CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở THỰC VẬT 1. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro ở thực vật Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy khử trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật.
Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học [7]. Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện khử trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác [7]. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện khử trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture) [19].
Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy khử trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt) [19]. Cơ sở khoa học 1. Tính toàn năng của tế bào Haberlant (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào.
Theo ông mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tang để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [11]. Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh [11]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) được thực hiện dựa trên tính toàn năng của tế Luan van 4 bào, được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào riêng biệt, trong môi trường thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh, đặc trưng cho loài và có thể phát triển bình thường. Do trong nhân tế bào có chứa bộ DNA hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống hoàn chỉnh.
Tính phân hóa và phân phân hóa của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào [11]. Trong đó: Tính phân hóa của tế bào là sự biển đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành các mô riêng biệt [11]. Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các mô có chức năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ [11].
Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây [11]. Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân, rễ, lá… thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của cơ quan sinh dưỡng [53]. Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (cơ chế điều hòa hoạt động của gen) [53].
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Do thông tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan hormone quy định. Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời và trong điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào [11].
Các bước nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Luan van 5 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro [19]. Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy.
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5- 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962); Chất hữu cơ: đường sarcaroza; Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit; Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) [19]. Bước 3: nhân nhanh Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ Luan van 6 ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… [19].
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh.
Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh [19]. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi… - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp [19].
Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 1. - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 -10 mm. Luan van 7 - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sạch bệnh - Sử dụng vật liệu sạch virus có khả năng nhân được các giống sạch bệnh - Có khả năng điều chỉnh các tác nhân ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều hòa sinh trưởng … theo ý muốn. - Hệ số nhân giống khá cao, có khả năng sản xuất lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn.
- Có thể tiến hành quanh năm, không chịu sự chi phối của các nhân tố môi trường. - Có thể bảo quản cây giống in vitro trong thời gian dài nếu chưa sử dụng [7]. Nhược điểm Vì cây giống được cung cấp nguồn dinh dưỡng nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các chất hữu cơ kém.