA.
• Chi tiết các thông số kỹ thuật: Thiết lập chu kỳ luân nhiệt cho phản ứng COLD-PCR để làm giàu DNA đột biến; quy trình phản ứng giải trình tự Sanger (Cycle Sequencing) sử dụng BigDye Terminator trên máy điện di tự động; các cặp mồi chuyên biệt cho từng exon của KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA.
• Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch xác định tình trạng biểu hiện protein PTEN: tiêu chuẩn đánh giá dương tính (còn biểu hiện PTEN) khi tế bào u bắt màu tương đương hoặc mạnh hơn chứng nội tại; âm tính (mất biểu hiện PTEN) khi tế bào u mất hoàn toàn tín hiệu nhuộm trong khi tế bào đệm xung quanh vẫn bắt màu rõ.
• Quy trình phân loại TNM, xác định độ mô học và kiểm soát đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Phần kết quả được cấu trúc thành ba nội dung chính phản ánh đầy đủ các số liệu khảo sát:

• Một số đặc điểm mô bệnh học và lâm sàng:
  • Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi, giới tính; phân bố vị trí u (đại tràng phải/gần, đại tràng trái/xa, trực tràng).
  • Phân loại mô bệnh học: tỷ lệ ưu thế của carcinôm tuyến không đặc hiệu, tỷ lệ các biến thể carcinôm tuyến dạng nhầy và carcinôm tế bào nhẫn.
  • Phân bố theo độ mô học (độ 1, độ 2, độ 3), độ sâu xâm lấn mô u (pT1 đến pT4), tình trạng di căn hạch lympho vùng (pN0, pN1, pN2), tình trạng di căn xa (pM0, pM1) và phân kỳ giai đoạn lâm sàng TNM (giai đoạn I, II, III, IV).
• Biểu hiện protein PTEN và mối liên quan lâm sàng - bệnh học:
  • Xác định tỷ lệ mẫu u còn biểu hiện so với tỷ lệ mất biểu hiện protein PTEN trên hóa mô miễn dịch.
  • Phân tích tương quan giữa tình trạng mất biểu hiện protein PTEN với các biến số: độ tuổi, giới tính, vị trí giải phẫu khối u, dạng biểu hiện mô học, độ mô học (biệt hóa), mức độ xâm lấn thành ruột (pT), di căn hạch vùng (pN), di căn xa (pM) và giai đoạn bệnh TNM.
• Đặc điểm đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA:
  • Gen KRAS: Tỷ lệ đột biến chung; phân bố vị trí đột biến trên các codon (tập trung chủ yếu ở codon 12 và codon 13 của exon 2; ghi nhận các đột biến ít gặp hơn ở codon 10 như Gly10Glu, các trường hợp mang đồng thời hai đột biến điểm trên cùng một codon hoặc ở cả codon 12 và 13); tần suất các dạng thay thế acid amin phổ biến (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly13Asp, Gly13Ser). Phân tích tương quan đột biến KRAS với tuổi, giới tính, vị trí u, loại mô học, độ mô học và giai đoạn TNM.
  • Gen NRAS: Tần suất xuất hiện đột biến trên các exon được khảo sát.
  • Gen BRAF: Tỷ lệ đột biến; phát hiện đột biến điểm dạng thay thế acid amin (như Lys601Glu / K601E trên exon 15).
  • Gen PIK3CA: Tỷ lệ đột biến chung; phân bố vị trí đột biến trên exon 9 (như codon 545) và exon 20 (như codon 1055, codon 1057). Đánh giá mối liên quan giữa đột biến PIK3CA với giới tính, vị trí u, độ xâm lấn, loại mô học (đặc biệt là dạng nhầy), độ mô học và giai đoạn TNM.

Chương 4. Bàn luận

Chương bàn luận đối chiếu các phát hiện của nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:

