Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng nấm men ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men ứng dụng sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô, nâng cao chất lượng sản phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Văn Uyên
• Người hướng dẫn: PTS. Nguyễn Thành Đạt
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men ứng dụng sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men

Nghiên cứu tập trung vào việc tuyển chọn chủng nấm men phù hợp để sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô. Quá trình này bao gồm việc đánh giá các đặc điểm sinh học, khả năng lên men, và hiệu suất sản xuất rượu của các chủng nấm men. Chủng nấm men được chọn phải đáp ứng các yêu cầu về công nghệ và chất lượng sản phẩm, đặc biệt là khả năng tạo hương vị đặc trưng cho whisky.

1.1. Mục tiêu tuyển chọn

Mục tiêu chính là tìm ra chủng nấm men có khả năng lên men hiệu quả, tạo ra rượu whisky với hương vị đặc trưng và đạt tiêu chuẩn chất lượng. Các chủng được đánh giá dựa trên khả năng sinh trưởng, hiệu suất lên men, và khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khác nhau.

1.2. Tiêu chuẩn tuyển chọn

Các tiêu chuẩn bao gồm khả năng lên men dịch đường từ malt đại mạch và ngô, hiệu suất lên men cao, và khả năng tạo hương vị đặc trưng. Chủng nấm men được chọn phải có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có pH từ 5.0 đến 5.5 và nhiệt độ từ 20°C đến 30°C.

II. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men được tuyển chọn bao gồm hình thái, sinh lý, và di truyền. Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MS42 được xác định là phù hợp nhất với các tiêu chí đặt ra. Chủng này có khả năng sinh trưởng mạnh, hiệu suất lên men cao, và tạo ra hương vị đặc trưng cho whisky.

2.1. Hình thái và sinh lý

Chủng MS42 có hình thái tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước từ 3-10 μm. Chủng này có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có pH từ 5.0 đến 5.5 và nhiệt độ từ 20°C đến 30°C. Khả năng lên men của chủng này đạt hiệu suất từ 89.51% đến 91.40%.

2.2. Định danh khoa học

Chủng MS42 được định danh là Saccharomyces cerevisiae dựa trên các phân tích di truyền và sinh học phân tử. Các kết quả phân tích cho thấy chủng này có khả năng lên men dịch đường từ malt đại mạch và ngô với hiệu suất cao và tạo ra hương vị đặc trưng.

III. Quy trình sản xuất whisky

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô bao gồm các bước từ chuẩn bị nguyên liệu, lên men, chưng cất, đến ủ rượu. Quy trình này được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng, đặc biệt là hương vị và độ tinh khiết của whisky.

3.1. Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu chính là malt đại mạch và ngô, được xử lý để tạo dịch đường lên men. Quá trình này bao gồm nghiền nguyên liệu, đường hóa, và lọc dịch đường. Các yếu tố như tỷ lệ nguyên liệu, nhiệt độ, và thời gian đường hóa được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất.

3.2. Lên men và chưng cất

Dịch đường được lên men bởi chủng nấm men MS42 trong điều kiện tối ưu. Sau quá trình lên men, dịch rượu được chưng cất để tách cồn và các hợp chất hương vị. Quá trình chưng cất được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất phù hợp để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

IV. Ứng dụng và thử nghiệm sản xuất

Quy trình sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô được áp dụng thử nghiệm tại Công ty Cổ phần Bia-Rượu Resson Việt Nam. Kết quả cho thấy sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm, với hương vị đặc trưng và độ tinh khiết cao. Sản phẩm được đánh giá cao bởi khách hàng trong và ngoài nước.

4.1. Thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm

Quy trình được thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm để đánh giá hiệu quả và tối ưu hóa các thông số kỹ thuật. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, và thời gian lên men được điều chỉnh để đạt hiệu suất cao nhất.

4.2. Sản xuất quy mô công nghiệp

Sau khi tối ưu hóa, quy trình được áp dụng ở quy mô công nghiệp tại Công ty Cổ phần Bia-Rượu Resson Việt Nam. Sản phẩm whisky được sản xuất đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm, với hương vị đặc trưng và độ tinh khiết cao.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình "Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô" do nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Quyên thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Quang Thảo và GS. Nguyễn Thành Đạt, thuộc chuyên ngành Vi sinh vật học (Mã số: 9.07), bảo vệ tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội năm 2020.

Về tính cấp thiết, số liệu khảo sát của Hiệp hội Rượu - Bia - Nước giải khát Việt Nam (VBA) chỉ ra rằng nhu cầu tiêu thụ đồ uống có độ cồn cao tại Việt Nam đạt khoảng 500 - 520 triệu lít/năm. Trong đó, lượng rượu cao độ nhập khẩu chiếm khoảng 20% tổng sản lượng toàn thị trường, với dòng whisky chiếm thị phần lớn nhất (trên 30%). Thị trường toàn cầu đối với dòng rượu mạnh đạt quy mô 336 tỷ USD năm 2016 và dự báo tăng trưởng hàng năm đạt 33,4% giai đoạn 2017 - 2025 tại Mỹ. Mặc dù Việt Nam có nguồn nguyên liệu ngũ cốc phong phú với sản lượng ngô đạt 5,13 triệu tấn, nhập khẩu malt hàng năm trên 120.000 tấn và đã vận hành nhà máy sản xuất malt đại mạch đầu tiên tại Khu công nghiệp Tiên Sơn (Bắc Ninh) công suất 60.000 tấn/năm, nhưng trong nước chưa tự sản xuất được whisky ở quy mô công nghiệp mà hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu bằng ngoại tệ.

