Khóa luận tốt nghiệp ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và điều kiện ánh sáng trong việc tạo callus của lan thạch hộc dendrobium officinale từ thân cây và nhân nhanh giống lan thạch hộc trong điều kiện phòng thí nghiệm

Tổng hợp kiến thức Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng và ánh sáng ..., tiếp cận khoa học, hỗ trợ học tập và nghiên cứu hiệu quả trong hóa học

• Tác giả: Ngô Vân Long
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Phú Long
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Nông học
• Đề tài: Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và điều kiện ánh sáng trong việc tạo callus của Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) từ thân cây và nhân nhanh giống Lan Thạch Hộc trong điều kiện phòng thí nghiệm
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LỜI CẢM ƠN
• 1.2. DANH MỤC BẢNG
• 1.3. DANH MỤC HÌNH
• 1.4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.5. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
• 1.5.1. Mục đích và yêu cầu của đề tài
• 1.5.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.5.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.6.1. Giới thiệu chung về Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale)
• 1.6.2. Phân loại
• 1.6.3. Đặc điểm hình thái
• 1.6.4. Phân bố
• 1.6.5. Giá trị của cây Lan Thạch Hộc
• 1.6.5.1. Làm thuốc
• 1.6.5.2. Làm thực phẩm
• 1.6.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) tại Việt Nam
• 1.6.7. Nhân giống nuôi cấy mô in vitro
• 1.7. PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu
• 1.7.1.1. Địa điểm nghiên cứu
• 1.7.1.2. Thời gian nghiên cứu
• 1.7.1.3. Vật liệu nghiên cứu
• 1.7.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.7.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.7.3.1. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu
• 1.7.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi
• 1.7.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.8. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.8.1. Kết quả thí nghiệm cảm ứng tạo chồi in vitro từ vật liệu khởi đầu (cây bố mẹ) sau 30 ngày
• 1.8.2. Sự phát triển của nốt sần ở giai đoạn nhân nhanh
• 1.8.3. Giai đoạn hình thành và phát triển của chồi mầm từ cụm PLB sau 30 ngày nuôi cấy
• 1.8.4. Giai đoạn sinh trưởng và phát triển chồi Lan Thạch Hộc
• 1.8.5. Phát triển cân bằng rễ thân lá cho cây con
• 1.9. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Chất điều tiết sinh trưởng và ánh sáng trong tạo callus

Nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng và điều kiện ánh sáng trong quá trình tạo callus từ thân cây Dendrobium officinale. Các chất điều tiết sinh trưởng như 6-BA và NAA được sử dụng để kích thích sự hình thành callus. Kết quả cho thấy, nồng độ 6-BA từ 1.0 đến 1.5 ppm kết hợp với NAA 0.5 ppm mang lại hiệu quả cao nhất. Điều kiện ánh sáng cũng đóng vai trò quan trọng, với việc nuôi cấy trong điều kiện tối giúp tăng tỷ lệ tạo callus.

1.1. Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng như 6-BA và NAA được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào và hình thành callus. Nghiên cứu chỉ ra rằng, sự kết hợp giữa 6-BA và NAA ở nồng độ thích hợp giúp tăng hiệu quả tạo callus. Đặc biệt, 6-BA ở nồng độ 1.0-1.5 ppm kết hợp với NAA 0.5 ppm cho kết quả tối ưu.

1.2. Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng

Điều kiện ánh sáng là yếu tố quan trọng trong quá trình tạo callus. Nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy trong điều kiện tối giúp tăng tỷ lệ tạo callus so với điều kiện sáng. Điều này chứng tỏ rằng, ánh sáng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào thực vật trong giai đoạn đầu.

II. Nhân giống lan thạch hộc Dendrobium officinale

Nghiên cứu cũng tập trung vào kỹ thuật nhân giống Dendrobium officinale thông qua phương pháp nuôi cấy mô. Quá trình sinh trưởng của cây được theo dõi qua các giai đoạn từ tạo callus, hình thành chồi, đến phát triển rễ và thân lá. Kết quả cho thấy, môi trường nuôi cấy phù hợp và chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trò quyết định trong việc nhân giống thành công.

2.1. Quá trình sinh trưởng và phát triển

Quá trình sinh trưởng của Dendrobium officinale được chia thành các giai đoạn: tạo callus, hình thành chồi, và phát triển rễ. Nghiên cứu chỉ ra rằng, chất điều tiết sinh trưởng và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cây. Giai đoạn tạo callus cần được thực hiện trong điều kiện tối để đạt hiệu quả cao.