• Về đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học: So sánh đặc điểm phân bố tuổi, giới, vị trí giải phẫu tổn thương và phân loại mô học carcinôm tuyến với các nghiên cứu trong nước (Nguyễn Bá Đức, Huỳnh Quyết Thắng) và các thống kê dịch tễ quốc tế.
• Về biểu hiện protein PTEN: Đánh giá tỷ lệ mất biểu hiện protein PTEN trong nghiên cứu so với các báo cáo của Sawai H. (2008), Mao C. (2013), Loupakis F. (2009); phân tích cơ chế mất biểu hiện PTEN (do đột biến mất chức năng, mất dị hợp tử 10q23, hoặc methyl hóa promoter) và ý nghĩa của việc mất PTEN như một yếu tố tiên lượng diễn tiến xâm lấn, di căn cũng như cơ chế đề kháng độc lập với thụ thể đối với kháng thể đơn dòng kháng EGFR.
• Về đột biến KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA:
  • So sánh tỷ lệ đột biến KRAS và phân bố codon 12/13 với cơ sở dữ liệu COSMIC, nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ, Vaughn C.P., Tong J.H.; thảo luận về các kiểu đột biến hiếm gặp (Gly10Glu, đột biến kép).
  • Bàn luận về đột biến NRAS và sự cần thiết phải mở rộng xét nghiệm toàn bộ gen RAS (all-RAS testing) trước khi chỉ định điều trị kháng EGFR.
  • Phân tích tỷ lệ đột biến BRAF (Lys601Glu) trong bối cảnh các kiểu đột biến thuộc nhóm hoạt tính kinase cao, mối liên hệ với kiểu hình MSI-H và CIMP, cũng như giá trị tiên lượng xấu độc lập của đột biến BRAF.
  • Đánh giá phân bố đột biến PIK3CA trên exon 9 và exon 20, bàn luận mối liên quan giữa đột biến PIK3CA với loại mô học carcinôm tuyến dạng nhầy và vai trò tiên đoán đáp ứng hỗ trợ bằng aspirin.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Về mặt dữ liệu khoa học: Luận án là công trình chuyên khảo đầu tiên tại Việt Nam khảo sát đồng bộ và có hệ thống cả 4 gen (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA) bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger trực tiếp kết hợp COLD-PCR và xác định tỷ lệ mất biểu hiện protein PTEN bằng hóa mô miễn dịch trên cùng một bộ mẫu carcinôm tuyến đại - trực tràng.
2. Về mặt kỹ thuật và phương pháp: Chứng minh tính khả thi, độ tin cậy và giá trị ứng dụng của kỹ thuật giải trình tự trực tiếp Sanger trong việc phát hiện chính xác các đột biến điểm phổ biến và các đột biến hiếm gặp (như đột biến tại codon 10 của KRAS, đột biến BRAF K601E, các đột biến PIK3CA exon 9 và 20), khắc phục hoàn toàn nhược điểm bỏ sót đột biến mới của kỹ thuật PCR đặc hiệu alen trước đây.
3. Về mặt ứng dụng lâm sàng và điều trị đích: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng tại Việt Nam về tỷ lệ các biến đổi phân tử thuộc hai lộ trình RAS/RAF/MAPK và PI3K/PTEN/Akt, phục vụ việc sàng lọc chính xác các bệnh nhân ung thư đại - trực tràng di căn có khả năng hưởng lợi từ liệu pháp kháng thể đơn dòng kháng EGFR (cetuximab, panitumumab), đồng thời cung cấp cơ sở sinh học cho việc cân nhắc điều trị hỗ trợ bằng aspirin ở bệnh nhân có đột biến gen PIK3CA.

Kiến nghị của tác giả

• Đưa xét nghiệm đột biến mở rộng các gen KRAS, NRAS (các exon 2, 3, 4), BRAF (exon 15), PIK3CA và đánh giá hóa mô miễn dịch PTEN vào quy trình thường quy trong chẩn đoán giải phẫu bệnh - sinh học phân tử cho bệnh nhân ung thư đại - trực tràng giai đoạn tiến triển và di căn.
• Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp hoặc các kỹ thuật phân tích phân tử có độ nhạy cao để đảm bảo không bỏ sót các đột biến ngoài codon 12 và 13 kinh điển của KRAS.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu được thực hiện trên cỡ mẫu thu thập tại một trung tâm y khoa lớn ở phía Nam trong một khoảng thời gian nhất định; các phân tích chủ yếu tập trung vào mối liên quan với đặc điểm mô bệnh học và lâm sàng ban đầu, chưa có dữ liệu theo dõi dọc dài hạn về thời gian sống còn toàn bộ (OS) hay thời gian sống không bệnh tiến triển (PFS) trên những bệnh nhân thực tế được điều trị phác đồ có cetuximab/panitumumab.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm với cỡ mẫu lớn hơn trên phạm vi toàn quốc.
  • Tiến hành các nghiên cứu đoàn hệ theo dõi dọc để đánh giá chính xác mối tương quan giữa từng kiểu đột biến phân tử cụ thể (như đột biến PIK3CA từng exon riêng biệt, đột biến kép KRAS) với đáp ứng lâm sàng thực tế và tiên lượng sống còn.
  • Kết hợp khảo sát sâu hơn tình trạng bất ổn định vi vệ tinh (MSI) bằng kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích biểu sinh methyl hóa promoter các gen sửa lỗi bắt cặp sai (MLH1, MGMT).