Về khoảng trống nghiên cứu, các công trình trước đây tại Việt Nam chỉ dừng lại ở việc sản xuất rượu trắng cao độ hoặc quy mô phòng thí nghiệm nhỏ lẻ, chưa hoàn thiện quy trình công nghệ đồng bộ từ khâu tuyển chọn giống nấm men thuần khiết, xử lý nguyên liệu malt đại mạch phối hợp ngô, tối ưu hóa các thông số lên men, đến công đoạn tàng trữ tạo hương với gỗ sồi đạt tiêu chuẩn quy định.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án bao gồm 4 nội dung cụ thể:

1. Tuyển chọn được 1 - 2 chủng nấm men có chất lượng tốt, đáp ứng các yêu cầu công nghệ và chất lượng sản phẩm.
2. Xác định được một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, di truyền và định tên khoa học chủng nấm men đã tuyển chọn.
3. Ứng dụng chủng nấm men đã tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch và ngô.
4. Xây dựng được quy trình công nghệ và sản xuất được rượu whisky từ ngô và malt đại mạch, sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm theo quy định.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 15 dòng nấm men phân lập từ bánh men rượu truyền thống ở các vùng miền (Mẫu Sơn, Làng Vân, Bắc Hà...); các chủng nấm men đối chứng (TN2, EC1118); nguyên liệu malt đại mạch và ngô vàng hạt khô; 24 mẫu gỗ sồi ngâm ủ; các mẫu rượu whisky đối chứng thương mại (Jack Daniel's, Singleton, Knob Creek). Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành và triển khai sản xuất thử nghiệm quy mô 10.000 lít tại Công ty Cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam; thời gian theo dõi tàng trữ và hoàn thành công trình đến năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả hệ thống hóa các nền tảng lý thuyết và nghiên cứu quốc tế về phân loại học nấm men của Lodder (1983) và Kreger-Van Rij, cùng cấu trúc hệ thống phân loại nấm men gồm 1.110 loài thuộc 58 chi, 17 họ, bộ Saccharomycetales, lớp Saccharomycetes, ngành Ascomycota. Luận án phân tích các nghiên cứu về sinh học nấm men Saccharomyces cerevisiae, cấu tạo 16 nhiễm sắc thể (1n) hoặc 16 cặp nhiễm sắc thể (2n), chu kỳ sinh trưởng tế bào qua 4 pha (G1, S, G2, M). Cơ chế dị hóa nitơ và đồng hóa axit amin được điểm lại qua nghiên cứu của Yaya Lu và cộng sự về mức độ giải phóng bù đắp 8,1 µmol N/[g sinh khối]/h và 5,2 µmol P/[g sinh khối]/h trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng, cùng hệ thống điều hòa cảm biến Ssy1-Ptr3-Ssy5 và các enzyme GDH1, GLN1, GLT1, GDH2.

Về hóa sinh lên men ethanol, tác giả đối chiếu con đường đường phân Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) ở S. cerevisiae với con đường Entner-Doudoroff ở vi khuẩn Zymomonas mobilis, phân tích cơ chế điều hòa dị hóa glucose qua phosphofructokinase, citrate synthetase và hiệu ứng Pasteur dựa trên sự chênh lệch ái lực của pyruvat decarboxylase ($K_m = 3 - 4\text{ mM}$) và pyruvat dehydrogenase ($K_m = 0,1 - 0,2\text{ mM}$). Về khả năng chống chịu điều kiện bất lợi, các nghiên cứu về nấm men chịu hạn (xerotolerant) như Zygosaccharomyces rouxii, Debaryomyces hansenii tích lũy polyols (arabitol, glycerol) để cân bằng áp suất thẩm thấu được phân tích cùng cơ chế ức chế của SO2 theo công bố của Schimz và Holzer (1979) về việc suy giảm ATP tế bào ở nồng độ 1 mM tại pH < 4.

Về công nghệ sản xuất whisky trên thế giới, tác giả điểm lại các tiêu chuẩn kỹ thuật của Scotland (chưng cất 2 lần trên nồi đồng pot still, tàng trữ tối thiểu 3 năm), Ireland (chưng cất 3 lần đạt 150°proof), và Mỹ (quy chuẩn Bourbon chứa tối thiểu 51% ngô, Corn whisky chứa từ 80% ngô trở lên, tàng trữ trong thùng gỗ sồi nướng). Các số liệu thị trường từ Euromonitor International, MarketLine và Grand View Research cũng được tổng hợp.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây được điểm lại gồm:

• Đề tài của Đặng Tất Thành (2006) về "Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để sản xuất rượu cao độ từ malt đại mạch", sản xuất rượu ở nồng độ 29%Vol và 39,9%Vol tàng trữ trong vò sành sứ ở nhiệt độ thấp, chưa qua tàng trữ với gỗ sồi.
• Đề tài của Nguyễn Đức Quang tại Viện Nghiên cứu Bia - Rượu - Nước giải khát về "Nghiên cứu sản xuất rượu có độ cồn cao từ nguồn Đại mạch Việt Nam", thực nghiệm quy mô 40 lít và 150 lít/mẻ, thu nhận sản phẩm 30%Vol nhưng chưa hoàn thiện dạng sản phẩm whisky.
• Đề tài của Nguyễn Minh Thu (2016) về "Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam", sử dụng công thức phối trộn malt : gạo : ngô = 2 : 1 : 7 ở quy mô công nghiệp nhưng còn tồn tại hạn chế về đặc tính hương vị, sự phù hợp của chủng nấm men và điều kiện tàng trữ với gỗ sồi.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: Tuyển chọn từ nguồn giống bản địa và định danh bằng sinh học phân tử một chủng nấm men thuần khiết có hoạt lực lên men cồn cao, ít tạo độc tố; xây dựng đồng bộ quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ 100% malt, 100% ngô và dòng phối trộn Blended whisky; xác định dòng gỗ sồi tối ưu và khảo sát động học biến đổi chất thơm qua 24 tháng tàng trữ; ứng dụng quy trình sản xuất quy mô công nghiệp đạt 10.000 lít tại doanh nghiệp đồ uống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên nguyên lý chuyển hóa sinh hóa và vi sinh học ứng dụng trong công nghệ sản xuất đồ uống có cồn:

• Động học lên men ethanol của nấm men: Phương trình tổng quát chuyển hóa glucose thành ethanol, CO2 và năng lượng ATP: $$\text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6 + 2\text{ADP} + 2\text{H}_3\text{PO}_4 \rightarrow 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 + 2\text{ATP} + 3\text{H}_2\text{O}$$ Vai trò của 3 isoenzyme alcol dehydrogenase và quá trình hình thành sản phẩm phụ (glycerol, axit succinic, diacetyl, acetoin, rượu bậc cao, este).
• Cơ chế xúc tác thủy phân tinh bột và protein: Hoạt tính của các enzyme carbohydrase ($\alpha$-amylase, $\beta$-amylase, $\gamma$-amylase/glucoamylase) phân cắt liên kết $\alpha$-1,4 và $\alpha$-1,6 glucoside; hệ enzyme protease (proteinase, peptidase, amidase) phân giải phân tử protein thành peptide, pepton, axit amin và nitơ amin tự do (FAN).
• Hóa học polyphenol gỗ sồi: Sự khuếch tán và chuyển hóa các hợp chất tannin thủy phân (ellagitannin, gallotannin như glucogallin, penta-galloyl-glucose, punicalagin), axit phenolic và các aldehyde thơm (vanillin, syringaldehyde, coniferaldehyde, sinapaldehyde) tạo màu sắc và hương vị đặc trưng cho whisky trong quá trình ngâm ủ.

Phương pháp nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Phương pháp vi sinh vật và sinh học phân tử: Nuôi cấy, phân lập nấm men trên môi trường thạch Hansen và YM; thử nghiệm khả năng đồng hóa 32 nguồn carbon bằng bộ kit ID 32C; định lượng mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và đo độ đục quang học (OD); tách chiết DNA, thực hiện phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) khuếch đại các vùng gen 28S (vùng D1/D2), ITS1-5.8S-ITS2 và 18S rRNA; giải trình tự gene và phân tích phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 6.
• Phương pháp hóa lý và sinh hóa: Định lượng hàm lượng đường khử và đường tổng số bằng phương pháp so màu xây dựng đường chuẩn maltose và D-glucose; định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry sử dụng đường chuẩn Albumin; đo độ hấp thụ quang học OD280nm và OD520nm để theo dõi sự trích ly polyphenol và biến đổi màu sắc; đo độ cồn (%Vol), axit tổng số, FAN, SO2; xác định hàm lượng methanol, acetaldehyde, este và các rượu bậc cao bằng phương pháp sắc ký khí đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
• Phương pháp cảm quan: Đánh giá cảm quan xếp hạng theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN), áp dụng hệ số quan trọng cho 4 chỉ tiêu: độ trong, màu sắc, mùi, vị.
• Phương pháp toán học: Phân tích, xử lý thống kê các dãy số liệu thực nghiệm.

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 15 dòng nấm men phân lập từ bánh men Mẫu Sơn (kí hiệu MS), Làng Vân (kí hiệu LV), Bắc Hà (kí hiệu BH); các chủng đối chứng thương mại TN2, EC1118; nguyên liệu ngô vàng hạt khô và malt đại mạch; 24 mẫu gỗ sồi thử nghiệm; đối chứng dữ liệu sắc ký với 3 sản phẩm whisky quốc tế: Singleton (Scotland, 100% malt), Jack Daniel's (Mỹ, 100% ngô), Knob Creek (Mỹ, 80% ngô phối trộn 20% malt).

Thành phần dinh dưỡng trong 100g ngô vàng hạt khô	Hàm lượng	Đơn vị tính
Nước (Water)	14,0	g
Protein	8,6	g
Chất béo (Fat)	4,7	g
Tinh bột (Carbohydrate)	69,4	g
Xenlulose (Fiber)	2,0	g
Đường tổng số	0,64	g
Tro (Ash)	1,3	g
Tổng số axit béo no	0,670	g
Tổng axit béo không no 1 nối đôi (MUFA)	1,250	g
Tổng axit béo không no nhiều nối đôi (PUFA)	2,160	g

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương 1 (38 trang) trình bày tổng luận cơ sở khoa học về nấm men, công nghệ lên men và chế biến whisky:

• Đặc điểm sinh học và dinh dưỡng của nấm men: Khái quát 15 chi nấm men điển hình (Brettanomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces...), cấu tạo thành tế bào (mannan, glucan, kitin), nhu cầu nguyên tố đa lượng theo tỷ lệ sinh khối C (1,72) : O (0,44) : N (0,15), nhu cầu vi lượng (K, Na, Mg, Zn, Fe; Cu kích thích ở 1,5 µmol/l nhưng ức chế ở 10 µmol/l), thứ tự sử dụng axit amin từ cao xuống thấp (Glutamine, Ammonium, Asparagine, Axit glutamic đứng đầu; Glycine, Histidine, Methionine đứng cuối).
• Động học lên men ethanol và các yếu tố ảnh hưởng: Cơ chế chuyển hóa qua 2 giai đoạn đường phân và khử acetaldehyde thành ethanol; kiểm soát dị hóa qua phosphofructokinase và citrate synthetase; yêu cầu oxy hòa tan (0,65 - 0,7 mg/l) để tổng hợp ergosterol và axit oleic; giới hạn nhiệt độ lên men thích hợp (24 - 30°C); pH tối ưu (4,5 - 5,5); mật độ tế bào giống ban đầu ($4 \times 10^6 - 10 \times 10^6\text{ tế bào/ml}$); hàm lượng nitơ FAN tối thiểu 100 mg/l; nồng độ SO2 diệt khuẩn thích hợp (75 - 110 ppm, không vượt quá 490 ppm).
• Phân loại và công nghệ sản xuất whisky: Phân biệt Single Malt Whisky, Grain Whisky, Rye, Bourbon, Blend, Pot Still; công nghệ chưng cất 2 lần của Scotland và 3 lần của Ireland; đặc tính hóa học gỗ sồi (cellulose 38-52%, hemicellulose 25-30%, lignin 22-25%, tannin 5-10%); các chế phẩm enzyme công nghiệp ($\alpha$-amylase Termamyl SC từ Bacillus stearothermophilus, glucoamylase Dextrozyme GA, protease Neutrase từ Bacillus subtilis); quy trình dịch hóa - đường hóa 4 giai đoạn nhiệt độ (45°C - 52°C - 64°C - 75°C).

