Nghiên Cứu Tuyển Chọn Chủng Bacillus Có Hoạt Tính Diệt Sâu Từ Đất

Nghiên cứu tuyển chọn chủng bacillus có khả năng diệt sâu từ đất, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững và an toàn cho môi trường.

• Tác giả: Bùi Thị Quý
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Khánh Huyền
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Tài nguyên và môi trường
• Đề tài: Nghiên Cứu Tuyển Chọn Chủng Bacillus Có Hoạt Tính Diệt Sâu Từ Đất
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• TÓM TẮT KHÓA LUẬN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Thực trạng sử dụng thuốc BVTV tại Việt Nam
• 1.2. Tổng quan về thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis
• 1.3. Đặc điểm và đặc tính về độc tố của Bacillus Thuringiensis
• 1.4. Cơ chế gây độc của Bacillus thuringiensis
• 1.5. Vai trò của thuốc trừ sâu sinh học trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường
• 1.6. Nghiên cứu về thuốc trừ sâu sinh học trong và ngoài nước
• 1.6.1. Nghiên cứu trên thế giới
• 1.6.2. Nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
• 2.4.3. Xác định hoạt tính diệt sâu
• 2.4.4. Đánh giá đặc tính sinh học của vi khuẩn
• 2.4.4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập vi khuẩn
• 3.2. Kết quả đánh giá hoạt lực diệt sâu của vi khuẩn
• 3.3. Đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
• 3.3.1. Kết quả đánh giá khả năng enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn
• 3.3.2. Kết quả xác định thời gian mọc của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.3.3. Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn
• 3.3.4. Kết quả xác định khoảng pH thích hợp với các chủng vi khuẩn
• 3.3.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn
• 3.3.6. Kết quả đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn
• 3.4. Kết quả phân lập tuyển chọn vi khuẩn
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
• PHỤ LỤC 2: ĐỀ CƯƠNG KHOÁ LUẬN

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Bacillus Diệt Sâu Từ Đất Nông Nghiệp

Nghiên cứu về Bacillus diệt sâu từ đất nông nghiệp ngày càng trở nên cấp thiết trong bối cảnh sản xuất nông nghiệp bền vững. Việc lạm dụng thuốc BVTV hóa học gây ra nhiều hệ lụy, từ ô nhiễm môi trường đến ảnh hưởng sức khỏe con người. Bacillus là một chi vi khuẩn có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sâu hại một cách tự nhiên và an toàn. Khóa luận này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính diệt sâu cao từ đất, nhằm tạo ra các chế phẩm sinh học thay thế thuốc trừ sâu hóa học. Mục tiêu là tìm ra những chủng Bacillus bản địa có hiệu quả cao và thân thiện với môi trường, góp phần vào sự phát triển của nền nông nghiệp sạch và bền vững. Nghiên cứu này hướng đến việc cung cấp một giải pháp diệt sâu sinh học hiệu quả, giảm thiểu sự phụ thuộc vào hóa chất độc hại.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Việc Nghiên Cứu Bacillus Diệt Sâu

Sản xuất nông nghiệp bền vững đang trở thành xu hướng tất yếu. Sử dụng các biện pháp phòng trừ sâu bệnh sinh học là một trong những giải pháp quan trọng. Nghiên cứu Bacillus có khả năng diệt sâu hại nông nghiệp giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Việc phát triển các sản phẩm sinh học từ Bacillus sẽ giúp nông dân có thêm lựa chọn an toàn và hiệu quả trong việc bảo vệ cây trồng. Theo Lê Xuân Định (2015), việc sử dụng các sản phẩm sinh học thay thế sản phẩm hóa học trong BVTV là một phương án lâu dài và ưu tiên áp dụng trong phát triển nông nghiệp bền vững.

1.2. Giới Thiệu Về Chi Bacillus Và Tiềm Năng Diệt Sâu

Bacillus là một chi vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có khả năng tạo bào tử. Một số loài Bacillus, đặc biệt là Bacillus thuringiensis (Bt), có khả năng sản sinh ra các protein độc tố có khả năng diệt sâu hiệu quả. Các protein này tác động lên hệ tiêu hóa của sâu, gây tê liệt và dẫn đến tử vong. Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là trong đất. Bacillus thuringiensis là tác nhân sinh học đầu tiên được nghiên cứu và sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới, và là sản phẩm nổi tiếng nhất thế giới hiện nay (Võ Minh Phát, 2010).

II. Vấn Đề Sử Dụng Thuốc BVTV và Cần Bacillus Diệt Sâu

Việc sử dụng thuốc BVTV hóa học trong nông nghiệp Việt Nam đang diễn ra tràn lan, gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng. Dư lượng thuốc BVTV trong nông sản vượt quá ngưỡng cho phép, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và gây khó khăn trong việc xuất khẩu nông sản. Thuốc BVTV hóa học còn gây ô nhiễm môi trường đất, nước, và không khí, làm mất cân bằng sinh thái. Việc sử dụng các chủng Bacillus diệt sâu là một giải pháp thay thế tiềm năng, giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc BVTV hóa học và bảo vệ môi trường. Giải pháp tối ưu là phòng trừ sâu bệnh tổng hợp. Trong đó, giải pháp đã và đang được chọn để hướng tới là sử dụng thuốc BVTV sinh học để thay thế.

2.1. Thực Trạng Sử Dụng Thuốc BVTV Tại Việt Nam Và Hậu Quả

Theo Phạm Văn Toàn (2013), lượng và loại thuốc BVTV bắt đầu tăng từ những năm 1970, đặc biệt tăng nhanh từ cuối những năm 1980 đến 2010. Kết quả kiểm tra 25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau và tới 54% mẫu rau tại các tỉnh phía phát hiện có dư lượng thuốc BVTV (Công bố của Cục Trồng trọt tại hội nghị ngày 25/8/2009). Tình trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật không có xu hướng giảm kèm theo đó là những hậu quả nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và môi trường, ảnh hưởng đến sự phát triển của một nền nông nghiệp bền vững.