---

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thực tiễn và học thuật cho nhiều đối tượng:

• Bác sĩ Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử: Cung cấp quy trình kỹ thuật chuẩn từ khâu xử lý mô paraffin, kỹ thuật giải trình tự Sanger trực tiếp, COLD-PCR cho đến tiêu chuẩn đánh giá hóa mô miễn dịch protein PTEN; làm tài liệu tham khảo trong việc xây dựng labo chẩn đoán phân tử ung bướu.
• Bác sĩ Ung bướu lâm sàng và Ngoại Tiêu hóa: Cung cấp số liệu dịch tễ phân tử tại Việt Nam để làm căn cứ chỉ định xét nghiệm dấu ấn sinh học trước khi quyết định phác đồ điều trị nhắm trúng đích phân tử EGFR hoặc hóa trị hỗ trợ.
• Giảng viên, Nghiên cứu sinh và Học viên sau đại học: Là tài liệu chuyên khảo tham khảo có cấu trúc rõ ràng về cơ chế bệnh sinh phân tử ung thư biểu mô đại - trực tràng, cơ chế hoạt động của các lộ trình tín hiệu nội bào EGFR-RAS-RAF-MAPK và PI3K-PTEN-Akt.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chỉ dựa vào xét nghiệm hóa mô miễn dịch biểu hiện EGFR là không đủ để chỉ định thuốc kháng thể đơn dòng kháng EGFR (như cetuximab)?
Trả lời: Các nghiên cứu được luận án tổng quan cho thấy tỷ lệ đáp ứng với cetuximab ở nhóm ung thư đại - trực tràng di căn có EGFR dương tính trên hóa mô miễn dịch chỉ đạt dưới 25%, trong khi một số trường hợp EGFR âm tính vẫn có đáp ứng lâm sàng. Nguyên nhân là do các đột biến tăng chức năng ở các gen hạ nguồn (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA) hoặc mất biểu hiện protein PTEN sẽ tự động kích hoạt các lộ trình tín hiệu nội bào (RAS/RAF/MAPK và PI3K/Akt) mà không cần tín hiệu kích thích từ thụ thể EGFR màng tế bào, dẫn đến tình trạng kháng thuốc.

2. Đột biến gen KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng thường tập trung ở những vị trí nào?
Trả lời: Theo cơ sở dữ liệu COSMIC và tổng quan luận án, hơn 90% đột biến KRAS nằm trên exon 2, chủ yếu là các đột biến điểm tại codon 12 (các biến thể Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Cys, Gly12Ser, Gly12Ala, Gly12Arg) và codon 13 (Gly13Asp, Gly13Ser, Gly13Ala, Gly13Val, Gly13Cys, Gly13Arg). Ngoài ra, đột biến còn có thể xuất hiện với tỷ lệ thấp hơn ở codon 61 (exon 3), codon 117 và 146 (exon 4), hoặc các vị trí hiếm như codon 10.

3. Vai trò của protein PTEN trong tế bào là gì và sự mất biểu hiện protein này dẫn đến hậu quả sinh học nào?
Trả lời: PTEN là một protein đè nén u hoạt động như một lipid phosphatase kép, có vai trò loại bỏ gốc phosphate ở vị trí D3 của PIP3 để chuyển ngược thành PIP2, đóng vai trò điều hòa âm tính (ức chế) đường truyền tín hiệu PI3K/Akt. Khi mất biểu hiện protein PTEN (do đột biến, mất dị hợp tử hoặc methyl hóa), PIP3 sẽ tích tụ liên tục, hoạt hóa quá mức Akt và mTOR, từ đó thúc đẩy chu kỳ tế bào, tăng sinh mạch và ức chế quá trình chết tế bào theo lập trình (apoptosis).

4. Đột biến gen PIK3CA trong ung thư đại - trực tràng có ý nghĩa lâm sàng đặc biệt nào ngoài việc tiên đoán đáp ứng thuốc kháng EGFR?
Trả lời: Ngoài việc gây hoạt hóa độc lập lộ trình PI3K/Akt dẫn đến kháng thuốc kháng EGFR, các nghiên cứu (như của Chan A.T., Liao X.) được luận án trích dẫn cho thấy bệnh nhân ung thư đại - trực tràng mang đột biến PIK3CA là nhóm đối tượng có đáp ứng thuận lợi với điều trị hỗ trợ bằng aspirin, giúp giảm rõ rệt tỷ lệ tái phát u sau phẫu thuật.