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 (20 trang) chi tiết hóa quy chuẩn nguyên vật liệu, môi trường và các kỹ thuật phân tích:

• Nguyên vật liệu: 15 dòng nấm men phân lập từ bánh men rượu truyền thống Việt Nam; nấm men rượu vang thương mại đối chứng (S. cerevisiae TN2, S. bayanus EC1118); nguyên liệu malt đại mạch (độ ẩm, tỷ lệ trấu 20%, tấm 70%, bột 10%), ngô vàng hạt khô nghiền mịn; 24 mẫu gỗ sồi thử nghiệm xuất xứ khác nhau; các hóa chất tinh khiết phân tích.
• Kỹ thuật phân tích: Phương pháp lên men phòng thí nghiệm trên dịch malt và dịch ngô; quy trình tách chiết và giải trình tự gen D1/D2 28S rDNA, ITS1-5.8S-ITS2; quy trình phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký khí GC-FID và GC-MS; phương pháp so màu xác định đường bằng máy quang phổ UV-Vis; phương pháp chưng cất kiểm soát nhiệt độ phân đoạn; phương pháp đánh giá cảm quan cho điểm có trọng số theo TCVN.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 (80 trang) trình bày kết quả thực nghiệm và thảo luận chuyên sâu qua 7 nội dung:

1. Tuyển chọn chủng nấm men:

• Đánh giá khả năng lên men và phân tích cảm quan 15 dòng nấm men trên môi trường malt và ngô. Phân tích sắc ký khí sản phẩm sau chưng cất lần 1 và lần 2 cho thấy dòng MS42 phân lập từ bánh men Mẫu Sơn (Lạng Sơn) có khả năng sinh cồn cao, tạo lượng aldehyde và este hài hòa, hàm lượng độc tố methanol và furfural rất thấp so với các dòng còn lại và vượt trội hơn hai chủng đối chứng TN2, EC1118.

2. Đặc điểm sinh học và định danh chủng MS42:

• Tế bào hình tròn hoặc oval, kích thước trung bình $4 - 7\text{ }\mu\text{m}$, sinh sản vô tính nảy chồi, có khả năng hình thành túi chứa 4 bào tử túi khi gặp điều kiện cảm ứng; khuẩn lạc trên môi trường Hansen có màu trắng sữa, bề mặt mịn màng, mép đều.
• Khả năng đồng hóa carbon: Đồng hóa tốt glucose, maltose, galactose, saccharose, raffinose, trehalose; không đồng hóa lactose, cellobiose, inuline.
• Định danh phân tử: Giải trình tự đoạn gen 28S và ITS, phân tích cây phát sinh chủng loại bằng MEGA 6 cho thấy chủng MS42 đồng nhất 100% với loài Saccharomyces cerevisiae, được đặt tên khoa học là Saccharomyces cerevisiae MS42.

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của S. cerevisiae MS42:

• pH tối ưu cho sinh trưởng nằm trong khoảng 5,0 - 5,5; nồng độ oxy hòa tan ban đầu thích hợp là 0,65 - 0,7 mg/l; nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 24 - 30°C (tốt nhất tại 25°C); hàm lượng đường tổng số thích hợp trong dịch nhân giống là 160 - 180 g/l.
• Luận án đã thử nghiệm thành công việc sử dụng dịch chiết mầm giá đỗ thay thế pepton thương mại trong môi trường nhân giống nấm men, đạt mật độ tế bào tương đương nhưng giảm chi phí nguyên liệu.

4. Động học quá trình lên men rượu từ dịch malt và ngô:

• Dịch malt: Tỷ lệ phối trộn malt : nước tối ưu là 1 : 4; kích thước nghiền đạt 20% vỏ trấu, 70% hạt vỡ mảnh, 10% bột mịn. Bổ sung enzyme Termamyl SC và Dextrozyme GA giúp rút ngắn thời gian đường hóa. Lên men ở 25°C, pH 5,0 - 5,5, mật độ nấm men ban đầu $4 \times 10^6 - 10 \times 10^6\text{ tế bào/ml}$. Sau 36 - 48 giờ, sinh khối tế bào đạt cực đại $213 \times 10^6 - 215 \times 10^6\text{ tế bào/ml}$; kết thúc lên men sau 72 - 96 giờ, độ cồn trong dấm chín đạt 9,00 - 9,91%Vol, hiệu suất lên men đạt 89,52 - 91,13%, khả năng tích lũy cồn tối đa đạt 12,3%Vol.
• Dịch ngô: Nấu hồ hóa dưới áp lực ($1,5 \times 10^5\text{ Pa}$, 120°C trong 1,5 giờ), hạ nhiệt độ dịch hóa bằng Termamyl SC, đường hóa bằng Dextrozyme GA và bổ sung enzyme protease Neutrase để thủy phân protein ngô, làm giảm độ nhớt và gia tăng hàm lượng FAN (đạt trên 150 mg/l), đảm bảo dịch ngô lên men triệt để.

Thông số công nghệ lên men của chủng S. cerevisiae MS42	Giá trị tối ưu
Nồng độ đường tổng số ban đầu trong dịch lên men	160 - 180 g/l
Độ pH ban đầu của dịch lên men	5,0 - 5,5
Nhiệt độ lên men	20 - 30°C (tối ưu 25°C)
Mật độ nấm men gieo cấy ban đầu	$4 \times 10^6 - 10 \times 10^6$ tế bào/ml
Thời gian đạt mật độ tế bào tối đa (pha log)	36 - 48 giờ
Mật độ tế bào tối đa trong dịch lên men	$213 \times 10^6 - 215 \times 10^6$ tế bào/ml
Độ cồn thu được trong dịch lên men (dấm chín)	9,00 - 9,91%Vol
Hiệu suất lên men thực tế	89,52 - 91,13%
Khả năng chịu cồn tối đa	12,3%Vol

5. Công nghệ chưng cất phân đoạn rượu whisky:

• Chưng cất lần 1 thu nhận toàn bộ cồn thô (rượu bậc thấp).
• Chưng cất lần 2 trên nồi đồng có hệ thống hồi lưu: Tách bỏ 1,5 - 2,0% thể tích phân đoạn đầu (rượu đầu chứa nhiều acetaldehyde, ethyl acetate nồng độ cao); thu nhận phân đoạn tim (phần rượu chính có độ cồn 65 - 70%Vol dùng để tàng trữ); cắt chuyển sang phân đoạn cuối khi độ cồn dòng chảy xuống dưới 50%Vol (chứa nhiều axit hữu cơ và rượu bậc cao đuôi).