2.2. Ưu Điểm Của Diệt Sâu Sinh Học Bằng Chủng Bacillus

Diệt sâu sinh học bằng chủng Bacillus có nhiều ưu điểm so với thuốc BVTV hóa học. Bacillus có khả năng diệt sâu một cách chọn lọc, ít gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có ích khác. Các sản phẩm từ Bacillus an toàn cho người và động vật, không gây ô nhiễm môi trường. Diệt sâu sinh học còn giúp duy trì sự cân bằng sinh thái trong hệ sinh thái nông nghiệp. Theo báo cáo tổng kết của 10 nước ASEAN vào năm 2016 thì Việt Nam là nước đứng đầu ASEAN về số lượng cũng như chủng loại thuốc BVTV sinh học đã đăng ký và sử dụng.

III. Phương Pháp Tuyển Chọn Chủng Bacillus Diệt Sâu Hiệu Quả

Để tuyển chọn được chủng Bacillus có hoạt tính diệt sâu cao, cần áp dụng một quy trình nghiên cứu khoa học bài bản. Quy trình này bao gồm các bước: lấy mẫu đất, phân lập vi khuẩn, xác định hoạt tính diệt sâu, đánh giá đặc tính sinh học, và đánh giá mức độ an toàn sinh học. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại trong phân tích vi sinh vật đất sẽ giúp tăng hiệu quả của quá trình tuyển chọn. Cần tập trung vào việc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện môi trường địa phương.

3.1. Quy Trình Phân Lập Bacillus Từ Đất Và Xác Định Hoạt Tính Diệt Sâu

Quá trình phân lập Bacillus từ đất bao gồm các bước: lấy mẫu đất, xử lý mẫu, cấy mẫu lên môi trường chọn lọc, và phân lập các khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus. Hoạt tính diệt sâu được xác định bằng cách cho sâu ăn các mẫu vi khuẩn và theo dõi tỷ lệ sâu chết. Các chủng Bacillus có tỷ lệ sâu chết cao sẽ được lựa chọn để nghiên cứu tiếp. Từ 9 mẫu đất, 3 mẫu rau đề tài đã phân lập được 18 chủng vi sinh vật, trong đó có 6 chủng có đặc điểm hình thái gần với chi Bacillus bào gồm các chủng B1A, B4B, B3C, B4C, B5C, B6C.

3.2. Đánh Giá Đặc Tính Sinh Học Của Các Chủng Bacillus

Đặc tính sinh học của các chủng Bacillus được đánh giá dựa trên các yếu tố: khả năng sinh trưởng, khả năng sinh enzyme, khả năng kháng kháng sinh, và khả năng chịu pH và nhiệt độ khác nhau. Các chủng Bacillus có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện môi trường khắc nghiệt sẽ có tiềm năng ứng dụng cao trong thực tế. Tiến hành đánh thử hoạt lực diệt sâu trên 6 chủng kết quả thu được có 3 chủng được chọn có hoạt tính diệt sâu đạt yêu cầu là chủng B1A, B5C, B6C (từ 80% trở lên).

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tuyển Chọn Thành Công Chủng Bacillus B1A

Nghiên cứu đã tuyển chọn thành công chủng Bacillus B1A từ đất nông nghiệp. Chủng Bacillus này có hoạt tính diệt sâu cao, có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện môi trường địa phương, và an toàn cho người và môi trường. Chủng Bacillus B1A có tiềm năng lớn để phát triển thành các chế phẩm sinh học diệt sâu hại nông nghiệp hiệu quả. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng chủng Bacillus B1A trong thực tế.

4.1. Mô Tả Chi Tiết Về Chủng Bacillus B1A Đã Tuyển Chọn

Chủng Bacillus B1A có đặc điểm hình thái khuẩn lạc tròn, màu trắng ngà, bề mặt nhẵn. Tế bào vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng tạo bào tử. Chủng Bacillus B1A có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường và có khả năng sinh enzyme phân giải protein và tinh bột. Khi đánh giá mức độ an toàn sinh học của 3 chủng trên cho kết quả chủng B5C và B6C gây bệnh cho rau củ quả (làm khoai tây bị thối nhũn), và chỉ có chủng B1A đảm bảo an toàn sinh học.

4.2. Hiệu Quả Diệt Sâu Của Chủng Bacillus B1A Trong Thí Nghiệm

Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus B1A có hiệu quả diệt sâu cao đối với nhiều loại sâu hại nông nghiệp, bao gồm sâu tơ, sâu xanh, và sâu cuốn lá. Tỷ lệ sâu chết sau khi tiếp xúc với chủng Bacillus B1A đạt trên 80%. Chủng Bacillus B1A có khả năng ức chế sự phát triển của sâu và làm giảm thiệt hại cho cây trồng.

4.3. Khả Năng Ứng Dụng Chủng Bacillus B1A Trong Nông Nghiệp

Chủng Bacillus B1A có tiềm năng lớn để ứng dụng trong nông nghiệp bền vững. Chủng Bacillus này có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học diệt sâu hại cho nhiều loại cây trồng. Việc sử dụng chủng Bacillus B1A sẽ giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc BVTV hóa học và bảo vệ môi trường.

V. Ứng Dụng Bacillus Trong Nông Nghiệp Giải Pháp Bền Vững

Ứng dụng Bacillus trong nông nghiệp mở ra hướng đi mới cho nền nông nghiệp bền vững. Việc sử dụng các chủng Bacillus không chỉ giúp bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Các sản phẩm sinh học từ Bacillus dễ dàng tích hợp vào các hệ thống canh tác hiện có, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người nông dân. Điều này thúc đẩy sự phát triển của nông nghiệp hữu cơ và nông nghiệp sạch.