2.2. Kỹ thuật nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng để nhân giống Dendrobium officinale. Phương pháp này giúp tạo ra số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, đồng thời đảm bảo chất lượng và sự đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, cần lưu ý đến hiện tượng biến dị tế bào soma có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học lớn trong việc hiểu rõ ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng và ánh sáng đến quá trình sinh trưởng của Dendrobium officinale. Đồng thời, nghiên cứu cũng mang lại ý nghĩa thực tiễn trong việc bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này, đáp ứng nhu cầu thị trường và góp phần bảo vệ nguồn gen.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu giúp làm rõ ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng và ánh sáng đến quá trình sinh trưởng của Dendrobium officinale. Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống và bảo tồn loài lan quý hiếm này.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu mang lại ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc nhân giống và phát triển Dendrobium officinale. Phương pháp nuôi cấy mô giúp tạo ra số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đáp ứng nhu cầu thị trường và góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo), hay còn gọi là Thạch Hộc tía, Thiết bì, Thạch Hộc rỉ sắt, là loài thực vật phụ sinh thuộc chi Thạch Hộc (Dendrobium), họ Phong Lan (Orchidaceae). Trong tự nhiên, loài cây này thường phân bố ở các vùng rừng núi râm mát có độ cao khoảng 1.400 m so với mực nước biển, bám trên các thân cây gỗ mục hoặc vách đá rêu phong tại Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Myanmar. Về giá trị sử dụng, Lan Thạch Hộc được ghi nhận trong Dược điển Trung Quốc và cuốn Thần Nông bản thảo kinh như một loại dược liệu quý; các hoạt chất sinh học chủ yếu gồm polysaccharide và alkaloid có tác dụng tăng cường tiết insulin, hạ đường huyết, cải thiện tuần hoàn máu, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giải nhiệt, chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư. Bên cạnh đó, thân cây còn được chế biến thành sản phẩm thương phẩm có giá trị cao mang tên "phong đấu" (Tie-pi Feng-dou).

Tại Việt Nam, do khả năng tái sinh tự nhiên chậm, yêu cầu điều kiện sinh thái khắt khe kết hợp với tình trạng khai thác quá mức phục vụ mục đích thương mại và xuất khẩu, số lượng cá thể Lan Thạch Hộc trong tự nhiên đã suy giảm nghiêm trọng. Loài này đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) ở cấp độ Nguy cấp (EN A1 a,c,d) và thuộc Danh mục thực vật rừng nguy cấp, quý, hiếm Nhóm IA theo Nghị định số 32/2006/NĐ-CP (nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại). Việc nhân giống bằng hạt trong tự nhiên gặp nhiều hạn chế do hạt nhỏ như bụi phấn, không có phôi nhũ và cần nấm cộng sinh; phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (tách chồi) cho hệ số nhân thấp và không đáp ứng được nhu cầu bảo tồn cũng như sản xuất quy mô lớn.

Trước thực trạng đó, tác giả Ngô Vân Long đã thực hiện đề tài khóa luận nhằm ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) để nhân giống và bảo tồn nguồn gen loài cây này.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng (điều kiện chiếu sáng và điều kiện tối) đến khả năng cảm ứng tạo thể chồi/nốt sần (Protocorm-like Bodies - PLB/callus) từ mẫu đốt thân của Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale).
2. Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA) và Cytokinin (6-BA) ở các nồng độ và tổ hợp khác nhau đến sự cảm ứng tạo nốt sần và quá trình nhân nhanh cụm PLB.
3. Tìm ra môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp nhằm nâng cao hệ số nhân giống và chất lượng chồi mầm, góp phần xây dựng quy trình nhân giống vô tính phục vụ bảo tồn và cung cấp nguồn dược liệu sạch bệnh.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng bề mặt mẫu đốt thân Lan Thạch Hộc đảm bảo tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp.
2. Thử nghiệm và so sánh tỷ lệ tạo nốt sần (PLB) từ mẫu đốt thân trên môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung 6-BA và NAA dưới hai chế độ ánh sáng (tối hoàn toàn 0 giờ/ngày và chiếu sáng huỳnh quang 9 giờ/ngày).
3. Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ 6-BA kết hợp NAA trên nền môi trường ½ MS đến tốc độ tăng sinh khối, số lượng PLB hình thành và hệ số nhân giống.
4. Đánh giá các giai đoạn phát triển tiếp theo gồm tái sinh chồi mầm, kéo dài chồi và tạo rễ in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu đốt thân cây mẹ Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale).
• Phạm vi không gian: Phòng Ứng dụng Công nghệ sinh học Thực vật, Bộ môn Thực vật, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Từ ngày 01/02/2021 đến ngày 30/08/2021.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (Cellular Totipotency) cùng các hiện tượng phân hóa (Differentiation) và phản phân hóa tế bào (Dedifferentiation). Trong quá trình phát sinh hình thái in vitro ở họ Phong Lan, mô phân sinh hoặc tế bào sinh dưỡng sau khi bị thương tổn dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh sẽ phân chia tạo thành các cấu trúc tương tự phôi soma gọi là thể dạng chồi mầm/nốt sần (Protocorm-like Bodies - PLB).