6. Nghiên cứu tàng trữ, tạo hương với gỗ sồi và phối trộn:

• Đánh giá cảm quan 24 mẫu gỗ sồi ngâm ủ trong 3 tháng và chọn lọc 4 mẫu ngâm 180 ngày; xác định mẫu gỗ sồi S8 (nhập khẩu từ Mỹ) cho tính chất cảm quan tối ưu về màu sắc hổ phách và phức hệ mùi vani, caramel, khói nhẹ.
• Đo OD280nm và OD520nm cho thấy hàm lượng polyphenol hòa tan tăng tuyến tính theo thời gian và tăng mạnh ở độ cồn ngâm ủ 55 - 60%Vol.
• Phân tích GC-MS định lượng các chất tạo hương tại các mốc 0, 6, 12, 18, 24 tháng: Các hợp chất vanillin, syringaldehyde, coniferaldehyde, ethyl octanoate, ethyl decanoate, isoamyl acetate gia tăng ổn định; đối chứng cho thấy cấu trúc hương thơm tương đồng với các mẫu whisky quốc tế (Singleton, Jack Daniel's, Knob Creek).
• Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn xác định công thức tối ưu cho dòng Blended whisky là 20% rượu chưng cất từ malt phối trộn với 80% rượu chưng cất từ ngô.

7. Quy trình công nghệ và sản xuất thử nghiệm:

• Xây dựng 2 quy trình công nghệ chuẩn hóa: Quy trình sản xuất whisky từ 100% malt đại mạch và quy trình sản xuất whisky từ ngô (có bổ sung enzyme dịch hóa, đường hóa, protease).
• Triển khai sản xuất thử nghiệm 10.000 lít tại Công ty Cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam gồm 3 dòng sản phẩm: Whisky 100% malt, Whisky 100% ngô và Blended whisky (20% malt + 80% ngô). Sản phẩm sau 24 tháng tàng trữ được kiểm nghiệm đạt đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo QCVN và tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm hiện hành đối với đồ uống có cồn.

Kết quả và những đóng góp mới

Về mặt lý luận và khoa học:

• Luận án đã phân lập, tuyển chọn và định danh chính xác bằng kỹ thuật sinh học phân tử chủng nấm men bản địa Saccharomyces cerevisiae MS42 từ nguồn bánh men rượu truyền thống Mẫu Sơn (Lạng Sơn). Chủng có các đặc tính ưu việt: Lên men dịch malt và ngô đạt độ cồn 12,3%Vol ở 25°C; mật độ tế bào đạt đỉnh $213 \times 10^6 - 215 \times 10^6\text{ tế bào/ml}$ sau 36 - 48 giờ; hiệu suất lên men đạt 89,52 - 91,13%; sinh rất ít độc tố (methanol, acetaldehyde, furfural).
• Cung cấp dữ liệu khoa học toàn diện về động thái biến đổi các chất tạo hương (aldehyde, este, axit hữu cơ, polyphenol) và các chỉ số quang học trong quá trình tàng trữ rượu whisky với gỗ sồi theo thời gian 6, 12, 18 và 24 tháng trong điều kiện khí hậu Việt Nam.
• Thiết lập hệ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình dịch hóa, đường hóa và lên men hai nguồn cơ chất tinh bột từ malt đại mạch và ngô vàng hạt khô có bổ sung các enzyme thương mại (Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase).

Về mặt thực tiễn và ứng dụng:

• Xác định được chủng nấm men S. cerevisiae MS42, nguồn nguyên liệu ngô hạt vàng nội địa, malt đại mạch và loại gỗ sồi S8 nhập khẩu từ Mỹ phù hợp cho công nghệ sản xuất rượu whisky tại Việt Nam.
• Đề xuất giải pháp sử dụng dịch chiết mầm giá đỗ thay thế pepton trong môi trường nhân giống nấm men giúp hạ giá thành sản xuất ở quy mô công nghiệp.
• Xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất 3 dòng sản phẩm whisky hoàn chỉnh: Single Malt Whisky (100% malt đại mạch), Corn Whisky (100% ngô) và Blended Whisky (20% malt phối trộn 80% ngô).
• Ứng dụng triển khai sản xuất thử nghiệm thành công 10.000 lít rượu whisky tại Công ty Cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam; các sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy chuẩn quốc gia, được các đối tác khách hàng từ Trung Quốc và Singapore đánh giá tích cực.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về hạn chế, luận án chỉ ra rằng thời gian nghiên cứu theo dõi quá trình tàng trữ rượu với gỗ sồi trong khuôn khổ đề tài mới dừng lại ở mốc 24 tháng (2 năm), trong khi các dòng whisky thương mại cao cấp trên thế giới thường có chu kỳ ngâm ủ kéo dài từ 3 đến 5 năm hoặc lâu hơn. Ngoài ra, loại gỗ sồi tối ưu được lựa chọn trong nghiên cứu (kí hiệu S8) vẫn phải nhập khẩu từ Mỹ, chưa khảo sát được các nguồn gỗ sồi hoặc vật liệu thực vật thay thế tương đương sinh trưởng tự nhiên tại Việt Nam.