5.1. Sản Phẩm Sinh Học Từ Bacillus Và Lợi Ích Kinh Tế

Sản phẩm sinh học từ Bacillus mang lại nhiều lợi ích kinh tế cho người nông dân. Giảm chi phí thuốc trừ sâu, tăng năng suất và chất lượng cây trồng. Sản phẩm an toàn, giúp nông sản đáp ứng tiêu chuẩn xuất khẩu, tăng giá trị thương mại. Điều này khuyến khích nông dân chuyển đổi sang phương pháp canh tác bền vững.

5.2. Kinh Nghiệm Ứng Dụng Bacillus Diệt Sâu Trong Thực Tế

Nhiều nông dân đã thành công trong việc ứng dụng Bacillus diệt sâu trên các loại cây trồng khác nhau. Các chủng Bacillus được phun lên lá hoặc tưới vào gốc cây, giúp kiểm soát sâu bệnh hiệu quả mà không gây hại cho thiên địch và môi trường. Chia sẻ kinh nghiệm, người nông dân góp phần lan tỏa phương pháp canh tác thân thiện với môi trường.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Bacillus Diệt Sâu

Nghiên cứu về Bacillus diệt sâu đã chứng minh tiềm năng to lớn của vi sinh vật trong việc bảo vệ cây trồng và phát triển nông nghiệp bền vững. Việc tuyển chọn và ứng dụng các chủng Bacillus bản địa sẽ giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc BVTV hóa học và bảo vệ môi trường. Cần tiếp tục đầu tư vào nghiên cứu để phát triển các sản phẩm sinh học từ Bacillus hiệu quả và an toàn hơn. Quan trọng là tạo ra chế phẩm sinh học diệt sâu thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học.

6.1. Đánh Giá Tiềm Năng Của Chủng Bacillus B1A

Chủng Bacillus B1A có tiềm năng lớn để phát triển thành chế phẩm sinh học diệt sâu hiệu quả. Khả năng sinh trưởng tốt, an toàn, diệt sâu cao làm cho chủng Bacillus này trở thành lựa chọn hàng đầu. Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế diệt sâu, điều kiện tối ưu để ứng dụng Bacillus B1A trong thực tế.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Bacillus Diệt Sâu

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ Bacillus diệt sâu. Xác định gen diệt sâu, tăng cường hoạt tính, kết hợp với các tác nhân sinh học khác. Nghiên cứu về tác động của Bacillus đến môi trường và hệ sinh thái nông nghiệp cũng cần được quan tâm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nông nghiệp giữ vai trò nền tảng trong cơ cấu kinh tế - xã hội Việt Nam, trong đó ngành trồng trọt đóng góp từ 64% đến 68% tổng giá trị sản xuất nông nghiệp toàn ngành. Riêng nhóm rau màu đạt diện tích canh tác khoảng 1,12 triệu ha với tổng sản lượng 18,6 triệu tấn/năm (theo số liệu của Tổng cục Thống kê tính đến ngày 01/01/2022). Tuy nhiên, phương thức canh tác nông nghiệp thâm canh đang phụ thuộc nặng nề vào các loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học. Việc lạm dụng hóa chất BVTV đã dẫn đến tình trạng mất cân bằng sinh thái, tiêu diệt các loài thiên địch có ích, gia tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh và gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước.

Thực trạng tồn dư hóa chất trong nông sản đang ở mức báo động: kết quả kiểm tra 25 mẫu rau của Cục Trồng trọt (2009) cho thấy 44% mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc và 54% mẫu rau tại các tỉnh phía Nam phát hiện có dư lượng thuốc BVTV, trong đó 8,6% số mẫu chứa hàm lượng đủ khả năng gây ngộ độc cấp tính cho người tiêu dùng (Võ Nhất Sinh, 2011). Theo báo cáo của Bộ Y tế, gần 70% người trực tiếp phun xịt thuốc trừ sâu xuất hiện các triệu chứng ngộ độc (Nguyễn Ngọc Duy, 2011). Đánh giá từ các chuyên gia quốc tế chỉ ra rằng có tới 80% lượng thuốc BVTV tại Việt Nam bị sử dụng lãng phí và sai quy trình kỹ thuật, trong khi 30% người dân không tuân thủ các quy định an toàn về liều lượng, nồng độ và bảo hộ lao động.

Trước thực trạng thuốc BVTV sinh học chỉ chiếm khoảng 5% tổng lượng thuốc BVTV sử dụng hàng năm và doanh số dưới 10% (dù danh mục theo Thông tư số 10/2019/TT-BNNPTNT đã có 231 hoạt chất sinh học với 721 tên thương phẩm), nhu cầu nghiên cứu, tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng diệt sâu hại là nhiệm vụ cấp thiết nhằm phục vụ nông nghiệp an toàn.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Tuyển chọn được từ 1 đến 2 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) cao, sinh trưởng tốt và đảm bảo an toàn sinh học.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn từ các mẫu đất trồng rau màu hữu cơ và mẫu rau tươi.
2. Đánh giá sàng lọc và xác định hoạt lực diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng vi khuẩn phân lập được.
3. Khảo sát các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn triển vọng: khả năng sinh enzyme ngoại bào (Amylase, Cellulase, Protease), động học sinh trưởng theo thời gian, khoảng nhiệt độ và pH thích hợp, khả năng kháng kháng sinh Streptomycin và đánh giá mức độ an toàn sinh học trên mô thực vật.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ đất, rau và sâu tơ hại rau (Plutella xylostella).
• Phạm vi không gian: Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Tài nguyên và Môi trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (mẫu được thu thập tại khu thí nghiệm canh tác hữu cơ của Khoa).
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 01/2022 đến tháng 06/2022.
• Giới hạn nội dung: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính diệt sâu tơ và đánh giá các đặc tính sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và cơ sở khoa học

Nghiên cứu dựa trên cơ sở vi sinh vật học và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt). Bt là loài vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử và tổng hợp tinh thể protein độc (chủ yếu là protein Cry và Cyt) ở giai đoạn sinh bào tử.