Hệ thống môi trường nuôi cấy áp dụng môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962) và môi trường giảm nồng độ khoáng (½ MS), kết hợp với các chất bổ sung hữu cơ gồm đường saccharose (30 g/l), myo-inositol (0,1 g/l), nước dừa (30%), chất làm đông agar (7 g/l) và than hoạt tính (0,2 g/l ở giai đoạn ra rễ). Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật được khảo sát gồm:

• Cytokinin: 6-Benzylaminopurine (6-BA) với nồng độ từ 0,5 đến 3,0 ppm/l (hoặc mg/l), có vai trò kích thích phân chia tế bào, cảm ứng hình thành chồi và giải tỏa ưu thế ngọn.
• Auxin: $\alpha$-Naphthaleneacetic acid (NAA) với nồng độ từ 0,5 đến 2,5 ppm/l, có vai trò kích thích sự kéo dài tế bào, thúc đẩy cảm ứng mô sẹo/PLB khi kết hợp với Cytokinin và kích thích phát sinh rễ bất định.

Phương pháp nghiên cứu

• Quy trình khử trùng mẫu: Đoạn thân mang mắt ngủ lấy từ cây mẹ được ngâm trong dung dịch xà phòng 20 phút, rửa sạch dưới vòi nước chảy, nhúng cồn 70° trong 30 giây, sau đó khử trùng bề mặt bằng dung dịch muối thủy ngân HgCl₂ 0,1% trong thời gian 10 phút. Mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3–5 lần trước khi cắt thành các đoạn đốt thân có chiều dài khoảng 0,5 cm để cấy vào bình tam giác.
• Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) 1 nhân tố với các công thức thí nghiệm khác nhau và 1 công thức đối chứng không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Mỗi công thức được lặp lại 5 lần.
• Điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: Nhiệt độ duy trì ở mức 25 ± 2°C; độ ẩm không khí 50–60%; độ pH môi trường điều chỉnh về mức 5,7 trước khi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút. Nguồn sáng sử dụng đèn huỳnh quang với cường độ 3.000–4.000 lux; thời gian chiếu sáng thử nghiệm gồm 0 giờ/ngày (tối hoàn toàn) và 9 giờ/ngày.
• Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: Theo dõi định kỳ sau 10, 14, 20, 21, 30 và 40 ngày nuôi cấy. Các chỉ tiêu đo đếm gồm tỷ lệ mẫu sống (%), tỷ lệ mẫu tạo PLB (%), số lượng PLB/mẫu, khối lượng tươi ban đầu và sau 30 ngày (g), hệ số nhân (lần), chiều cao chồi (cm), số lá, chiều dài và chiều rộng lá (cm), đường kính thân (cm), số rễ và chiều dài rễ (cm). Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Duncan qua phần mềm SPSS phiên bản 22.0.

---

Nội dung chính theo từng chương

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương tổng quan hệ thống hóa các tài liệu khoa học về đặc điểm thực vật học, giá trị sử dụng và thực trạng nghiên cứu nhân giống loài Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale):