5. Tại sao phương pháp giải trình tự gen trực tiếp theo Sanger được coi là ưu việt hơn phương pháp PCR đặc hiệu alen trong nghiên cứu này?
Trả lời: Phương pháp PCR đặc hiệu alen chỉ có thể phát hiện các đột biến đã được thiết kế mồi chuyên biệt từ trước và hoàn toàn không thể phát hiện các đột biến mới. Ngược lại, kỹ thuật giải trình tự Sanger trực tiếp đọc toàn bộ trình tự nucleotide của đoạn gen mục tiêu, cho phép phát hiện tất cả các đột biến điểm, mất đoạn, chèn đoạn hoặc các biến thể đột biến mới chưa từng được ghi nhận trong vùng khảo sát.

---

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Y học của tác giả Nguyễn Hồng Phong là công trình nghiên cứu chuyên sâu về giải phẫu bệnh và sinh học phân tử trong carcinôm tuyến đại - trực tràng tại Việt Nam. Bằng việc kết hợp kỹ thuật giải trình tự gen Sanger trực tiếp và hóa mô miễn dịch, luận án đã xác định đặc điểm biến đổi phân tử đồng bộ trên các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và tình trạng biểu hiện protein PTEN, đồng thời phân tích mối liên quan chặt chẽ của các dấu ấn này với đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng phục vụ công tác chẩn đoán phân tử, tiên lượng bệnh và cá thể hóa điều trị nhắm trúng đích cho bệnh nhân ung thư đại - trực tràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê về gánh nặng ung thư toàn cầu của tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế [74], ung thư đại - trực tràng (UTĐTT) là một trong năm loại ung thư thường gặp ở cả hai giới trên toàn cầu, với khoảng 1.000 trường hợp bệnh mắc mới, 694.000 trường hợp tử vong và đứng hàng thứ 5 trong số các nguyên nhân tử vong do ung thư. Tại Việt Nam năm 2012, UTĐTT đứng hàng thứ tư về số lượng mắc mới và tử vong do ung thư ở cả hai giới, với khoảng 4561 trường hợp mắc mới và khoảng 3112 trường hợp tử vong do UTĐTT [74]. Qua khảo sát đột biến bộ gen người trong UTĐTT, các biến đổi phân tử thông qua hai lộ trình hạ nguồn EGFR là RAS/RAF/MAPK và PI3K/PTEN/Akt đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư đại - trực tràng [89],[160]. Các nghiên ở nước ngoài đã cho thấy việc khảo sát đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN có ý nghĩa tiên đoán đáp ứng điều trị với các thuốc nhắm trúng đích phân tử EGFR [13],[42],[43].

Liệu pháp nhắm trúng đích phân tử EGFR bằng các kháng thể đơn dòng như cetuximab hay panitumumab khi được sử dụng phối hợp với các phác đồ hóa trị chuẩn như FOLFOX hay FOLFIRI trong điều trị UTĐTT di căn đã giúp cải thiện rõ rệt thời gian sống còn so với nhóm bệnh nhân chỉ hóa trị đơn thuần [13],[27],[163]. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào tiêu chuẩn UTĐTT di căn có biểu hiện EGFR dương tính trên hóa mô miễn dịch để chỉ định điều trị bằng cetuximab thì tỷ lệ đáp ứng chưa đến 25% [39],[131]. Mặt khác, khi UTĐTT di căn có biểu hiện EGFR âm tính trên hóa mô miễn dịch vẫn có đáp ứng với cetuximab [37],[66]. Như vậy, sự biểu hiện của EGFR trên tế bào u không có giá trị tiên đoán đáp ứng đối với liệu pháp nhắm trúng đích trong điều trị UTĐTT bằng kháng thể đơn dòng kháng 2 EGFR.

