Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lan Hài (Paphiopedilum) thuộc họ Orchidaceae là một trong những họ thực vật hạt kín lớn nhất, mang lại nhiều giá trị kinh tế cũng như giá trị nghiên cứu khoa học. Trong đó, lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) là loài lan bản địa đặc hữu và quý hiếm của Việt Nam. Về mặt hình thái học, loài này sở hữu cánh hoa hình trứng hơi nhọn, gốc có lông tơ trắng, mặt trong phủ lông nhung mịn, hoa mang mùi thơm ngọt dịu đặc trưng; lá đài và cánh hoa mang sắc xanh táo xen kẽ các đốm và sọc tím hồng; cánh môi phát triển thành dạng túi sâu nằm ngang như một chiếc hài.

Trong tự nhiên, các quần thể lan hài nói chung và lan hài Vân Nam nói riêng phân bố tương đối hẹp tại các vùng rừng núi đá vôi phía Bắc và một số vùng đá mẹ silicat. Tuy nhiên, trước áp lực khai thác thương mại ồ ạt, môi trường sống bị chia cắt và tốc độ sinh sản tự nhiên chậm, nguồn gen lan hài ngoài tự nhiên đang đứng trước nguy cơ suy thoái và tuyệt chủng nghiêm trọng. Các phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống như tách chiết chồi non chỉ đạt hệ số sinh sản thấp (khoảng 1 cây mới/năm), không đáp ứng được nhu cầu bảo tồn và cung cấp thương mại. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) để tái sinh và nhân giống từ phôi hạt là giải pháp kỹ thuật cần thiết, tạo ra số lượng lớn cây giống sạch bệnh, có độ đồng đều cao trong thời gian ngắn.

Từ thực tiễn trên, tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng đã thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  • Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng nhân giống và ra rễ của loài lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) có giá trị từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro.
  • Yêu cầu và nhiệm vụ nghiên cứu:
    1. Xác định được môi trường nhân nhanh lan hài Vân Nam tái sinh chồi từ quả (phôi).
    2. Xác định được môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Vân Nam.
  • Đối tượng và vật liệu nghiên cứu: Giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) được trồng tại vườn cây của Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; vật liệu khởi đầu là nguồn chồi tái sinh từ phôi trong quả lan.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng nhóm cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) đến hệ số nhân chồi và nhóm auxin (NAA) kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro.
  • Thời gian và địa điểm: Đề tài được thực hiện từ ngày 03/01/2020 đến ngày 10/07/2020 tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, khởi nguồn từ học thuyết về tính toàn năng của tế bào do Gottlieb Haberlandt khởi xướng (1902). Theo quan điểm sinh học hiện đại, mỗi tế bào thực vật biệt hóa đều chứa đầy đủ thông tin di truyền cần thiết để tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện dinh dưỡng và ngoại cảnh thích hợp, thông qua hai cơ chế then chốt là sự phân hóa và phản phân hóa tế bào.

Trong phát sinh hình thái thực vật in vitro, tỷ lệ phối hợp giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin đóng vai trò quyết định:

  • Nhóm Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ): Có hoạt tính kích thích quá trình phân chia tế bào, cảm ứng hình thành chồi bên, phá vỡ ưu thế đỉnh và làm chậm quá trình già hóa mô. Trong đó, BA (6-Benzylaminopurine) có hoạt tính mạnh và bền nhiệt; Kinetin (6-Furfurylaminopurine) kích thích phân chia và tăng cường tổng hợp diệp lục; TDZ (Thidiazuron) là cytokinin nhóm phenylurea có hoạt tính sinh học rất cao do ít bị enzyme nội sinh phân hủy.
  • Nhóm Auxin (NAA): Axit α-naphthaleneacetic là auxin tổng hợp bền nhiệt, có vai trò kích thích sự phân bào của mô trụ bì, thúc đẩy sự khởi sinh và phát triển của rễ phụ.
  • Chất bổ sung: Than hoạt tính (THT) đóng vai trò hấp phụ các hợp chất phenol độc và chất ức chế sinh trưởng thứ cấp do mô tiết ra, đồng thời che tối vùng gốc nuôi cấy để tạo môi trường thuận lợi cho rễ phát sinh và hạn chế hiện tượng thủy tinh thể của mô chồi.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tuần tự theo quy trình chuẩn hóa:

  • Môi trường nuôi cấy nền: Sử dụng môi trường khoáng Murashige & Skoog (MS, 1962), bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường saccharose 30 g/l, Nước dừa 150 ml/l, Inositol 100 mg/l, Than hoạt tính 0,5 g/l (ở giai đoạn nhân chồi), độ pH được cân chỉnh trong khoảng 5,6 – 5,8. Môi trường được khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,0 atm trong 20 phút.
  • Điều kiện phòng nuôi cấy: Nhiệt độ duy trì ổn định ở 25 ± 2°C, độ ẩm không khí 60 – 65%, chế độ chiếu sáng 14 giờ sáng / 10 giờ tối, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux.
  • Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD). Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại thực hiện cấy 10 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu (tương đương 30 bình/mẫu nuôi cấy cho mỗi công thức).
  • Chỉ tiêu theo dõi và thu thập số liệu: Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần = tổng chồi thu được / tổng chồi nuôi cấy ban đầu), tỷ lệ chồi ra rễ (%), số rễ trung bình/chồi, cùng các đặc điểm hình thái định tính của chồi (xanh đậm, mập, gầy, ngắn, nhỏ) và rễ (dài, mập, trắng, ngắn, đen).
  • Xử lý số liệu: Toàn bộ số liệu thực nghiệm được lưu trữ, tổng hợp và xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và IRRISTAT phiên bản 5.0; phân tích phương sai, so sánh các giá trị trung bình qua kiểm định sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức xác suất tin cậy 95% ($LSD_{0.05}$) và tính hệ số biến động ($CV%$).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này trình bày lý do lựa chọn đề tài, tính cấp thiết của việc bảo tồn và nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) tại Việt Nam. Văn bản nhấn mạnh nguy cơ cạn kiệt nguồn gen hoang dã do hoạt động thu hái thương mại không kiểm soát và sự suy thoái môi trường tự nhiên. Tác giả xác định rõ ràng mục tiêu nghiên cứu, yêu cầu nhiệm vụ, phạm vi không gian, thời gian thực hiện, cùng ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn của công trình đối với công tác bảo tồn giống thực vật bản địa.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến chi Paphiopedilum và loài lan hài Vân Nam:

  • Phân loại và nguồn gốc: Chi Paphiopedilum gồm khoảng 75-80 loài thuộc tông Cypripedioideae, phân bố tự nhiên chủ yếu tại vùng Ấn-Mã Lai và Đông Nam Á. Loài Paphiopedilum callosum được mô tả lần đầu năm 1954 bởi các nhà thực vật học Trung Quốc dựa trên mẫu chuẩn thu thập tại Malipo (tỉnh Vân Nam), phân bố tự nhiên ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam như Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa, Quảng Bình ở độ cao từ 450 đến 1450 m.
  • Đặc điểm sinh học và sinh thái: Cây thân thảo mọc trên đất hoặc bám đá, thân rễ ngắn (đường kính 2-3,5 mm); lá hình bầu dục hẹp dài 10-16 cm, rộng 2,5-5 cm, mặt trên có vân khoang lục nhạt - lục thẫm, mặt dưới có đốm nâu tía; cuống hoa mảnh dài 30-50 cm có lông, mang 1 hoa lớn; quả nang dài có 3 gờ, mở bằng 6 rãnh nứt sau 6 đến 10 tháng thụ phấn.
  • Cơ sở khoa học và tổng quan nghiên cứu in vitro: Khái quát tính toàn năng tế bào, vai trò của các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon và chất điều hòa sinh trưởng. Đồng thời, tác giả tổng hợp tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan hài trên thế giới (Bubeck 1973, Stewart 1975, Huang 1988, Lin 2000, Chyuam-Yih Ng và Norihan Mohd 2011) và trong nước (Dương Tấn Nhựt 2005 nhân giống P. delenatii, Hoàng Thị Giang 2010 nhân giống P. hangianum).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn vật liệu nghiên cứu (chồi tái sinh từ phôi quả lan hài Vân Nam), hóa chất, thiết bị thí nghiệm (tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân phân tích, giàn đèn chiếu sáng). Trình bày sơ đồ nghiên cứu và 5 công thức thí nghiệm cụ thể chia làm 2 nội dung:

  • Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đơn lẻ (0 - 2,0 mg/l), BA kết hợp Kinetin (0 - 2,0 mg/l), và BA kết hợp Kinetin cùng TDZ (0 - 2,0 mg/l) đến khả năng nhân nhanh chồi.
  • Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đơn lẻ (0 - 1,5 mg/l) và NAA kết hợp Than hoạt tính (0 - 2,0 g/l) đến khả năng ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh. Quy định công thức tính toán các chỉ tiêu và phần mềm phân tích IRRISTAT 5.0.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 4 trình bày chi tiết kết quả thực nghiệm của 5 thí nghiệm được thực hiện, kèm bảng số liệu và phân tích thống kê:

1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 40 ngày nuôi cấy)

Thí nghiệm khảo sát 5 nồng độ BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) trên môi trường nền MS. Kết quả cho thấy sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các công thức ($LSD_{0.05} = 0,24$; $CV% = 8,5%$):

Công thức Nồng độ BA (mg/l) Số bình mẫu nuôi cấy Số bình tái sinh chồi Hệ số nhân chồi (lần) Đặc điểm chất lượng chồi
CT1 (Đ/c) 0,0 30 6 0,20 Mới nhú, chiều cao chồi thấp
CT2 0,5 30 56 1,87 Xanh đậm, mập
CT3 1,0 30 20 0,67 Xanh, gầy, dài
CT4 1,5 30 45 1,50 Xanh nhạt, mập
CT5 2,0 30 21 0,70 Xanh, ngắn

Nồng độ BA 0,5 mg/l (CT2) cho hiệu quả cao nhất với hệ số nhân chồi đạt 1,87 lần, chồi xanh đậm, sinh trưởng mập mạp. Nồng độ BA cao hơn (1,0 - 2,0 mg/l) làm giảm tỷ lệ tái sinh và chất lượng chồi. Do đó, nồng độ BA 0,5 mg/l được lựa chọn cho các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo.

2. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi

Giữ cố định nồng độ BA ở mức 0,5 mg/l, bổ sung Kinetin ở các nồng độ từ 0 đến 2,0 mg/l. Kết quả thống kê ($LSD_{0.05} = 0,2$; $CV% = 6,8%$):

Công thức BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Số mẫu cấy Tổng số chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) Chất lượng chồi
CT1 (Đ/c) 0,5 0,0 30 47 1,87 Xanh đậm, mập
CT2 0,5 0,5 30 48 1,90 Xanh đậm, mập
CT3 0,5 1,0 30 57 1,96 Xanh đậm, mập
CT4 0,5 1,5 30 67 2,23 Xanh đậm, mập
CT5 0,5 2,0 30 56 1,93 Xanh nhạt, mập

Việc bổ sung Kinetin làm tăng khả năng nhân chồi. Trong đó, CT4 (0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l Kinetin) đạt hiệu quả cao nhất với tổng số 67 chồi thu được và hệ số nhân đạt 2,23 lần, chồi phát triển xanh đậm và mập. Khi nồng độ Kinetin vượt lên 2,0 mg/l, hệ số nhân chồi bắt đầu suy giảm.

3. Ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày)

Thử nghiệm kết hợp BA (0,5 mg/l), Kinetin (1,5 mg/l) với TDZ ở các dải nồng độ từ 0 đến 2,0 mg/l ($LSD_{0.05} = 0,17$; $CV% = 4,0%$):

Công thức BA (mg/l) Kinetin (mg/l) TDZ (mg/l) Số mẫu cấy Tổng số chồi Hệ số nhân (lần) Chất lượng chồi
CT1 (Đ/c) 0,5 1,5 0,0 30 65 2,17 Xanh đậm, mập
CT2 0,5 1,5 0,5 30 73 2,43 Xanh đậm, mập
CT3 0,5 1,5 1,0 30 85 2,83 Xanh đậm, mập
CT4 0,5 1,5 1,5 30 62 2,07 Xanh, bé
CT5 0,5 1,5 2,0 30 59 1,19 Xanh, bé

Công thức CT3 bổ sung 1,0 mg/l TDZ cho kết quả vượt trội: đạt 85 chồi thu được, hệ số nhân đạt đỉnh 2,83 lần, chồi xanh đậm và mập. Khi nồng độ TDZ tăng lên 1,5 - 2,0 mg/l (CT4, CT5), chồi bị nhỏ, ức chế kéo dài và hệ số nhân giảm sút rõ rệt.

4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ (sau 30 ngày nuôi cấy)

Chồi đạt tiêu chuẩn (sinh trưởng tốt, có 2 - 3 lá) được chuyển sang môi trường kích thích ra rễ bổ sung NAA ở các mức 0; 0,3; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l ($LSD_{0.05} = 2,92$; $CV% = 8,2%$):

Công thức NAA (mg/l) Số mẫu nuôi cấy Số mẫu ra rễ Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) Chất lượng rễ
CT1 (Đ/c) 0,0 30 5 16,67 Ngắn, nhỏ, đen
CT2 0,3 30 26 86,67 Dài, mập, trắng
CT3 0,5 30 21 70,00 Ngắn, nhỏ, đen
CT4 1,0 30 18 60,00 Ngắn, nhỏ, đen
CT5 1,5 30 23 76,67 Ngắn, nhỏ, đen

Nồng độ 0,3 mg/l NAA (CT2) là tối ưu nhất với 26/30 mẫu tạo rễ, tỷ lệ ra rễ đạt 86,67%, rễ dài, mập và có màu trắng khỏe mạnh. Nồng độ NAA cao hơn gây ức chế tạo rễ, rễ ngắn, nhỏ và chuyển màu thâm đen.

5. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với Than hoạt tính đến khả năng ra rễ (sau 30 ngày)

Giữ nguyên nồng độ NAA ở mức 0,3 mg/l, phối hợp với Than hoạt tính (THT) ở các hàm lượng 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 g/l ($LSD_{0.05} = 0,78$; $CV% = 5,8%$):

Công thức NAA (mg/l) THT (g/l) Số mẫu cấy Tỷ lệ chồi ra rễ (chồi) Số rễ trung bình/chồi (rễ) Chất lượng rễ
CT1 (Đ/c) 0,3 0,0 30 48 1,60 Ngắn, nhỏ
CT2 0,3 0,5 30 90 3,00 Dài, mập
CT3 0,3 1,0 30 79 2,63 Dài, mập
CT4 0,3 1,5 30 75 2,50 Ngắn, nhỏ
CT5 0,3 2,0 30 58 1,93 Ngắn, nhỏ

CT2 (0,3 mg/l NAA kết hợp 0,5 g/l THT) đạt kết quả tối ưu nhất với 90 rễ hình thành trên 30 mẫu cấy, số rễ trung bình đạt 3,00 rễ/chồi, rễ phát triển dài, mập và trắng khỏe. Khi tăng hàm lượng THT lên quá cao (1,5 - 2,0 g/l), khả năng trao đổi chất của mô bị cản trở dẫn đến số lượng rễ giảm sút.

Kết quả và đóng góp thực tiễn

Khóa luận đã xác định được các thông số môi trường tối ưu cho hai giai đoạn sinh trưởng quan trọng trong quy trình vi nhân giống loài lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum):

Giai đoạn nuôi cấy Thành phần môi trường tối ưu Kết quả thực nghiệm cụ thể
Nhân nhanh chồi in vitro Môi trường MS nền + 30 g/l Saccharose + 150 ml/l Nước dừa + 5,5 g/l Agar + 100 mg/l Inositol + 0,5 g/l THT + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l Kinetin + 1,0 mg/l TDZ (pH 5,6 - 5,8) Tổng số chồi thu được: 85 chồi/30 mẫu; Hệ số nhân chồi đạt cao nhất: 2,83 lần sau 30 ngày nuôi cấy; Chồi xanh đậm, sinh trưởng mập mạp.
Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Môi trường MS nền + 30 g/l Saccharose + 150 ml/l Nước dừa + 5,5 g/l Agar + 100 mg/l Inositol + 0,3 mg/l NAA + 0,5 g/l Than hoạt tính (pH 5,6 - 5,8) Tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 86,67% (sau 30 ngày bổ sung NAA); Số rễ trung bình đạt 3,00 rễ/chồi (tổng 90 rễ/30 mẫu khi có THT); Rễ dài, mập, màu trắng khỏe mạnh.

Về mặt đóng góp, nghiên cứu đã xây dựng các dữ liệu thực nghiệm mới về kỹ thuật nhân giống in vitro từ phôi hạt đối với loài lan hài Vân Nam bản địa của Việt Nam. Kết quả đề xuất quy trình bổ sung phối hợp 3 chất kích thích sinh trưởng cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) giúp nâng cao hệ số nhân chồi so với chỉ sử dụng BA đơn lẻ, đồng thời xác định được nồng độ phối hợp thích hợp giữa auxin NAA và than hoạt tính nhằm kích thích hệ thống rễ hoàn chỉnh. Đề tài cung cấp cơ sở kỹ thuật hỗ trợ công tác bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm và định hướng tạo nguồn giống phục vụ nghiên cứu, thương mại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Dựa trên phạm vi và nội dung thực tế được trình bày trong văn bản khóa luận:

  • Hạn chế: Nghiên cứu mới hoàn thành ở phạm vi phòng thí nghiệm in vitro (đến giai đoạn kích thích ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh trong bình tam giác). Khóa luận chưa thực hiện các khảo sát thực nghiệm ở giai đoạn tiếp theo là đưa cây con ra vườn ươm, chưa có số liệu về tỷ lệ sống sót, mức độ thích nghi và loại giá thể tối ưu ngoài điều kiện tự nhiên.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện giai đoạn thuần dưỡng cây lan hài Vân Nam in vitro ra môi trường vườn ươm (khảo sát các loại giá thể như dớn, than củi, vỏ thông, đá vôi và chế độ phân bón vi sinh); đồng thời khảo sát mở rộng các chất bổ sung hữu cơ tự nhiên khác nhằm hạ giá thành sản xuất cây giống quy mô lớn.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Sinh học thực vật và các kỹ thuật viên tại các trung tâm, phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng trực tiếp bao gồm:

  • Số liệu thực nghiệm chi tiết về nồng độ và tỷ lệ phối hợp cụ thể của 3 nhóm cytokinin (BA 0,5 mg/l + Kinetin 1,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l) để vượt qua khó khăn về hệ số nhân chồi thấp ở chi lan hài.
  • Công thức ra rễ kết hợp giữa NAA nồng độ thấp (0,3 mg/l) và than hoạt tính (0,5 g/l) giúp khắc phục hiện tượng rễ ngắn, đen hoặc ức chế rễ do quá liều auxin.
  • Phương pháp thu thập số liệu và quy trình xử lý thống kê sinh học trên phần mềm IRRISTAT 5.0 đối với các chỉ tiêu nuôi cấy mô.

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA nào cho hiệu quả nhân chồi đơn lẻ tốt nhất trong thí nghiệm?
Nồng độ BA tối ưu là 0,5 mg/l (CT2), đạt hệ số nhân chồi 1,87 lần sau 40 ngày nuôi cấy với 56 bình mẫu tái sinh chồi, chồi có chất lượng xanh đậm và mập mạp ($LSD_{0.05} = 0,24$; $CV% = 8,5%$).

2. Khi phối hợp thêm Kinetin và TDZ vào môi trường nhân chồi thì kết quả đạt được như thế nào?
Việc bổ sung phối hợp giúp tăng rõ rệt hệ số nhân chồi. Khi kết hợp 0,5 mg/l BA với 1,5 mg/l Kinetin, hệ số nhân đạt 2,23 lần (67 chồi). Khi tiếp tục bổ sung thêm 1,0 mg/l TDZ (CT3: 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l Kinetin + 1,0 mg/l TDZ), hệ số nhân chồi đạt mức cao nhất là 2,83 lần sau 30 ngày với tổng số 85 chồi thu được.

3. Vì sao nồng độ TDZ cao (1,5 - 2,0 mg/l) lại làm giảm hệ số nhân chồi?
TDZ là cytokinin có hoạt tính sinh học cực mạnh. Khi tăng nồng độ lên 1,5 - 2,0 mg/l, chồi sinh ra bị ức chế quá trình giãn dài, mẫu bị biến dạng hoặc chồi nhỏ, dẫn đến hệ số nhân giảm xuống chỉ còn 2,07 lần (ở 1,5 mg/l) và 1,19 lần (ở 2,0 mg/l).

4. Nồng độ NAA và Than hoạt tính tối ưu để tạo cây hoàn chỉnh là bao nhiêu?
Môi trường tạo rễ tối ưu nhất là môi trường nền MS bổ sung 0,3 mg/l NAA kết hợp với 0,5 g/l than hoạt tính. Công thức này cho tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 86,67%, số rễ trung bình đạt 3,00 rễ/chồi (tổng số 90 rễ trên 30 mẫu cấy sau 30 ngày), rễ phát triển dài, mập và có màu trắng.

5. Khóa luận sử dụng các công cụ phần mềm nào để xử lý số liệu thực nghiệm?
Toàn bộ số liệu thực nghiệm được thu thập, phân tích phương sai ($LSD_{0.05}$) và tính toán hệ số biến động ($CV%$) thông qua phần mềm Microsoft Office Excel 2010 và phần mềm thống kê nông nghiệp IRRISTAT phiên bản 5.0.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) in vitro từ nguồn vật liệu phôi. Môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi được xác định là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA, 1,5 mg/l Kinetin và 1,0 mg/l TDZ, đạt hệ số nhân 2,83 lần sau 30 ngày nuôi cấy. Đồng thời, nghiên cứu đã hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l NAA kết hợp 0,5 g/l than hoạt tính, đạt tỷ lệ ra rễ 86,67% với 3,00 rễ/chồi. Các kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác phục vụ việc nhân giống bảo tồn và khai thác nguồn gen loài lan đặc hữu quý hiếm này.