Chương 1: Tông quan vẫn đề nghiên cứu (38 trang) Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang) Chương 3: Kết quả và thảo luận (80 trang) CHUONG 1. TONG QUAN VAN DE NGHIEN CUU 1. Đại cương về nấm men Nắm men là nhóm nắm đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, có kích thước, đường kính té bao tir 3 — 10 pm. Tuy lodi nam men tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình elíp, hình mũ phớt, hình sao thé, hình cái liềm, hình thoi, hình cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình thấu kính, hình quả lê, hình bán cầu có rìa hẹp.
Thành tế bào nắm men Saccharomyces co cau tao chi yéu tit mannan va glucan, ở một số chỉ có thêm kitin. Màng tế bào chất gồm 2 lớp phân tir phospholipid với mỗi liên kết este đặc trưng cho màng các vi sinh vật nhân thực. Trong tế bào chất có các bào quan như: nhân, ti thé, riboxôm, không bao, thé Golgi,. Nhan tế bảo của Saccharomyces cerevisiae có 16 nhiễm sắc thê (đơn bội — 1n) hoặc l6 cặp nhiễm sắc thể (lưỡng bội - 2n).
Ngoài nhân còn có nhiều yếu tố di truyền khác như plasmid, yếu tố di truyền vận động (Transposon). Khối lượng riêng của tế bào nắm men là 1,055 - 1,060 KDa, không khác biệt nhiều so với tế bào vi khuẩn (1,050 - 1,112 KDa). Nắm men đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người, chúng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, điển hình là công nghiệp sản xuất rượu, cồn, rượu vang, bia, thực phẩm và các hoạt chất sinh hoc,. Việc phân loại đối với nắm men nói chung rất phức tạp và thường dựa trên các chỉ tiêu chủ yếu sau: - Đặc điểm tế bảo sinh dưỡng (hình dạng, cau tạo, kích thước.) - Đặc điểm sinh sản hữu tính và đặc điểm sinh lý, nuôi cấy (khả năng đồng hoá carbon, đồng hoá nitrat, phản ứng DBB (phản ứng với Diazonium Blue B).
Cho đến nay đã có nhiều khoá phân loại nắm men của các tác giả: Lodder. (1983), Kreger-Van Rij. Một số kỹ thuật điển hình hiện nay trong phân loại học phân tử: Phân ích trình tự DNA, Kỹ thuật PCR, Lai phân tử, Điện đi izozym. Cách phân loại nắm men dua vao các tiêu chí [8], [47].
3- Các đặc điểm sinh hóa (thành tế bào, coenzyme Q10,.), đặc điểm sinh lí (nguồn dinh dưỡng C, N,., pH, TỶ tối ưu,.) 4- Các đặc điểm sinh học phân tử (trình tự DI, D2 của gen 28S; ITS1, ITS2 ở 2 bên của gen 5,8S và trình tự RNA - rib6x6m 18S.) Hiện nay, nắm men đã xác định được: 1110 loài/ 58 chứ 17 họ / Bộ Saccharomycetales/ Lớp Saccharomycetes/ Ngành Ascomycota [139]. Đặc điểm sinh học cơ bản của nắm men 1. Sinh sản của nấm men Nắm men duy trì nòi giống bang hai hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Tuy nhiên, có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội, lưỡng bội khác nhau trong vòng đời của nắm men hoặc tùy theo môi trường.
- Sinh sản vô tính: Nẵẫm men sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất ở nắm men thể hiện qua sự xuất hiện của chổi từ vi tri seo chéi [76]. Ngoài ra ở nắm men còn có hình thức sinh sản vô tính bằng bảo tử như: bào tử đốt (ở chỉ Georichum), bào tử bắn (ở chỉ Sporobolomyces), bào tử áo (ở nắm Candida albicans) [S6], [100]. Sinh sản vô tính có ưu điểm: tốc độ sinh sản nhanh, chiếm lĩnh môi trường, Ít đột biến, ôn định di truyền.
- Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính ở nắm men xuất hiện ở các chỉ Saccharomyces, Zygosaccharomyces va nhiéu chi nam men khac thuộc bộ Edornycetales. Quá trình sinh sản liên quan tới sự tạo thành bảo tử túi từ tế bảo sinh đưỡng kèm theo quá trình giảm phân gồm giảm phân 1 và giảm phân 2, trong đó chỉ có 1 lần nhân đôi nhiễm sắc thê ở giảm phân I, vì vậy từ tế bào lưỡng bội (2n) tạo thành 4 bào tử đơn bội (n). Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sinh sản vô tính ở môi trường mới, các bào tử nảy mầm thành té bào mới và nảy chỗi tiếp theo trở về sinh sản vô tính [8], [44]. Các nắm men lớp Ascomycetes có dạng sinh sản hữu tính hình thành túi bảo tử chứa các bào tử túi (Ascospores) do kết quả của quá trình giảm phân.
Ví dụ túi bào tử và bào tử túi của 3 loài nắm men phô biến như sau [100]: @ Qo bop Bà Đề &® kg PRE S. cerevisiae Pichia farinosa Schizosaccharomyces octosporus Hình 1.1: Bào tử và túi bảo tử của nắm men [84] Sinh sản hữu tính: thường xảy ra khi ở điều kiện môi trường khắc nghiệt. Thế hệ con có đặc điểm khác biệt về vật chất di truyền, tạo nguồn nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên, có ý nghĩa sinh tồn, tiễn hóa. - Chu kì sống của nấm men Sau quá trình giảm phân, các bảo tử túi sẽ được sinh ra (thường là 4 bảo tử túi).
Khi không có sinh sản hữu tính chúng vẫn liên tục nây chồi để sinh sản. Chu kì này thấy ở nắm men ruou S. Sinh sản vô tính đâm chói 2n Giảm nhiễm (tạo túi và các bảo tử túi) Hình 1.2: Chu kì sinh sản của nắm men $. cerevisiae [56] Yếu tố quyết định và quan trọng nhất là các đặc tính di truyền của tế bào qua sinh sản vô tính nảy chéi truyén lai cho thé hệ sau.
Đặc tính này được thể hiện rõ ở nam men S. Phan chia Quá trinh tế bảo nẩy chồi Giai đoạn Sau của quá trinh phân chia nhân 4) Hình 1.3: Các pha nguyên phân của nắm men S. cerevisiae [56] Chu kỳ sinh sản vô tính của tế bào được chia làm 4 pha: GI, S (giai đoạn tông hợp DNA), G2 và M (các kì nguyên phân), trong đó pha G2 ngắn hơn do có sẹo chi. Đặc điểm sinh lí — sinh hóa nắm men a/ Đông hóa các hợp chất carbon Chuyên hóa carbon là nền tảng cho sản xuất các thành phần tế bào và cung cấp chuyên hóa năng lượng.
Để thử nghiệm khả năng đồng hóa các hợp chất carbon của chủng nam men S. cerevisiae, 20 loai hop chất có thể sử dụng trong giai đoạn dau [8], [44], [81]: - Cac hexose: glucose, galactose, sorbose, methuyl-D-glucoside salicine, arbutine - Cac pentose: D - xylose, L - arabinose, D va L — ribose, L — rhamnose. - Cac disaccharide: saccharose, lactose, maltose, melibiose, trehalose, cellobiose. - Trisaccharide: rafinose, melezitose - Polysaccharide: tinh bot, inuline Sau đó, nhóm các hợp chất tiếp theo gdm [81]: - Ruou: methanol, ethanol, glyxerol, ribitol, galactiol, erythritol, mannitol, sorbitol, inositol.
- Các axit hữu cơ: lactic, succinic, citric, pyruvic, malic, glucuronic, 2-xetogluconic Phương pháp đề thử các loại đường tương đối đơn giản đó là cho nguồn đường là hợp chất cần nghiên cứu vào môi trường thạch Difco 2% và có nitơ nắm men. Phương pháp này có thuận lợi là nhanh chóng có kết quả. Khi nắm men có sinh trưởng thì xác định được chủng nắm men nghiên cứu có thể sử dụng được nguồn đường bổ sung. Thử nghiệm sự thủy phân arbutine được thực hiện trên môi trường có arbutine (5%), thạch 2 % trong ống nghiệm đặt nghiêng.