• Hình thái học: Cây thân thảo phụ sinh mọc thành khóm cao 30–50 cm; thân hơi dẹt có rãnh dọc, gồm các gióng/đốt dài 2,5–3 cm; lá thuôn dài mọc so le dạng dây, phiến lá có 5 gân dọc, đầu lá cuộn hình móng; hoa màu hồng có chấm tím ở họng, nở vào tháng 2–4; quả nang nảy nở vào tháng 4–6 chứa vô số hạt nhỏ.
• Dược tính và ứng dụng: Nêu chi tiết 13 bài thuốc cổ truyền sử dụng Thạch Hộc để điều trị các chứng: háo khát gây ho, đau nhức xương, viêm nha chu, thổ huyết, viêm bàng quang mãn tính, di tinh mộng tinh, suy nhược thần kinh hoa mắt chóng mặt, sốt nóng lao lực, đau dạ dày (vị nhiệt), khát phương, giải nhiệt dưỡng vị, đầy hơi ho và hư lao gầy mòn.
• Thực trạng và cơ sở vi nhân giống: Đánh giá ưu điểm (nhân nhanh số lượng lớn, độ đồng nhất di truyền cao, sạch bệnh, chủ động sản xuất quanh năm) và nhược điểm (chi phí thiết bị, nguy cơ biến dị soma nếu lạm dụng chất điều hòa sinh trưởng) của nuôi cấy in vitro. Tổng hợp các nghiên cứu nhân giống Lan Thạch Hộc và các loài cùng chi (Dendrobium nobile, Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium fimbriatum) của các tác giả trong và ngoài nước.

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết thiết kế của 5 nội dung thí nghiệm chính được tiến hành tại Phòng Ứng dụng Công nghệ sinh học Thực vật (Học viện Nông nghiệp Việt Nam):

• Thí nghiệm 1 (Cảm ứng tạo callus/nốt sần): 7 công thức trên nền MS bổ sung 6-BA (0–3,0 ppm/l) và NAA (0–0,5 ppm/l) dưới hai điều kiện chiếu sáng và tối.
• Thí nghiệm 2 (Nhân nhanh callus/PLB): 6 công thức trên nền ½ MS bổ sung 6-BA (0–2,5 ppm/l) kết hợp NAA (0–0,5 ppm/l).
• Thí nghiệm 3 (Tái sinh chồi): 6 công thức trên nền ½ MS khảo sát sự phân hóa chồi từ nốt sần.
• Thí nghiệm 4 (Sinh trưởng và phát triển chồi mầm): 6 công thức trên nền ½ MS theo dõi sự kéo dài thân lá sau 3 tuần nuôi cấy.
• Thí nghiệm 5 (Tạo rễ in vitro): 6 công thức trên nền MS bổ sung 0,2 g/l than hoạt tính, 6-BA (0,5 ppm/l) và nồng độ NAA biến thiên từ 0,5 đến 2,5 ppm/l.
• Xác định công thức tính toán các chỉ tiêu sinh trưởng và quy chuẩn phân tích phương sai ANOVA trên phần mềm SPSS 22.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu thập được qua các giai đoạn nuôi cấy:

• Cảm ứng tạo PLB từ mẫu đốt thân ban đầu:
  • Phương pháp khử trùng bằng HgCl₂ 0,1% trong 10 phút kiểm soát tỷ lệ nhiễm hiệu quả.
  • Trong điều kiện tối, mẫu đốt thân bắt đầu nhú nốt sần sau 5–6 ngày; ở điều kiện sáng, dấu hiệu tạo nốt sần xuất hiện sau 4 ngày.
  • Sau 30 ngày nuôi cấy, công thức đối chứng (CT1: 0 ppm/l 6-BA, 0 ppm/l NAA) hoàn toàn không hình thành nốt sần ở điều kiện tối (0%) và chỉ đạt 2,86% ở điều kiện sáng.
  • Ở điều kiện tối, công thức CT4 (MS + 1,5 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA) cho tỷ lệ sống 91,43 ± 5,71% và tỷ lệ tạo nốt sần cao nhất đạt 77,14 ± 5,71%, nốt sần mập, phát triển đều.
  • Ở điều kiện sáng, công thức CT4 cũng đạt tỷ lệ tạo nốt sần cao nhất trong nhóm sáng (62,86 ± 5,71%), nhưng thấp hơn đáng kể so với nuôi cấy trong tối.
• Giai đoạn nhân nhanh nốt sần tạo cụm PLB:
  • Sau 10 ngày cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh, mẫu có biểu hiện hóa nâu nhẹ do phản ứng tạo vết thương; sau 20 ngày các thể PLB hình thành rõ nét tại vết cắt; sau 40 ngày cụm PLB phát triển phồng to, có màu trắng ngà hoặc trắng sáng.
  • Công thức CT3 (½ MS + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol + 1,0 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA) cho kết quả tối ưu nhất với số lượng 3,6 ± 0,24 PLB/mẫu, khối lượng tươi sau 30 ngày đạt 0,191 ± 0,10 g và hệ số nhân cao nhất đạt 2,63 ± 0,15 lần.
  • Công thức CT4 (1,5 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA) cũng cho số lượng PLB tương đương (3,6 ± 0,24) nhưng hệ số nhân thấp hơn (2,41 ± 0,15 lần). Nồng độ 6-BA quá cao (2,0 ppm/l ở CT5) hoặc quá thấp (0,5 ppm/l ở CT2) đều làm giảm hệ số nhân (lần lượt đạt 1,68 và 1,81 lần).
• Giai đoạn tái sinh chồi, phát triển cân bằng rễ thân lá: Nốt sần phân hóa thành chồi mầm xanh sau khi chuyển môi trường; bổ sung than hoạt tính 0,2 g/l giúp hấp thụ độc chất phenolic tiết ra, tạo môi trường thuận lợi cho rễ bất định phát triển cân đối với thân lá trước khi ra ngôi.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Tóm tắt các thông số tối ưu cho quy trình vi nhân giống Lan Thạch Hộc và đề xuất các bước tiếp tục hoàn thiện kỹ thuật huấn luyện cây con thích nghi ngoài vườn ươm.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chính