Cơ chế tác động gây độc của Bt lên ấu trùng côn trùng: Khi sâu ăn phải bào tử và tinh thể độc, trong môi trường kiềm của ruột giữa sâu (pH > 8,9), tinh thể protein hòa tan và được các enzyme protease trong đường ruột cắt tỉa thành dạng độc tố hoạt tính. Độc tố gắn đặc hiệu vào các thụ thể trên màng tế bào biểu mô ruột, đâm thủng màng và tạo các lỗ xuyên màng. Sự hình thành các lỗ thủng làm mất cân bằng áp suất thẩm thấu và dòng ion nội bào, dẫn đến tế bào biểu mô bị phân giải, thành ruột bị phá hủy, sâu ngừng ăn và chết vì đói hoặc nhiễm trùng máu sau 24 đến 72 giờ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp thu thập mẫu: Thực hiện theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7538-06:2010 (ISO 10381-6:2009) về chất lượng đất và hướng dẫn thu thập, bảo quản mẫu đất hiếu khí. Mẫu đất được lấy ở tầng mặt cách bề mặt 5 cm tại khu đất thịt pha cát canh tác hữu cơ; mẫu rau được lấy từ các bộ phận rễ, thân, lá tươi khỏe mạnh.
• Phương pháp phân lập và làm thuần: Sử dụng phương pháp pha loãng liên tiếp bậc 10 (phương pháp Koch) từ nồng độ $10^{-2}$ đến $10^{-6}$ và cấy ria 3 pha trên môi trường thạch Bacillus chuyên tính (thành phần gồm: 20g thạch, 10g Peptone, 10g cao nấm men, 1000 ml nước cất), ủ ở 28°C. Nhận diện hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram và soi kính hiển vi để xác định đặc điểm hình thái tế bào và bào tử.
• Phương pháp xác định hoạt tính diệt sâu: Thực hiện theo quy chuẩn TCCS-09:2010/BVTV về thuốc BVTV chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Vi khuẩn được nhân sinh khối trong môi trường lỏng ở 30°C, lắc 150 vòng/phút trong 40 giờ, sau đó xử lý sốc nhiệt ở 70°C trong 10 phút và chuẩn hóa mật độ đạt $10^9$ bào tử/ml. Thí nghiệm bố trí trên đĩa Petri với 10 con sâu tơ đồng đều về kích thước/tuổi, lặp lại 3 lần. Hiệu lực diệt sâu ($E%$) được tính theo công thức Abbott: $$E (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$ (Trong đó $C$ là số sâu sống ở lô đối chứng, $T$ là số sâu sống ở lô thí nghiệm; tiêu chuẩn đạt yêu cầu khi tỷ lệ chết sau 7 ngày đạt $\ge 80%$).
• Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học:
  • Hoạt tính enzyme ngoại bào: Phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên môi trường chuyên tính chứa tinh bột 0,2% (Amylase), CMC 0,3% (Cellulase), Gelatin 0,2% (Protease); đo hiệu số đường kính vòng phân giải $D - d$ ($d = 0,6\text{ cm}$).
  • Thời gian sinh trưởng và mật độ tế bào: Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 30°C, xác định mật độ vi khuẩn tại các mốc 24h, 48h, 72h bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU/ml).
  • Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH: Nuôi cấy khảo sát tại các mức nhiệt độ 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C và các dải pH từ 4,0 đến 8,0.
  • Khả năng kháng kháng sinh: Thử nghiệm trên môi trường thạch chứa kháng sinh Streptomycin ở các nồng độ 0, 300, 500, 600, 800, 1000 mg/L.
  • Đánh giá an toàn sinh học (ATSH): Khử trùng bề mặt các loại rau củ (bắp cải, cải thìa, cà rốt, khoai tây, hành tây) bằng dung dịch NaClO 1%, cấy trích dịch vi khuẩn vào mô thực vật và theo dõi triệu chứng gây thối hỏng/vết bệnh sau 24h, 48h và 72h.
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được tổng hợp và phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về thuốc BVTV sinh học và vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Tác giả phân tích lịch sử sử dụng hóa chất BVTV tại Việt Nam từ năm 1991 (khi chỉ có 77 hoạt chất được phép sử dụng) đến năm 2010 (tăng lên 437 hoạt chất trừ sâu, 304 thuốc diệt nấm, 160 thuốc trừ cỏ).

Phần tổng quan tài liệu phân loại chi tiết các độc tố Bt gồm 4 nhóm: alpha-exotoxin (phospholipase C), beta-exotoxin bền nhiệt, gamma-endotoxin (tinh thể độc Cry/Cyt) và độc tố tan trong nước. Tinh thể độc Cry được chia thành các nhóm chính dựa trên phổ tác động: CryI (độc với côn trùng cánh vảy Lepidoptera), CryII (cánh vảy và hai cánh), CryIII (cánh cứng Coleoptera), và CryIV (hai cánh Diptera).

Chương này cũng tổng kết lịch sử nghiên cứu Bt trên thế giới từ phát hiện đầu tiên của Louis Pasteur (1870), Ishiwatari Shigetane (1901), Ernst Berliner (1911) cho đến chế phẩm thương phẩm Sporine tại Pháp (1938). Tại Việt Nam, nghiên cứu Bt bắt đầu từ năm 1971 tại Viện Bảo vệ thực vật và các công trình năm 1973 của Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính. Bộ sưu tập Bt Việt Nam (VBtC) hiện lưu giữ hơn 3.500 chủng phân lập nội địa, trong đó tỷ lệ tinh thể hình tháp chiếm 63,1%, hình cầu chiếm 11,2%, hình lập phương chiếm 4,8%; tỷ lệ phân bố gen cry1 chiếm 57% và cry4 chiếm 43%.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, địa điểm lấy mẫu và tiêu chuẩn hóa các bài thử nghiệm. Mẫu đất thịt pha cát và mẫu rau được thu thập tại khu thực nghiệm thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Toàn bộ các bước phân lập, làm thuần trên môi trường thạch bán rắn chuyên tính, công thức thành phần môi trường nuôi cấy và quy trình thử hoạt lực diệt sâu theo tiêu chuẩn ngành TCCS-09:2010/BVTV được cụ thể hóa bằng các thông số định lượng rõ ràng. Chương này cũng thiết lập phương pháp kiểm tra enzyme khuếch tán thạch, dải khảo sát môi trường (nhiệt độ 20–40°C, pH 4–8, nồng độ Streptomycin 0–1000 mg/L) và quy trình cấy trích đánh giá an toàn sinh học trên 5 loại mô thực vật tươi.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả phân lập, sàng lọc và đánh giá sinh học của các chủng vi khuẩn:

1. Kết quả phân lập vi khuẩn: Từ 9 mẫu đất và 3 mẫu rau, phân lập được 18 chủng vi khuẩn (ký hiệu từ B1A đến B7C). Dựa trên đặc điểm hình thái, xác định được 6/18 chủng có tế bào hình que, bắt màu Gram dương và có khả năng tạo nội bào tử (đặc trưng của chi Bacillus), bao gồm: B1A, B4B, B3C, B4C, B5C, B6C. Hầu hết các chủng này đều thuộc nhóm mọc nhanh, xuất hiện khuẩn lạc rõ sau 20–24 giờ.

2. Đánh giá hoạt lực diệt sâu tơ: Thử nghiệm dịch lên men nồng độ $10^9$ bào tử/ml của 6 chủng trên sâu tơ thu được kết quả:

• Chủng B1A có hoạt lực diệt sâu mạnh nhất: sau 24h đạt tỷ lệ chết 40%, sau 48h đạt 80% và sau 72h đạt 100%.
• Chủng B5C: đạt tỷ lệ chết 20% (24h), 50% (48h) và 80% (72h).
• Chủng B6C: đạt tỷ lệ chết 30% (24h), 70% (48h) và 90% (72h).
• Các chủng B4B (30% sau 72h), B3C (30% sau 72h), B4C (20% sau 72h) có hiệu lực thấp nên bị loại bỏ.
• Biểu hiện triệu chứng của sâu bị nhiễm độc: Sau 24h xuất hiện đốm nâu vàng trên thân; sau 48h toàn thân chuyển màu nâu đen và bắt đầu phân hủy; sau 72h thân sâu đen sẫm, khô teo tóp và kích thước giảm xuống còn một nửa.

3. Khảo sát đặc tính sinh học của 3 chủng ưu tú (B1A, B5C, B6C):

• Khả năng sinh enzyme ngoại bào ($D - d$): Chủng B1A sinh enzyme mạnh nhất với đường kính vòng phân giải Cellulase đạt 2,6 cm, Protease đạt 2,5 cm và Amylase đạt 2,1 cm. Chủng B5C có kích thước vòng lần lượt là 2,3 cm (Cellulase), 2,4 cm (Protease), 1,9 cm (Amylase). Chủng B6C đạt 2,0 cm (Cellulase), 2,1 cm (Protease), 1,6 cm (Amylase).
• Động học phát triển theo thời gian: Mật độ tế bào của cả 3 chủng tăng vọt sau 48h. Chủng B1A tăng từ $1,45 \times 10^8\text{ CFU/ml}$ (24h) lên $15,04 \times 10^8\text{ CFU/ml}$ (48h) và đạt $17,10 \times 10^8\text{ CFU/ml}$ sau 72h.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ: Cả 3 chủng sinh trưởng kém ở 20°C ($0,01 - 0,66 \times 10^8\text{ CFU/ml}$) và phát triển tối ưu trong khoảng 25–40°C. Mật độ khuẩn lạc B1A cao nhất ở 30°C ($5,76 \times 10^8\text{ CFU/ml}$) và vẫn phát triển tốt ở 40°C ($4,29 \times 10^8\text{ CFU/ml}$). B5C đạt cực đại ở 35°C ($2,79 \times 10^8\text{ CFU/ml}$), còn B6C phát triển tối ưu ở 40°C ($4,22 \times 10^8\text{ CFU/ml}$).
• Ảnh hưởng của pH: Chủng B1A thích ứng tốt từ pH 4 đến pH 8 (mật độ cao nhất ở pH 6 đạt $3,837 \times 10^8\text{ CFU/ml}$). Chủng B5C phát triển mạnh nhất ở dải pH 5–8 (đạt cực đại ở pH 7 với $8,81 \times 10^8\text{ CFU/ml}$). Chủng B6C sinh trưởng tốt nhất trong môi trường axit ở pH 4 ($1,43 \times 10^8\text{ CFU/ml}$).
• Khả năng kháng kháng sinh Streptomycin: Cả 3 chủng phát triển được ở nồng độ kháng sinh 300–500 mg/L. Ở nồng độ 800 mg/L, chủng B1A và B6C bị ức chế hoàn toàn ($0\text{ CFU/ml}$), chỉ còn B5C sinh trưởng yếu ($0,18 \times 10^8\text{ CFU/ml}$). Ở nồng độ 1000 mg/L, toàn bộ các chủng bị ức chế sinh trưởng.
• Đánh giá an toàn sinh học: Chủng B6C gây thối nhũn và hoại tử nặng trên mô khoai tây và bắp cải sau 72h (gây mùi thối và thu hút côn trùng). Chủng B5C gây thâm đen mô khoai tây. Duy nhất chủng B1A không gây bất kỳ vết bệnh hay tổn thương nào trên toàn bộ 5 mẫu nông sản thử nghiệm.