Sau đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh sự hoạt hóa quá mức ít nhất một lộ trình tín hiệu RAS/RAF/MAPK hoặc PI3K/PTEN/Akt do các đột biến tăng chức năng một trong số các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA hoặc các biến đổi phân tử gây mất biểu hiện protein PTEN sẽ gây kháng thuốc cetuximab và panitumumab trong UTĐTT di căn [13],[42],[43]. Do đó, KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN được xem là các dấu ấn phân tử có giá trị tiên đoán đáp ứng với liệu pháp nhắm trúng đích EGFR trong điều trị UTĐTT di căn. Ngoài ra, UTĐTT có đột biến PIK3CA là một yếu tố thuận lợi cho việc điều trị hỗ trợ bằng aspirin, giúp hạn chế tỷ lệ tái phát cho bệnh nhân [48],[95]. Bên cạnh giá trị tiên đoán đáp ứng điều trị, việc khảo sát các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN còn có ý nghĩa tiên lượng bệnh.

Nghiên cứu của Bazzan[20], Roth [128], Tol [156], Zhu [189] cho thấy đột biến tăng chức năng các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và các nghiên cứu của Mao [105], Sawai [137] về sự mất biểu hiện PTEN là các yếu tố tiên lượng xấu trong ung thư đại trực tràng. Nhiều nghiên cứu nước ngoài về các biến đổi phân tử ở các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA [61],[189],[191] cũng như sự mất biểu hiện protein PTEN [101],[120],[137] cho thấy có sự thay đổi theo địa dư, chủng tộc. Ở Việt Nam, đặc điểm đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện protein PTEN của bệnh nhân UTĐTT chưa được nghiên cứu nhiều. Đã có vài báo cáo về tỷ lệ đột biến KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng.

Tuy nhiên, kỹ thuật khảo sát đột biến gen theo phương pháp PCR đặc hiệu alen trong nghiên cứu của Hồ Hữu Thọ [1], Bùi Ánh Tuyết [5] và Tạ Thành Văn [6] thì không thể phát hiện được các đột biến mới. Cho đến hiện tại, chỉ có nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ [7] xác định đột biến KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng dựa trên kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp của Sanger, là tiêu chuẩn vàng trong xác định đột biến 3 gen và có thể phát hiện tất cả các đột biến mới. Đến nay, chưa có nghiên cứu nào được công bố ở Việt Nam về đặc điểm đột biến gen NRAS, BRAF, PIK3CA và biểu hiện protein PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tỷ lệ các biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và PTEN trong carcinôm tuyến đại - trực tràng” dựa trên kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp của Sanger và hóa mô miễn dịch như là một nghiên cứu bước đầu nhằm góp phần làm sáng tỏ tỷ lệ các biến đổi phân tử ở các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và protein PTEN trong carcinôm tuyến đại – trực tràng ở Việt Nam.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: 1. Khảo sát một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. Xác định tỷ lệ đột biến KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, mất biểu hiện protein PTEN và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DỊCH TỄ HỌC UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Ung thư đại - trực tràng là một trong số các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới.

Theo tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế IARC [74], mỗi năm trên thế giới có hơn 1,3 triệu bệnh nhân mắc mới ở cả hai giới. Trong đó, khoảng 55% trường hợp UTĐTT xảy ra ở các nước phát triển. Nam luôn có tỷ lệ mắc cao hơn nữ. Nước có xuất độ mắc chuẩn theo tuổi cao nhất là Úc (44,8/100.000 dân), Newzeland và các nước Bắc Âu(>32/100.00 dân) tính chung cả hai giới.

Các nước có xuất độ mắc thấp nhất ở Tây Phi với xuất độ mắc chuẩn theo tuổi từ 3,8 - 4,5/ 100. Các nước Đông Á và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, có xuất độ mắc trung bình. Trên toàn thế giới, số lượng bệnh lưu hành 5 năm hơn 3,5 triệu bệnh nhân. Số lượng bệnh nhân tử vong do UTĐTT khoảng hơn 690.000 người, thấp hơn so với số lượng bệnh mắc mới.

Xuất độ tử vong cao nhất ở Trung và Đông Âu (20,3/ 100,000 dân đối với nam, 11,7/100,000 dân đối với nữ) và thấp nhất là ở Tây Phi (3,5/ 100,000 dân đối với nam, 3/100,000 dân đối với nữ) [74]. Tại Việt Nam, Nguyễn Bá Đức và cộng sự [1] ghi nhận UTĐTT có xuất độ mắc đứng hàng thứ 3 ở nam và thứ 6 ở nữ. Theo ghi nhận của IARC [74], mỗi năm Việt Nam có khoảng 8.768 bệnh nhân ung thư đại - trực tràng mắc mới và khoảng 5.976 bệnh nhân tử vong do căn bệnh này. Số lượng bệnh nhân UTĐTT lưu hành 5 năm ghi nhận đến năm 2010 có khảng 18844 bệnh nhân, chiếm 8,9% tổng số ung thư và có xuất độ 27,3/100.000 người trưởng thành.