Điều kiện / Giai đoạn	Công thức tối ưu	Thành phần môi trường chính	Tỷ lệ sống (%)	Tỷ lệ tạo PLB (%)	Số PLB / mẫu	Hệ số nhân (lần)
Tạo PLB trong tối (sau 30 ngày)	CT4	MS + 1,5 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol	91,43 ± 5,71	77,14 ± 5,71	—	—
Tạo PLB ngoài sáng (sau 30 ngày)	CT4	MS + 1,5 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol	94,29 ± 3,50	62,86 ± 5,71	—	—
Nhân nhanh PLB (sau 30 ngày)	CT3	½ MS + 1,0 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol	—	—	3,6 ± 0,24	2,63 ± 0,15
Nhân nhanh PLB (sau 30 ngày)	CT4	½ MS + 1,5 ppm/l 6-BA + 0,5 ppm/l NAA + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol	—	—	3,6 ± 0,24	2,41 ± 0,15
Đối chứng nhân nhanh (sau 30 ngày)	CT1 (ĐC)	½ MS + 30% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar + 0,1 g/l Inositol (không bổ sung hormone)	—	—	0	1,08 ± 0,02

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

1. Xác lập quy trình khử trùng mẫu: Khẳng định quy trình xử lý cồn 70° (30 giây) kết hợp dung dịch HgCl₂ 0,1% trong 10 phút là giải pháp hiệu quả giúp làm sạch mẫu đốt thân tự nhiên mà không gây chết mô.
2. Làm rõ vai trò của điều kiện tối trong cảm ứng PLB: Chứng minh việc nuôi cấy mẫu đốt thân trong điều kiện tối hoàn toàn ở giai đoạn đầu kích thích phản xạ phân hóa và tăng tỷ lệ tạo nốt sần cao hơn 14,28% so với điều kiện chiếu sáng liên tục 9 giờ/ngày.
3. Xác định tỷ lệ phối hợp hormone tối ưu: Xác định tổ hợp 6-BA nồng độ 1,0–1,5 ppm/l kết hợp với NAA 0,5 ppm/l trên nền môi trường MS/½ MS bổ sung 30% nước dừa là công thức hiệu quả nhất cho cả hai giai đoạn tạo nốt sần và nhân nhanh sinh khối PLB của Lan Thạch Hộc.
4. Ý nghĩa bảo tồn: Đóng góp số liệu thực nghiệm phục vụ việc xây dựng quy trình nhân giống vô tính hoàn chỉnh nhằm bảo tồn nguồn gen Dendrobium officinale có nguy cơ tuyệt chủng và hướng tới sản xuất cây giống sạch bệnh phục vụ ngành dược liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Đề tài được thực hiện trong phạm vi thời gian 7 tháng (tháng 2 đến tháng 8 năm 2021) tại điều kiện phòng thí nghiệm; các chỉ tiêu theo dõi tập trung chủ yếu vào giai đoạn cảm ứng nốt sần và nhân nhanh PLB; các dữ liệu chi tiết về tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây con khi ra ngôi ngoài vườn ươm tự nhiên chưa được hoàn thiện đầy đủ trong báo cáo.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục khảo sát các loại giá thể vườn ươm (than củi, dớn, vỏ thông), chế độ tưới và phân bón vi lượng ở giai đoạn sau in vitro; nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Bioreactor) để nâng cao hơn nữa hệ số nhân giống trên quy mô bán công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Nông học, Công nghệ sinh học thực vật, Bảo tồn đa dạng sinh học và Dược liệu học.