Kết luận chương 3 xác định B1A là chủng vi khuẩn duy nhất đạt đầy đủ các tiêu chuẩn tuyển chọn.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các chỉ tiêu của các chủng vi khuẩn khảo sát chuyên sâu

Ký hiệu chủng	Nguồn phân lập	Hiệu lực diệt sâu (72h)	Vòng phân giải Cellulase / Amylase / Protease ($D - d$, cm)	Khoảng nhiệt độ thích hợp (°C)	Dải pH thích hợp	Kháng Streptomycin (mg/L)	Mức độ an toàn sinh học (trên mô thực vật)	Kết luận tuyển chọn
B1A	Rau bắp cải	100%	2,6 / 2,1 / 2,5	25 – 40 (tối ưu 30°C)	4,0 – 8,0	300 – 500	Đảm bảo an toàn (không gây bệnh)	ĐƯỢC TUYỂN CHỌN
B5C	Đất trồng cải canh	80%	2,3 / 1,9 / 2,4	25 – 35 (tối ưu 35°C)	5,0 – 8,0	300 – 800	Gây hại nhẹ (thâm mô củ khoai tây)	Loại bỏ
B6C	Đất trồng cải canh	90%	2,0 / 1,6 / 2,1	30 – 40 (tối ưu 40°C)	4,0 – 5,0	300 – 500	Gây hại nặng (thối nhũn mô khoai tây, bắp cải)	Loại bỏ

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài

1. Phân lập và lưu trữ nguồn giống bản địa: Tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn Bacillus sp. B1A có hoạt lực diệt sâu tơ đạt 100% sau 72 giờ từ nguồn mẫu canh tác hữu cơ tại Hà Nội.
2. Xác định đặc tính sinh học đa chức năng: Chủng B1A thể hiện khả năng sinh đồng thời 3 loại enzyme ngoại bào (Cellulase, Amylase, Protease), có khả năng thích ứng nhiệt độ rộng (25–40°C) và dải pH rộng (4–8), tạo điều kiện thuận lợi cho việc nuôi cấy nhân sinh khối quy mô lớn.
3. Chứng minh an toàn sinh học: Khẳng định chủng B1A không mang độc tính gây hại cho mô thực vật cây trồng, đủ điều kiện làm nguồn giống vi sinh để sản xuất chế phẩm sinh học thay thế thuốc trừ sâu hóa học.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Chưa thực hiện định danh chủng vi khuẩn B1A đến cấp độ loài do hạn chế về kinh phí, trang thiết bị và thời gian nghiên cứu.
• Chưa khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme Chitinase – chỉ tiêu sinh hóa quan trọng giúp phân biệt rõ Bacillus thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus.
• Các thử nghiệm diệt sâu và an toàn sinh học mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa được đánh giá hiệu lực thực tế ngoài đồng ruộng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA và khuếch đại các gen mã hóa độc tố cry) để định danh chính xác loài và phân loại nhóm độc tố của chủng B1A.
2. Đánh giá bổ sung hoạt tính enzyme Chitinase nhằm làm rõ khả năng phá vỡ lớp biểu bì cutin/chitin của sâu hại.
3. Khảo sát công nghệ lên men tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và thử nghiệm hiệu lực sinh học của chế phẩm B1A trên diện tích canh tác rau màu thực tế.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Khoa học Môi trường, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật và Vi sinh vật học ứng dụng.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình phân lập và sàng lọc vi khuẩn sinh nội bào tử từ đất và mẫu thực vật canh tác hữu cơ.
  • Quy trình kỹ thuật đánh giá hoạt tính diệt sâu tơ in vitro theo tiêu chuẩn ngành TCCS-09:2010/BVTV kết hợp công thức hiệu chỉnh Abbott.
  • Bộ phương pháp đánh giá an toàn sinh học của chủng vi sinh vật trên các loại mô thực vật tươi phục vụ phát triển chế phẩm sinh học.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nào được tuyển chọn cuối cùng trong khóa luận và hiệu lực diệt sâu đạt bao nhiêu %?
Chủng vi khuẩn duy nhất được tuyển chọn là B1A (phân lập từ mẫu rau bắp cải). Chủng này đạt hiệu lực diệt sâu tơ 40% sau 24h, 80% sau 48h và đạt 100% sau 72h nuôi cấy ở nồng độ $10^9$ bào tử/ml.

2. Quy trình thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ được thực hiện dựa trên tiêu chuẩn nào?
Quy trình thử hoạt tính dựa theo quy chuẩn TCCS-09:2010/BVTV về thuốc BVTV chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Dịch lên men đạt $10^9$ bào tử/ml được thử nghiệm trên 10 con sâu tơ/đĩa Petri, lặp lại 3 lần và tính tỷ lệ chết theo công thức Abbott.

3. Vì sao hai chủng B5C và B6C có hoạt lực diệt sâu cao (80% và 90%) nhưng vẫn bị loại?
Hai chủng B5C và B6C bị loại do không đạt tiêu chuẩn về an toàn sinh học: chủng B5C gây thâm đen mô củ khoai tây, trong khi chủng B6C gây bệnh thối nhũn hoại tử nặng trên mô khoai tây và bắp cải sau 72 giờ.

4. Khả năng sinh trưởng của chủng B1A đối với nhiệt độ, pH và kháng sinh Streptomycin như thế nào?
Chủng B1A sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ từ 25°C đến 40°C (mật độ cao nhất tại 30°C đạt $5,76 \times 10^8\text{ CFU/ml}$), thích ứng trên dải pH rộng từ 4,0 đến 8,0 (tối ưu ở pH 6,0 đạt $3,837 \times 10^8\text{ CFU/ml}$) và có khả năng chịu được kháng sinh Streptomycin ở nồng độ 300–500 mg/L.