Nếu arbutine được thủy phân thì màu nâu sẽ xuất hiện trong môi trường sau 2 — 7 ngày ở 25°C [6], [84]. Hiện nay, phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định khả năng đồng hóa các hợp chat carbon là dùng bộ kit thử. Nguyên tắc chung là dựa trên sự phát hiện các enzyme, nhóm enzyme tham gia chuyền hóa các hợp chất carbon có trong vi sinh vật. Ví dụ: sử dụng kít ID 32C, có khả năng phát hiện 32 loại hợp chất carbon có thể được dùng cho chuyên hóa vật chất và năng lượng trong tế bảo.
b/ Đông hóa các hợp chất nitơ Nguồn nitơ rất cần thiết cho sự sống và quá trình trao đôi chất của chúng được điều hòa chính xác. Hiện nay, nghiên cứu khả năng đồng hóa các hợp chất nitơ chủ yếu sử dụng 2 nguồn là: nitrat kali và chlorhydrat ethylamin, thí nghiệm thực hiện theo phương pháp auxanographic (khuyết dưỡng tự ghi) trong môi trường cơ bản nước chiết ndm men (Difco) hay trên môi trường tổng hợp không có nitơ [44] [56]. cerevisiae vật liệu nitơ cho sinh tổng hợp axit amin chủ yếu được chuyên đổi từ glutamate và glutamine. Nitơ amin từ glutamate và nhóm amin từ glutamine chiếm lần lượt 85% và 15% trong tổng số nitơ của tế bào [86].
Trong khi do, glutamate và glutamine hoạt động với œ-ketoglutarate để kết nối chu trình TCA và chuyển hóa niơ thông qua glutamate dehydrogenase, phụ thuộc NADPH (GDHI), glutamine synthetase (GLNI), glutamate synthase phụ thuộc NADH (GLTI) va glutamate dehydrogenase liên kết với NAD (GDH2) [138]. Chuyên hóa nitơ đã được chứng minh là rất quan trọng trong quá trình dị hóa và đồng hóa protein, axit amin và các hợp chất nitơ khác. Do đó, nitơ đóng một vai trò chỉ phối nói chung sự trao đổi chất. Điều hòa chuyên hóa nitơ bao gồm một tập hợp các quá trình liên kết với nhau, chẳng hạn như hệ thống cảm biến báo hiệu Ssy1-Ptr3-Ssy5 (hệ thống cảm biến SPS) [58].
Nhu cầu dinh dưỡng cơ bản của nẫm men Nắm men có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Các quá trình trao đổi chất là khác nhau, do vậy nhu cầu dinh dưỡng cũng khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ các nhân tố cần thiết để tế bào nắm men sinh trưởng. Tỉ lệ các nguyên tổ trong sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae là C: 1,72; O: 0,44; N: 0,15 khi nuôi nắm men này trong điều kiện hiểu khí và trên môi trường chứa glucose và khoảng 10% chất tro [100].
Môi trường cần cung cấp đầy đủ và đúng tỉ lệ các nguyên tố trên cho nắm men sinh trưởng. Các hợp chất carbon (đường, rượu, axit hữu cơ,.) cung cấp nguồn năng lượng cho nắm men, đồng thời cung cấp hydro cần thiết để tông hợp sinh khối tế bảo. - Nhu cau nito: Nitơ đứng thứ 2 về số lượng cho cấu trúc tế bào cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Nitơ cần dùng cho tế bào tổng hợp các axit amin, các nucleotid và một số vitamin.
Rất nhiều nguồn nitơ có thể được sử dụng. Tat cả các nắm men có khả năng sử dụng nitơ dưới dạng anion. Các anion có thể đưa vào môi trường dưới dạng clorua amon, nitrat amon, phosphat amon và sulfat amon. Trong đó, sulfat amon có ưu điểm hơn vì nó đồng thời cung cấp lưu huỳnh cần thiết để tổng hợp một vài loại axit amin có lưu huỳnh [6], [44].
Vài loại nam men có khả năng sử dụng nitrit và nitrat như: Hansenula, Pachysolen, Citeromyces va Candida va Trichosporon.