Các nội dung có giá trị tham khảo cụ thể bao gồm:

• Quy trình chuẩn bị nồng độ chất khử trùng HgCl₂ cho mẫu phong lan thu thập từ thực tế.
• Các công thức môi trường dinh dưỡng chi tiết (nồng độ khoáng MS, tỉ lệ nước dừa, đường, inositol và tổ hợp chất điều hòa 6-BA/NAA).
• Bảng số liệu thống kê ANOVA về sự sai khác giữa các nghiệm thức chiếu sáng và nồng độ chất kích thích sinh trưởng trong vi nhân giống Lan Thạch Hộc.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu vật liệu khởi đầu được sử dụng trong nghiên cứu này là bộ phận nào của cây?
Tác giả sử dụng các đoạn đốt thân (mang mắt ngủ) cắt ngắn với chiều dài khoảng 0,5 cm lấy từ cây bố mẹ Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale).

2. Điều kiện chiếu sáng nào cho tỷ lệ tạo nốt sần (PLB) từ mẫu đốt thân cao nhất?
Điều kiện tối hoàn toàn (0 giờ chiếu sáng/ngày) cho tỷ lệ tạo nốt sần cao nhất (đạt 77,14% ở công thức CT4), cao hơn rõ rệt so với điều kiện chiếu sáng 9 giờ/ngày bằng đèn huỳnh quang (chỉ đạt tối đa 62,86% ở cùng công thức).

3. Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nào cho hệ số nhân PLB cao nhất ở giai đoạn nhân nhanh?
Công thức CT3 trên nền môi trường ½ MS bổ sung 1,0 ppm/l 6-BA kết hợp 0,5 ppm/l NAA (cùng 30% nước dừa, 30 g/l đường, 7 g/l agar, 0,1 g/l Inositol) cho hệ số nhân cao nhất đạt 2,63 ± 0,15 lần sau 30 ngày nuôi cấy.

4. Dung dịch và thời gian khử trùng bề mặt mẫu đốt thân được tác giả áp dụng như thế nào?
Mẫu được rửa xà phòng 20 phút, nhúng cồn 70° trong 30 giây, sau đó khử trùng bằng dung dịch muối thủy ngân HgCl₂ 0,1% trong thời gian 10 phút và rửa lại bằng nước cất vô trùng 3–5 lần.

5. Vì sao môi trường đối chứng (CT1 không bổ sung 6-BA và NAA) không thể nhân nhanh PLB?
Số liệu thực nghiệm cho thấy sau 30 ngày nuôi cấy, công thức đối chứng CT1 có số lượng PLB hình thành bằng 0 và hệ số nhân khối lượng chỉ đạt 1,08 ± 0,02 lần, do mô phân sinh của Lan Thạch Hộc thiếu sự kích thích đồng thời của Auxin và Cytokinin ngoại sinh để phá vỡ trạng thái ngủ và phân hóa tế bào soma.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Ngô Vân Long đã nghiên cứu thực nghiệm thành công ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng (6-BA, NAA) và điều kiện ánh sáng đến quá trình cảm ứng tạo nốt sần cũng như nhân nhanh PLB loài Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale). Kết quả xác định môi trường MS bổ sung 1,5 ppm/l 6-BA kết hợp 0,5 ppm/l NAA trong điều kiện tối hoàn toàn là tối ưu cho việc tạo nốt sần, trong khi môi trường ½ MS bổ sung 1,0 ppm/l 6-BA kết hợp 0,5 ppm/l NAA mang lại hệ số nhân PLB cao nhất (2,63 lần). Công trình cung cấp các dẫn liệu khoa học và thông số kỹ thuật thực nghiệm chuẩn xác, đóng góp thiết thực cho công tác bảo tồn nguồn gen dược liệu quý hiếm và phát triển công nghệ vi nhân giống phong lan tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) là loài phân bố chủ yếu ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trung Quốc. Đây là thảo dược chuyên dụng để điều trị bệnh tiểu đường và một số bệnh nan y. Thạch Hộc tía (hay còn gọi là Thạch Hộc thiết bì) có hoạt tính tăng cường Insulin, giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản,giảm cholesterol và tri-glyceride mà còn có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh. Được dùng chữa những bệnh sốt nóng, khô cổ, khát nước, không muốn ăn, mắt kém, khớp xương sưng đau.