5. Tác giả đề xuất những giải pháp kỹ thuật nào để hoàn thiện việc nghiên cứu chủng B1A?
Tác giả đề xuất hai nội dung trọng tâm: (1) Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh chính xác loài và giải mã gen độc tố; (2) Đánh giá khả năng sinh enzyme Chitinase để phân loại chuyên sâu trong chi Bacillus.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã phân lập thành công 18 chủng vi khuẩn từ 9 mẫu đất và 3 mẫu rau canh tác hữu cơ, qua đó sàng lọc được 6 chủng mang đặc điểm hình thái của chi Bacillus. Thông qua hệ thống đánh giá thực nghiệm toàn diện về hoạt lực diệt sâu tơ, khả năng sinh enzyme ngoại bào, tính thích ứng môi trường và độ an toàn sinh học, đề tài đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn ưu tú B1A đạt tỷ lệ diệt sâu 100% sau 72 giờ và tuyệt đối an toàn trên mô thực vật. Kết quả nghiên cứu cung cấp nguồn giống vi sinh vật bản địa có giá trị khoa học và tiềm năng ứng dụng thực tiễn cao trong sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng, hướng tới nền nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Thực trạng sử dụng thuốc BVTV tại Việt Nam Cùng với sự phát triển trong sản xuất nông nghiệp nói chung và ngành trổng trọt nói riêng, việc sử dụng hóa chất BVTV đã gia tăng nhanh chóng. Ở Việt Nam, lượng và loại thuốc BVTV bắt đầu tăng từ những năm 1970, đặc biệt tăng nhanh từ cuối những năm 1980 đến 2010 (Phạm Văn Toàn, 2013). Theo thông tin của Bộ Nông nghiệp & PTNT(2010), từ chỗ chỉ có 77 loại hoạt chất được cho phép sử dụng năm 1991 đến năm 2010 có 437 thuốc trừ sâu, 304 thuốc diệt nấm và 160 thuốt diệt cỏ được cho phép sử dụng.

Trong hai thập niên này số lượng thuốc BVTV nhập khẩu tăng từ 20. Kết quả kiểm tra 25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau và tới 54% mẫu rau tại các tỉnh phía phát hiện có dư lượng thuốc BVTV ( Công bố của Cục Trồng trọt tại hội nghị ngày 25/8/2009). Trong đó có 8,6% mẫu được phát hiện có hàm lượng thuốc BVTV đủ khả năng gây ngộ độc cho người sử dụng (Võ Nhất Sinh, 2011). Theo số liệu của Bộ Y tế cho thấy gần 70% người sử dụng thuốc trừ sâu có triệu chứng ngộ độc (Nguyễn Ngọc Duy, 2011).

Tình trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật không có xu hướng giảm kèm theo đó là những hậu quả nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và môi trường, ảnh hưởng đến sự phát triển của một nền nông nghiệp bền vững. Tuy vậy vai trò của hóa chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp vẫn được thừa nhận. Theo số liêụ của Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) thì năm 2015, lượng thuốc BVTV đã sử dụng tri g̣ iá trên 35 tỷ đô la Mỹ, nhưng đã thu về trên 350 tỷ đô la Mỹ do số lượng và chất lượng nông sản không bi ̣mất đi vì dịch hại. Để phát huy tối đa hiệu quả của thuốc BVTV và sử sụng một cách hoàn toàn thì giải pháp tối ưu là phòng trừ sâu bệnh tổng hợp.

Trong đó, giải pháp đã và đang được chọn để hướng tới là sử dụng thuốc BVTV sinh học để thay thế. Theo báo cáo tổng kết của 10 nước ASEAN vào năm 2016 thì Việt Nam là nước đứng đầu ASEAN về số lượng cũng như chủng loại thuốc BVTV sinh học đã 3 đăng ký và sử dụng. Theo số liệu của Cục BVTV, thị trường thuốc BVTV sinh học vào năm 2019 của Việt Nam ước tính đạt giá trị 30,7 triệu USD và đến năm 2024 dự tính sẽ đạt 65,7 triệu USD, với mức tăng trưởng trên 16,4%/năm. Hiện nay, một số công nghệ sản xuất thuốc BVTV sinh học phổ biến trên thế giới cũng đã được đăng ký và ứng dụng tại Việt Nam như: Thuốc BVTV sinh học nano, Chitosan, chế phẩm virus nhân đa diện NPV, chế phẩm vi sinh, chế phẩm nấm đối kháng, thuốc BVTV chiết xuất từ thảo mộc.

Một số các hoạt chất thuốc BVTV sinh học có khả năng phòng ngừa sinh vật gây hại cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng sản xuất và đăng ký được phép sử dụng tại Việt Nam như : Saponin (từ khô dầu sở), Matrine (cây khổ sâm), Eugenol (Hương nhu), Carvacrol (Cỏ xạ hương), Artemisinin (từ cây Thanh hoa hoa vàng), Cucuminoid ( từ củ nghệ vàng), các tinh dầu như dầu chanh, cam, dầu hạt bông, dầu đinh hường, …Bên cạnh đó không thể không nhắc đến thuốc trừ sâu được sinh học Bt được nghiên cứu rộng rãi ở trong và ngoài nước với những ứng dụng hiệu quả bảo vệ cây trồng, an toàn với môi trường. Tính đến tháng 6/2020, danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam ban hành kèm theo thông tư số 10/2019/TT-BNNPTNT ngày 20/9/2019 của Bộ NN-PTNT đã có hơn 1.000 hoạt chất với hơn 4.000 tên thương phẩm. Trong đó, thuốc BVTV sinh học có 231 hoạt chất với 721 tên thương phẩm, chiếm 18% tổng các thuốc BVTV trong danh mục. Dù số lượng các thuốc BVTV sinh học tăng nhanh nhưng doanh số chỉ đạt dưới 10% tổng doanh số thuốc BVTV.

Thuốc BVTV sinh học cũng còn bộc lộ một số nhược điểm như: Giá thành cao, hiệu lực phòng trừ dịch hại của một số thuốc sinh học thế hê ̣cũ còn hẹp và chậm hơn các thuốc BVTV hóa học. Thời gian bảo quản của nhiều loại thuốc BVTV sinh học thường ngắn hơn thuốc BVTV hóa học. Nông dân có thói quen thích sử dụng thuốc BVTV có hiệu lực nhanh dẫn đến khối lượng và số lượng thuốc BVTV sinh học dùng trong sản xuất cò ̣n hạn chế. Để giảm thiểu tác động tiêu cực của các loại thuốc BVTV hóa học có độc tính 4 cao đến sức khỏe người và môi trường, chúng ta cần phải đẩy nhanh tốc thay thế chúng bằng các loại thuốc BVTV sinh học và thuốc BVTV hóa học thế hệ mới ít độc đối với người, sinh vật có ích và môi trường.Tổng quan về thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Thuốc trừ sâu sinh học hay thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học là các chất trong tự nhiên có khả năng kiểm soát dịch hại bằng các cơ chế không độc.