Về hướng nghiên cứu tiếp, luận án đề xuất:

• Tiếp tục theo dõi, đánh giá động thái biến đổi các hợp chất thơm và chất lượng cảm quan của sản phẩm ở các mốc thời gian tàng trữ dài hơn (36, 48, 60 tháng).
• Nghiên cứu khả năng khai thác các nguồn nguyên liệu ngũ cốc bản địa khác (như gạo nếp, lúa mạch vùng cao) và tìm kiếm các loài thực vật chứa polyphenol trong nước có thể ứng dụng trong quá trình ngâm ủ hoàn thiện hương vị rượu.
• Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống thiết bị chưng cất liên tục kết hợp gián đoạn ở quy mô công nghiệp lớn hơn nhằm tối ưu hóa chi phí năng lượng và tăng hiệu suất thu hồi cồn.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm và Đồ uống: Tham khảo quy trình phân lập, tuyển chọn, định danh vi sinh vật bằng công cụ phân tử (PCR, giải trình tự rDNA, MEGA 6), phương pháp khảo sát động học lên men và quy trình phân tích sắc ký GC-FID, GC-MS định lượng chất thơm.
• Kỹ sư công nghệ và chuyên gia kỹ thuật tại các nhà máy sản xuất cồn - rượu - đồ uống: Ứng dụng trực tiếp chế độ đường hóa 4 giai đoạn nhiệt độ (45°C - 52°C - 64°C - 75°C), tỷ lệ phối hợp enzyme thủy phân (Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase), kỹ thuật kiểm soát phân đoạn chưng cất lần 2 và phương pháp nhân giống nấm men dùng dịch chiết giá đỗ.
• Doanh nghiệp sản xuất đồ uống và cơ quan quản lý ngành: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, quy chuẩn kỹ thuật cho dòng sản phẩm whisky nội địa, góp phần đa dạng hóa sản phẩm chế biến sâu từ nông sản ngô và giảm tỷ trọng nhập siêu đồ uống cao độ.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng nấm men nào được tuyển chọn trong luận án và có nguồn gốc từ đâu?
Chủng nấm men được tuyển chọn là dòng MS42, phân lập từ bánh men rượu truyền thống tại xã Mẫu Sơn, huyện Lộc Bình (trong văn bản ghi Bình Lộc), tỉnh Lạng Sơn. Kết quả phân tích sinh học phân tử đoạn gen 28S và ITS trên phần mềm MEGA 6 đã định danh chính xác chủng này là loài Saccharomyces cerevisiae MS42.

2. Chủng S. cerevisiae MS42 đạt được những chỉ số lên men cơ bản nào?
Trong điều kiện nuôi cấy tối ưu (nhiệt độ 25°C, pH 5,0 - 5,5, hàm lượng đường 160 - 180 g/l), chủng MS42 sinh trưởng đạt mật độ tế bào cực đại $213 \times 10^6 - 215 \times 10^6\text{ tế bào/ml}$ sau 36 - 48 giờ; độ cồn dịch lên men đạt 9,00 - 9,91%Vol; hiệu suất lên men đạt 89,52 - 91,13%; nồng độ cồn chịu đựng tối đa đạt 12,3%Vol và tạo rất ít độc tố (methanol, acetaldehyde, furfural).

3. Các enzyme công nghiệp nào được sử dụng để tối ưu hóa quá trình đường hóa dịch ngô và malt?
Luận án sử dụng enzyme $\alpha$-amylase chịu nhiệt Termamyl SC (dịch hóa tinh bột, giảm độ nhớt), enzyme glucoamylase Dextrozyme GA (đường hóa phân cắt liên kết $\alpha$-1,4 và $\alpha$-1,6 glucoside thành glucose) và enzyme protease Neutrase từ Bacillus subtilis (thủy phân protein ngô, giải phóng axit amin và gia tăng hàm lượng nitơ amin tự do FAN).

4. Luận án đã lựa chọn loại gỗ sồi nào và nghiên cứu động học tạo hương trong thời gian bao lâu?
Luận án đã khảo sát 24 mẫu gỗ sồi trong 3 tháng và 4 mẫu trong 180 ngày, từ đó chọn mẫu gỗ sồi S8 nhập khẩu từ Mỹ. Động thái trích ly polyphenol (OD280nm, OD520nm) và sự hình thành các hợp chất tạo hương thơm đặc trưng (vanillin, syringaldehyde, các este bay hơi) được phân tích bằng GC-MS định kỳ qua các mốc 0, 6, 12, 18 và 24 tháng tàng trữ.

5. Kết quả sản xuất thử nghiệm quy mô công nghiệp tại doanh nghiệp đạt sản lượng bao nhiêu và gồm những sản phẩm nào?
Quy trình công nghệ đã được áp dụng sản xuất thử nghiệm thành công 10.000 lít rượu whisky tại Công ty Cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam, bao gồm 3 dòng sản phẩm: Whisky 100% malt, Whisky 100% ngô và Blended whisky (phối trộn 20% malt và 80% ngô). Tất cả sản phẩm đều đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và tiêu chuẩn an toàn thực phẩm đối với đồ uống có cồn.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Quyên đã giải quyết đồng bộ các mục tiêu khoa học và thực tiễn trong việc tuyển chọn chủng nấm men bản địa Saccharomyces cerevisiae MS42 phục vụ sản xuất rượu whisky từ nguồn nguyên liệu ngô hạt vàng và malt đại mạch. Đề tài đã chuẩn hóa các thông số công nghệ từ khâu dịch hóa, đường hóa, lên men, chưng cất phân đoạn đến tàng trữ 24 tháng với gỗ sồi S8 nhập khẩu từ Mỹ. Kết quả triển khai sản xuất thử nghiệm 10.000 lít tại Công ty Cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam khẳng định tính khả thi của quy trình công nghệ, tạo tiền đề khoa học cho việc chủ động sản xuất các dòng sản phẩm whisky chất lượng cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Tông quan vẫn đề nghiên cứu (38 trang) Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang) Chương 3: Kết quả và thảo luận (80 trang) CHUONG 1. TONG QUAN VAN DE NGHIEN CUU 1. Đại cương về nấm men Nắm men là nhóm nắm đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, có kích thước, đường kính té bao tir 3 — 10 pm. Tuy lodi nam men tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình elíp, hình mũ phớt, hình sao thé, hình cái liềm, hình thoi, hình cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình thấu kính, hình quả lê, hình bán cầu có rìa hẹp.