Thạch Hộc có khả năng phát triển rộng rãi ở các vùng miền của nước ta, đem lợi ích đáng kể cho nông dân, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, xuất khẩu đem về ngoại tệ cho đất nước. Theo Đặng Văn Đông (2004) hiện nay giá của một cây Thạch Hộc có thể từ 100. Điều làm nên giá trị dược liệu của loài này chính là hợp chất polysaccharide và alkaloid. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc rất lớn, có giá cao, đem lại siêu lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc.

Hiện nay Thạch Hộc nằm trong danh mục Đỏ của cuốn “Sách đỏ Việt Nam” năm 2007. Để bảo tồn và phát triển loài Thạch Hộc quý hiếm nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng cần phải nghiên cứu nuôi trồng chúng. Xuất phát từ lợi ích và nhu cầu thực tế hiện nay, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và điều kiện ánh sáng trong việc tạo callus của Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) từ thân cây và nhân nhanh giống Lan Thạch Hộc trong điều kiện phòng thí nghiệm”. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.

Mục đích Đánh giá được ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng và các chất điều tiết sinh trưởng NAA và 6BA đến sự sinh trưởng và phát triển của Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) thông qua phương pháp nhân giống nuôi cấy mô thực vật. Từ đó có thể đạt được kết quả nhân giống hiệu quả hơn, nhằm góp phần bảo vệ loài dược liệu quý hiếm của Việt Nam tránh khỏi nguy cơ bị tuyệt chủng. Yêu cầu Qua các kết quả nghiên cứu của các tác giả và từ mục đích của đề tài nghiên cứu ta cần tập trung giải quyết một số vấn đề sau: - Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy nhằm tạo nhanh callus từ thân cây nuôi cấy, tìm được môi trường thích hợp nhất cho hệ số nhân cao và chất lượng chồi tốt. - Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống Lan Thạch Hộc đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của thị trường.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Đánh giá được sự ảnh hưởng của yếu tố sinh trưởng, ánh sáng đến sự sinh trưởng phát triển của Lan Thạch Hộc trong giai đoạn đầu của nuôi cấy mô. Tạo điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất góp phần xây dựng, hoàn thiện nên quy trình nhân giống, hỗ trợ đắc lực trong quá trình nhân rộng sản xuất và phát triển cây dược liệu quý hiếm mà trước đó chúng ta chỉ khai thác trong tự nhiên; trên cơ sở đó bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Còn giúp giữ được phẩm chất đồng nhất về mặt di truyền cho cây giống, tránh những đột biến và phân ly không mong muốn.

Ý nghĩa thực tiễn Dendrobium officinale là nguồn gen quý hiếm của Việt Nam đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, nhân giống Lan Thạch Hộc là nhằm bảo tồn đưa vào trồng trọt và phát triển nguồn gen quý hiếm này. Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng và sạch bệnh theo mong muốn, giá cả phù hợp, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược với khả năng nhân giống số lượng lớn trong thời gian ngắn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) Sở dĩ nó được đặt cho cái tên Thạch Hộc là do loại cây này thường mọc ra từ trong các kẽ đá.

Lan Thạch Hộc thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae) phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.400m so với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng. Trong điều kiện môi trường tự nhiên độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18oC, lượng mưa 900 - 1.500mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá. Cây Thạch Hộc tía phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới. Cây Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale) 4 2.

Phân loại Lan Thạch Hộc có tên khoa học là: Dendrobium officinale Tên gọi khác: Thạch Hộc tía, Thiết bì, Thạch Hộc rỉ sắt Chi: Thạch Hộc (Dendrobium) Họ: Phong Lan (Orchidaceae) Bộ: Phong Lan (Orchidales) 2. Đặc điểm hình thái Thạch Hộc sống phụ sinh trên thân cây gỗ hoặc ở những vách đá. Chúng thường mọc thành khóm và chỉ cao khoảng 30 - 50cm. Thân cây Lan Thạch Hộc Thân của cây Thạch Hộc không tròn và có hình hơi dẹt, có những rãnh dọc xuất hiện trên thân, thân dưới mỏng hơn phần thân phía trên.

Ngoài ra, trên thân có những đốt dài khoảng 2, 5 - 3cm, có vân dọc. Tùy vào từng dạng Thạch Hộc mà màu thân cũng khác nhau. Nếu là Thạch Hộc tía, thân của chúng sẽ có màu tím. Còn với các dạng Thạch Hộc khác, thân của chúng có màu xanh.