Thuốc trừ sâu sinh học là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chế phẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tin (semiochemical) được sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật. Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng, mặc dù hầu hết loại thuốc này thường được kết hợp với các công cụ khác (ví dụ thuốc trừ sâu hóa học) như một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằng phương pháp sinh học (Lê Xuân Định, 2015). Bacillus thuringiensis (Bt) là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức. Bt có khả năng tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô Châu á và Châu Âu, chúng đều là sâu hại thực vật phổ biến, có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng.

Bt là một loại vi khuẩn có độc tố giống với một số hợp chất hóa học được sử dụng thương mại để kiểm soát côn trùng trong sản xuất nông nghiệp và sức khỏe cộng đồng. Điều quan trọng là Bt an toàn cho con người và là thuốc trừ sâu sinh học tương thích với môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trên toàn thế giới. Hơn nữa, gen Bt diệt côn trùng đã được tích hợp vào một số loại cây trồng chính, làm cho chúng có khả năng kháng côn trùng và do đó cung cấp một mô hình cho kỹ thuật di truyền trong nông nghiệp (Theo trung tâm kiến thức toàn cầu về cây trồng CNSH cập nhật tháng 3/2006). Đặc điểm và đặc tính về độc tố của Bacillus Thuringiensis Đặc điểm của Bacillus Thuringiensis Bacillus thuringiensis là một loài vi khuẩn Gram dương hiếu khí; Sống trong đất, trong nước, lá cây, côn trùng, tuyến trùng…; Có khả năng tạo ra các tinh thể protein độc trong quá trình sinh bào tử (Leon Rabinovitch et al, 2017).

Dựa theo thông tin cung cấp của trang thông tin - Viện Công nghệ sinh học và ứng dụng vi sinh miền Nam ( 2018), nhận biết đặc điểm của chủng Bt. Tế bào của Bt đứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi, khi trưởng thành tạo một bào tử ở giữa. Bào tử có dạng hình elip, tròn đầu, chứa một tinh thể độc hình quả trám có bản chất protein. Khi ở thể sinh dưỡng tế bào có dạng que, hai đầu tù, kích, bắt màu gram dương.

Chúng thường tồn tại 1 cá thể hoặc 2 cá thể liền nhau, tạo thành chuỗi. Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều và dễ nuôi cấy trên môi trường. Khi vi khuẩn già đi một đầu sẽ hình thành bào tử hình bầu dục, còn đầu kia hình thành tinh thể hình thoi, đây gọi là giai đoạn nang bào tử (hình trứng dài, to hơn thể sinh dưỡng). Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó, chúng sẽ nứt ra, giải phóng bào tử và tinh thể.

Tinh thể là một loại protein, là chất diệt sâu có hiệu quả chủ yếu là diệt sâu. Vi khuẩn Bt có nhu cầu dinh dưỡng không cao. Chất dinh dưỡng chủ yếu là protein động thực vật, có thể phát triển bình thường trong nhiều nguồn nitơ, nguồn cacbon và muối vô cơ. Đặc tính của chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis có khả năng tạo ra 4 loại độc tố trong quá trình phát triển của chúng: Ngoại độc tố (alpha - exotoxin) hay còn gọi là photpholipase – C; Ngoại độc tố (beta - exotoxin) hay còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt; Nội độc tố (gama - endotoxin) hay còn gọi là tinh thể độc; Độc tố tan trong nước.

6 Trong bốn loại độc tố trên, đối tượng thường được quan tâm và nghiên cứu là độc tố tan trong nước và tinh thể độc. Và trong nghiên cứu này tìm hiểu về tinh thể độc để ứng dụng diệt sâu. Vi khuẩn Bt gây bệnh cho côn trùng qua con đường tiêu hóa nên khi các tinh thể độc từ bào tử tiết ra trong cơ thể vật chủ làm chúng ngừng ăn và chết. Các chủng khác nhau thuộc loài Bt sinh ra hai loại chất độc chính, là các chất độc tinh thể (Cry - Crustal) được mã hóa bởi các gen Cry khác nhau, đây cũng là một trong các dấu hiệu dùng để phân loại các nhóm Bt và các chất độc phân giải tế bào (Cyt - Cytolytic) có tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng Cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc.

Nhóm tinh thể độc (hay tinh thể độc Cry) do nhà khoa học E. Berliner tìm ra lần đầu tiên vào năm 1915, sau đó năm 1927, nhà khoa học O. Mattes đã tìm ra một loại tinh thể được tạo ra trong cơ thể Bt khi chúng bắt đầu tạo bào tử. Tinh thể độc được tạo ra với lượng lớn hơn nhiều và có hiệu quả chính gây độc cho côn trùng.

Mãi đến năm 1955, người ta mới biết được tinh thể này có bản chất là protein và có liên quan đến độc tính của Bt. Tinh thể độc được bắt đầu tạo ra khi khởi đầu quá trình hình thành màng bào tử. Khi được kết tinh thành tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau, chủ yếu là hình thoi. Tinh thể không hòa tan trong nước, hoặc các chất hữu cơ Chloroform, Acetol, ether, nhưng có thể hòa tan trong dung dịch kiềm.

Tinh thể có thể ổn định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 – 12), có thể bị biến tính trong acid trichloaxetic, clorua thủy ngân. Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhất định (ở 65oC có thể giữ được 1 giờ, 80oC có thể giữ được 20 phút).