Thành tế bào nắm men Saccharomyces co cau tao chi yéu tit mannan va glucan, ở một số chỉ có thêm kitin. Màng tế bào chất gồm 2 lớp phân tir phospholipid với mỗi liên kết este đặc trưng cho màng các vi sinh vật nhân thực. Trong tế bào chất có các bào quan như: nhân, ti thé, riboxôm, không bao, thé Golgi,. Nhan tế bảo của Saccharomyces cerevisiae có 16 nhiễm sắc thê (đơn bội — 1n) hoặc l6 cặp nhiễm sắc thể (lưỡng bội - 2n).

Ngoài nhân còn có nhiều yếu tố di truyền khác như plasmid, yếu tố di truyền vận động (Transposon). Khối lượng riêng của tế bào nắm men là 1,055 - 1,060 KDa, không khác biệt nhiều so với tế bào vi khuẩn (1,050 - 1,112 KDa). Nắm men đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người, chúng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, điển hình là công nghiệp sản xuất rượu, cồn, rượu vang, bia, thực phẩm và các hoạt chất sinh hoc,. Việc phân loại đối với nắm men nói chung rất phức tạp và thường dựa trên các chỉ tiêu chủ yếu sau: - Đặc điểm tế bảo sinh dưỡng (hình dạng, cau tạo, kích thước.) - Đặc điểm sinh sản hữu tính và đặc điểm sinh lý, nuôi cấy (khả năng đồng hoá carbon, đồng hoá nitrat, phản ứng DBB (phản ứng với Diazonium Blue B).

Cho đến nay đã có nhiều khoá phân loại nắm men của các tác giả: Lodder. (1983), Kreger-Van Rij. Một số kỹ thuật điển hình hiện nay trong phân loại học phân tử: Phân ích trình tự DNA, Kỹ thuật PCR, Lai phân tử, Điện đi izozym. Cách phân loại nắm men dua vao các tiêu chí [8], [47].

3- Các đặc điểm sinh hóa (thành tế bào, coenzyme Q10,.), đặc điểm sinh lí (nguồn dinh dưỡng C, N,., pH, TỶ tối ưu,.) 4- Các đặc điểm sinh học phân tử (trình tự DI, D2 của gen 28S; ITS1, ITS2 ở 2 bên của gen 5,8S và trình tự RNA - rib6x6m 18S.) Hiện nay, nắm men đã xác định được: 1110 loài/ 58 chứ 17 họ / Bộ Saccharomycetales/ Lớp Saccharomycetes/ Ngành Ascomycota [139]. Đặc điểm sinh học cơ bản của nắm men 1. Sinh sản của nấm men Nắm men duy trì nòi giống bang hai hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Tuy nhiên, có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội, lưỡng bội khác nhau trong vòng đời của nắm men hoặc tùy theo môi trường.

- Sinh sản vô tính: Nẵẫm men sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất ở nắm men thể hiện qua sự xuất hiện của chổi từ vi tri seo chéi [76]. Ngoài ra ở nắm men còn có hình thức sinh sản vô tính bằng bảo tử như: bào tử đốt (ở chỉ Georichum), bào tử bắn (ở chỉ Sporobolomyces), bào tử áo (ở nắm Candida albicans) [S6], [100]. Sinh sản vô tính có ưu điểm: tốc độ sinh sản nhanh, chiếm lĩnh môi trường, Ít đột biến, ôn định di truyền.

- Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính ở nắm men xuất hiện ở các chỉ Saccharomyces, Zygosaccharomyces va nhiéu chi nam men khac thuộc bộ Edornycetales. Quá trình sinh sản liên quan tới sự tạo thành bảo tử túi từ tế bảo sinh đưỡng kèm theo quá trình giảm phân gồm giảm phân 1 và giảm phân 2, trong đó chỉ có 1 lần nhân đôi nhiễm sắc thê ở giảm phân I, vì vậy từ tế bào lưỡng bội (2n) tạo thành 4 bào tử đơn bội (n). Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sinh sản vô tính ở môi trường mới, các bào tử nảy mầm thành té bào mới và nảy chỗi tiếp theo trở về sinh sản vô tính [8], [44]. Các nắm men lớp Ascomycetes có dạng sinh sản hữu tính hình thành túi bảo tử chứa các bào tử túi (Ascospores) do kết quả của quá trình giảm phân.

Ví dụ túi bào tử và bào tử túi của 3 loài nắm men phô biến như sau [100]: @ Qo bop Bà Đề &® kg PRE S. cerevisiae Pichia farinosa Schizosaccharomyces octosporus Hình 1.1: Bào tử và túi bảo tử của nắm men [84] Sinh sản hữu tính: thường xảy ra khi ở điều kiện môi trường khắc nghiệt. Thế hệ con có đặc điểm khác biệt về vật chất di truyền, tạo nguồn nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên, có ý nghĩa sinh tồn, tiễn hóa. - Chu kì sống của nấm men Sau quá trình giảm phân, các bảo tử túi sẽ được sinh ra (thường là 4 bảo tử túi).

Khi không có sinh sản hữu tính chúng vẫn liên tục nây chồi để sinh sản. Chu kì này thấy ở nắm men ruou S. Sinh sản vô tính đâm chói 2n Giảm nhiễm (tạo túi và các bảo tử túi) Hình 1.2: Chu kì sinh sản của nắm men $. cerevisiae [56] Yếu tố quyết định và quan trọng nhất là các đặc tính di truyền của tế bào qua sinh sản vô tính nảy chéi truyén lai cho thé hệ sau.