Lá cây Lan Thạch Hộc Lá rộng khoảng 2 - 3 cm, dài khoảng 12cm. Nó có hình thuôn dài mọc so le và tạo thành dây đều 2 bên thân. Trên mặt lá Thạch Hộc có 5 gân dọc và gần như không có cuống, đầu của lá hơi cuộn lại thành hình cái móng. Hoa nhỏ, có 2 - 4 cánh hình bầu dục hoặc nhọn cuốn thành phễu, mọc ở kẽ lá.

Nó có màu hồng, nhưng trong họng hoa sẽ xuất hiện các chấm màu tím. Chúng không mọc riêng lẻ mà mọc thành chùm trên các cuống dài. Quả nang có hình hơi thoi, nó sẽ tự nở ra khi khô. Trong quả có rất nhiều hạt nhỏ như bụi phấn.

Thông thường, hoa sẽ nở vào khoảng tháng 2 - 4, mùa quả là vào tháng 4 - 6. Loại cây này có thể mọc hoang nhưng cũng có thể được dùng làm cảnh. Phân bố Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh.

Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới 11 loài được xem là dược liệu quý. Đặc biệt, Thạch Hộc tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất. Tại Việt Nam cũng có nhiều loài Lan. Chúng được phân bố rộng rãi, trải dài từ Bắc vào Nam.

Có nhiều loại sắp hoặc đã bị tuyệt chủng, một số khác thì 6 đang được liệt vào sách Đỏ cần phải được bảo tồn. Trong số những loài này, chúng ta cần kể đến loài Lan Thạch Hộc. Nó phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc, được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc. Giá trị của cây Lan Thạch Hộc Lan Thạch Hộc đứng đầu trong sách Thần Nông, công trình dược học đầu tiên của Trung Hoa cổ đại về các cây thuốc quý, được coi là thứ đứng đầu trong chín loại tiên dược trong kinh điển Đạo gia từ 1000 năm trước.

Nó cũng được ghi trong Dược điển Trung Quốc 2010; giá trị sản lượng của Thạch Hộc thiết bì đạt hàng tỷ NDT năm 2011. Thạch Hộc thiết bì được chế biến thành phong đấu (Tie-pi Feng-dou) là một trong những thực phẩm chức năng được sản xuất và bán nhiều nhất ở Trung Quốc. Hình ảnh phong đấu Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Thạch Hộc thiết bì tốt cho bổ âm sinh dịch, chữa chứng hỏa hư, trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ đôi mắt. Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp.

Giá trị của Thạch Hộc có 2 loại công năng chủ yếu: 7 - Làm thuốc: Thạch Hộc tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời. Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch Hộc tía có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng và làm các bài thuốc. Thạch Hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch Hộc được thị trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch Hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạch Hộc tía.

- Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra có thể nấu cháo Thạch Hộc, trà Thạch Hộc và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây công năng làm thực phẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng. Thạch Hộc tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô.

Dưới đây xin giới thiệu những phương thuốc chữa bệnh từ cây Lan Thạch Hộc : - Bài thuốc giảm háo khát và chữa ho + Chuẩn bị: Thiên môn, trần bì, Thạch Hộc và tỳ bà diệp. + Thực hiện: Đem sắc uống. - Bài thuốc thanh nhiệt và giảm đau nhức xương + Chuẩn bị: Sa sâm, ngưu tất, đẳng sâm, đỗ trọng và câu kỷ. + Thực hiện: Đem sắc uống và dùng mỗi ngày.

- Bài thuốc giúp răng chắc khỏe và điều trị viêm nha chu + Chuẩn bị: Thăng ma, ngọc trúc, sâm, sinh địa, kỷ tử, quy bản, huyền sâm và Thạch Hộc mỗi thứ 12g, bạch thược 8g và kim ngân hoa 16g. + Thực hiện: Đem sắc và lấy khoảng 200ml. Chia thành 2 phần, 1 phần uống còn 1 phần dùng để ngậm. 8 - Bài thuốc chữa thổ huyết, nóng trong người gây háo khát + Chuẩn bị: Sinh địa, sa sâm, thiên môn, thạch hộc, thục địa, đan sâm và ngưu tất mỗi thứ 16g và ngũ vị tử 3g.

+ Thực hiện: Đem sắc uống.