Ở Cần Thơ, Huỳnh Quyết Thắng và cộng sự [2] ghi nhận ung thư đại - trực tràng có xuất độ mắc mới đứng thứ 2 ở nam và thứ 4 ở nữ. Xuất độ mắc UTĐTT tăng theo tuổi, và hiếm khi xuất hiện trước 40 tuổi, ngoại trừ các trường hợp cơ địa có tích lũy các bất thường về di truyền 5 liên quan hoặc bệnh viêm đại tràng mạn ở các vùng dịch tễ có xuất độ mắc cao. Tuy nhiên, xuất độ mắc chuẩn theo tuổi trong số người trẻ thường cao hơn ở vùng có xuất độ mắc mới thấp so với các vùng có xuất độ mắc mới cao. Tỉ số ung thư đại tràng/ung thư trực tràng ở các dân số có xuất độ mắc cao sẽ cao hơn so với dân số có xuất độ mắc thấp [62].

CƠ CHẾ PHÂN TỬ TRONG BỆNH SINH CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG Carcinôm tuyến đại - trực tràng được hình thành qua một quá trình biến đổi về mặt phân tử qua nhiều giai đoạn: từ niêm mạc bình thường trở thành một tổn thương lành tính, tổn thương tiền ung thư và có thể diễn tiến thành một ung thư thật sự [29]. Năm 1988, Vogelstein [167] và cộng sự đã đưa ra một lộ trình sinh UTĐTT với các sự kiện phân tử then chốt tích hợp thành một chuỗi sự kiện phân tử diễn tiến qua nhiều giai đoạn gây biến đổi một niêm mạc bình thường thành tổn thương u tuyến và cuối cùng là ung thư. Tuy nhiên, lộ trình này chưa giải thích hết cơ chế bệnh sinh phân tử của UTĐTT. Bổ sung vào sự thiếu sót của lộ trình sinh UTĐTT của Vogelstein, một kiểu hình riêng biệt của carcinôm tuyến đại - trực tràng đã được khám phá, đó là nhóm bất ổn định vi vệ tinh mức độ cao [154].

Nhóm bệnh carcinôm tuyến đại - trực tràng với tình trạng bất ổn định vi vệ tinh mức độ cao có đặc điểm mô bệnh học đặc biệt như: khuynh hướng u ở đại tràng gần, tiến triển tương đối nhanh từ u tuyến đến ung thư xâm lấn và thường có tiên lượng tốt hơn so với nhóm không có tình trạng bất ổn định vi vệ tinh trong điều kiện tương đồng về giai đoạn của bệnh [8]. Ung thư đại - trực tràng được hình thành dựa trên cơ sở một tế bào bình thường trước đó, được tích lũy nhiều biến đổi gen qua nhiều quá trình phân bào và tạo ra được các dòng tế bào với đặc điểm di truyền bị biến đổi. Trong đó, mỗi dòng tế bào có lợi thế tăng trưởng khác nhau. Lợi thế tăng 6 trưởng này có được thông qua việc tăng sinh tế bào, suy yếu khả năng gây chết tế bào theo lập trình, hoặc cả hai.

Hầu hết các bệnh ung thư cần có từ 6 đến 10 biến đổi về mặt vật chất di truyền để có thể hình thành nên ung thư, cũng như khả năng di căn xa [123]. Ngoài khía cạnh các biến đổi về chất liệu di truyền tạo nên lợi thế tăng trưởng tế bào, thì các dòng tế bào tiền ung thư muốn trở thành các dòng tế bào ung thư thật sự phải được phát triển trong một môi trường thuận lợi cho phép tạo ra các đột biến tiếp sau [68]. Quá trình này được gọi là sự bất ổn định bộ gen, đảm bảo rằng khả năng mắc phải những đột biến quan trọng tiếp theo xảy ra ngày càng lớn hơn. Bất ổn định bộ gen là một hiện tượng rất quan trọng trong cơ chế sinh ung thư.

Nó làm tăng tốc quá trình biến đổi tế bào để hình thành ung thư, bằng cách tăng khả năng bị đột biến. Nếu không có sự bất ổn định của bộ gen, việc mắc phải các đột biến mới sẽ xảy ra quá chậm để có thể hình thành được bệnh ung thư trong suốt cuộc đời của một người [100].