Đặc tính này được thể hiện rõ ở nam men S. Phan chia Quá trinh tế bảo nẩy chồi Giai đoạn Sau của quá trinh phân chia nhân 4) Hình 1.3: Các pha nguyên phân của nắm men S. cerevisiae [56] Chu kỳ sinh sản vô tính của tế bào được chia làm 4 pha: GI, S (giai đoạn tông hợp DNA), G2 và M (các kì nguyên phân), trong đó pha G2 ngắn hơn do có sẹo chi. Đặc điểm sinh lí — sinh hóa nắm men a/ Đông hóa các hợp chất carbon Chuyên hóa carbon là nền tảng cho sản xuất các thành phần tế bào và cung cấp chuyên hóa năng lượng.

Để thử nghiệm khả năng đồng hóa các hợp chất carbon của chủng nam men S. cerevisiae, 20 loai hop chất có thể sử dụng trong giai đoạn dau [8], [44], [81]: - Cac hexose: glucose, galactose, sorbose, methuyl-D-glucoside salicine, arbutine - Cac pentose: D - xylose, L - arabinose, D va L — ribose, L — rhamnose. - Cac disaccharide: saccharose, lactose, maltose, melibiose, trehalose, cellobiose. - Trisaccharide: rafinose, melezitose - Polysaccharide: tinh bot, inuline Sau đó, nhóm các hợp chất tiếp theo gdm [81]: - Ruou: methanol, ethanol, glyxerol, ribitol, galactiol, erythritol, mannitol, sorbitol, inositol.

- Các axit hữu cơ: lactic, succinic, citric, pyruvic, malic, glucuronic, 2-xetogluconic Phương pháp đề thử các loại đường tương đối đơn giản đó là cho nguồn đường là hợp chất cần nghiên cứu vào môi trường thạch Difco 2% và có nitơ nắm men. Phương pháp này có thuận lợi là nhanh chóng có kết quả. Khi nắm men có sinh trưởng thì xác định được chủng nắm men nghiên cứu có thể sử dụng được nguồn đường bổ sung. Thử nghiệm sự thủy phân arbutine được thực hiện trên môi trường có arbutine (5%), thạch 2 % trong ống nghiệm đặt nghiêng.

Nếu arbutine được thủy phân thì màu nâu sẽ xuất hiện trong môi trường sau 2 — 7 ngày ở 25°C [6], [84]. Hiện nay, phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định khả năng đồng hóa các hợp chat carbon là dùng bộ kit thử. Nguyên tắc chung là dựa trên sự phát hiện các enzyme, nhóm enzyme tham gia chuyền hóa các hợp chất carbon có trong vi sinh vật. Ví dụ: sử dụng kít ID 32C, có khả năng phát hiện 32 loại hợp chất carbon có thể được dùng cho chuyên hóa vật chất và năng lượng trong tế bảo.

b/ Đông hóa các hợp chất nitơ Nguồn nitơ rất cần thiết cho sự sống và quá trình trao đôi chất của chúng được điều hòa chính xác. Hiện nay, nghiên cứu khả năng đồng hóa các hợp chất nitơ chủ yếu sử dụng 2 nguồn là: nitrat kali và chlorhydrat ethylamin, thí nghiệm thực hiện theo phương pháp auxanographic (khuyết dưỡng tự ghi) trong môi trường cơ bản nước chiết ndm men (Difco) hay trên môi trường tổng hợp không có nitơ [44] [56]. cerevisiae vật liệu nitơ cho sinh tổng hợp axit amin chủ yếu được chuyên đổi từ glutamate và glutamine. Nitơ amin từ glutamate và nhóm amin từ glutamine chiếm lần lượt 85% và 15% trong tổng số nitơ của tế bào [86].

Trong khi do, glutamate và glutamine hoạt động với œ-ketoglutarate để kết nối chu trình TCA và chuyển hóa niơ thông qua glutamate dehydrogenase, phụ thuộc NADPH (GDHI), glutamine synthetase (GLNI), glutamate synthase phụ thuộc NADH (GLTI) va glutamate dehydrogenase liên kết với NAD (GDH2) [138]. Chuyên hóa nitơ đã được chứng minh là rất quan trọng trong quá trình dị hóa và đồng hóa protein, axit amin và các hợp chất nitơ khác. Do đó, nitơ đóng một vai trò chỉ phối nói chung sự trao đổi chất. Điều hòa chuyên hóa nitơ bao gồm một tập hợp các quá trình liên kết với nhau, chẳng hạn như hệ thống cảm biến báo hiệu Ssy1-Ptr3-Ssy5 (hệ thống cảm biến SPS) [58].

Nhu cầu dinh dưỡng cơ bản của nẫm men Nắm men có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Các quá trình trao đổi chất là khác nhau, do vậy nhu cầu dinh dưỡng cũng khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ các nhân tố cần thiết để tế bào nắm men sinh trưởng. Tỉ lệ các nguyên tổ trong sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae là C: 1,72; O: 0,44; N: 0,15 khi nuôi nắm men này trong điều kiện hiểu khí và trên môi trường chứa glucose và khoảng 10% chất tro [100].

Môi trường cần cung cấp đầy đủ và đúng tỉ lệ các nguyên tố trên cho nắm men sinh trưởng. Các hợp chất carbon (đường, rượu, axit hữu cơ,.) cung cấp nguồn năng lượng cho nắm men, đồng thời cung cấp hydro cần thiết để tông hợp sinh khối tế bảo. - Nhu cau nito: Nitơ đứng thứ 2 về số lượng cho cấu trúc tế bào cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Nitơ cần dùng cho tế bào tổng hợp các axit amin, các nucleotid và một số vitamin.

Rất nhiều nguồn nitơ có thể được sử dụng. Tat cả các nắm men có khả năng sử dụng nitơ dưới dạng anion. Các anion có thể đưa vào môi trường dưới dạng clorua amon, nitrat amon, phosphat amon và sulfat amon. Trong đó, sulfat amon có ưu điểm hơn vì nó đồng thời cung cấp lưu huỳnh cần thiết để tổng hợp một vài loại axit amin có lưu huỳnh [6], [44].

Vài loại nam men có khả năng sử dụng nitrit và nitrat như: Hansenula, Pachysolen, Citeromyces va Candida va Trichosporon.