Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng và sự sinh tổng hợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn catharanthus roseus l g don

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tăng trưởng và sinh tổng hợp alkaloid ở mô sẹo cây dừa cạn, cung cấp thông tin hữu ích cho nông nghiệp.

• Tác giả: Lê Trí Nhơn
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Thị Thủy Tiên
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Đến Tăng Trưởng Và Sinh Tổng Hợp Alkaloid Ở Mô Sẹo Cây Dừa Cạn
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Chất điều hòa sinh trưởng

Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D và NAA kết hợp với kinetin lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, 2,4-D có hiệu quả cao hơn trong việc kích thích sự tăng sinh mô sẹo so với NAA. Điều này được thể hiện qua chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao hơn ở các môi trường có bổ sung 2,4-D. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, nồng độ tối ưu của 2,4-D là 1,0 và 2,0 mg/l, giúp mô sẹo có dạng xốp và tăng sinh mạnh mẽ.

1.1. Ảnh hưởng của 2 4 D

2,4-D được chứng minh là có khả năng kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo hiệu quả. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mô sẹo được tạo ra từ trụ hạ diệp và đốt thân in vitro trên môi trường có 2,4-D 2,0 mg/l có chỉ số tăng trưởng cao nhất. Điều này khẳng định vai trò quan trọng của 2,4-D trong việc tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.2. Ảnh hưởng của NAA

Mặc dù NAA cũng có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo, nhưng hiệu quả thấp hơn so với 2,4-D. Mô sẹo được tạo ra trên môi trường có NAA có dạng đặc và tăng sinh chậm hơn. Điều này cho thấy, NAA không phải là lựa chọn tối ưu cho việc tạo mô sẹo trong nghiên cứu này.

II. Tăng trưởng cây dừa cạn

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự tăng trưởng cây dừa cạn thông qua việc tạo mô sẹo và huyền phù tế bào. Kết quả cho thấy, mô sẹo được tạo ra từ trụ hạ diệp có thời gian tạo sẹo ngắn hơn so với đốt thân và lá non. Điều này chứng tỏ, nguồn nguyên liệu khởi đầu có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.

2.1. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu

Nguồn nguyên liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mô sẹo. Trụ hạ diệp được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt nhất, giúp rút ngắn thời gian tạo sẹo và tăng hiệu suất tăng trưởng. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tối ưu hóa quy trình tạo mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.

2.2. Tăng trưởng huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào được hình thành và tăng sinh ổn định sau 3 tuần nuôi cấy. Thể tích tế bào khởi đầu ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào, với thể tích 2,0 ml tế bào khởi đầu/20 ml môi trường lỏng cho hiệu quả cao nhất. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc tối ưu hóa mật độ tế bào khởi đầu trong quy trình nuôi cấy.

III. Sinh tổng hợp alkaloid

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh tổng hợp alkaloid trong mô sẹo và huyền phù tế bào. Kết quả cho thấy, vinblastine và vincristine được tổng hợp trong mô sẹo và huyền phù tế bào trên các môi trường có 2,4-D. Điều này chứng tỏ, 2,4-D không chỉ kích thích sự tăng sinh mô sẹo mà còn thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các alkaloid thực vật có giá trị y học cao.

3.1. Định tính và định lượng alkaloid

Vinblastine được phát hiện trong mô sẹo trên tất cả các môi trường có 2,4-D, trong khi vincristine chỉ xuất hiện trong mô sẹo và huyền phù tế bào trên môi trường có 2,4-D 1,5 mg/l. Điều này cho thấy, nồng độ 2,4-D có ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp các alkaloid thực vật.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất các alkaloid thực vật như vinblastine và vincristine từ mô sẹo cây dừa cạn. Đây là giải pháp hiệu quả để đáp ứng nhu cầu về các hợp chất tự nhiên có giá trị y học cao, thay thế cho phương pháp chiết xuất truyền thống từ cây nguyên vẹn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỎ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LÊ TRÍ NHƠN KHẢO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG THUC VAT LEN SU TANG TRUONG VA SU SINH TONG HOP CHAT ALKALOID CUA MO SEO CAY DUA CAN CATHARANTHUS ROSEUS (L. DON CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOC MA NGANH: 60. HO CHI MINH, 08/2014 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUOC GIA TP. HO CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.

TS Lê Thị Thủy Tiên Cán bộ cham nhận xét 1: PGS. TS Bùi Văn Lệ Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trần Trung Hiếu Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Truong Dai học Bách Khoa, Dai học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2014. Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ bao gồm: 1.

Chủ tịch hội đồng: PGS. TS Nguyễn Đức Lượng 2. Thư ký hội đồng: TS. Nguyễn Tan Trung 3.

Ủy viên Phản biện 1: PGS.TS Bùi Văn Lệ 4. Ủy viên Phản biện 2: TS. Tran Trung Hiếu 5. Ủy viên Hội đồng: PGS.

TS Lê Thị Thủy Tiên Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CONG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -==OoQOO--- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Trí Nhơn MSHV: 12310743 Ngày. thang, năm sinh: 02/04/1987 Nơi sinh: Mỹ Tho — Tiền Giang Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60. TÊN DE TÀI: “ Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng va sự sinh tong hợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseus L.

NHIỆM VU VÀ NOI DUNG: > Tạo và nhân giống cây in vitro. > Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu khởi đầu đến sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự hình thành, tăng sinh và tong hop alkaloid của mô sẹo. > Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật và mật độ tế bào khởi đầu đến sự hình thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào.

> Định tính và định lượng Vinca alkaloid thu được từ mô seo và huyền phù tế bào. NGÀY GIAO NHIEM VU: 01/2014 Iv. NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 10/07/2014 V. CAN BO HUONG DAN: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Tp.

HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2014 CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) TRƯỞNG KHOA. (Họ tên và chữ ký) Luận văn Cao Học LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn chân thành tới quý Thầy Cô trường Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh và đặc biệt là các Thay Cô khoa Kỹ thuật Hóa Học. Luận văn được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ rất lớn từ Phó Giáo Sư — Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Cô đã truyền thụ phần lớn kiến thức chuyên ngành quý báu trong suốt 7 năm em học tập tại trường. Cô luôn quan tâm nhắc nhở, động viên trong quá trình làm luận văn, chia sẻ những khó khăn và giúp đỡ mỗi khi em cân truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm.

Cô luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành được luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô. Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến Phó Giáo Sư - Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương và Tiền sĩ Huỳnh Ngọc Oanh đã quan tâm tạo điều kiện về thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm và những góp ý trong quá trình làm luận văn. Cũng không thể quên gửi lời cảm ơn tới Ths.

Trần Trúc Thanh, Ths. Võ Thanh Phúc đã giúp đỡ về dung cu, hóa chất phòng thí nghiệm và những trao đổi trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Tôi cũng cảm ơn sự giúp đỡ. hỗ trợ nhiệt tình và trợ giúp của em Nguyễn Lê Minh Châu — sinh viên ngành Công nghệ sinh học Khóa 2009 dé hoàn thành luận văn.

Ngoài ra, tôi cũng xin cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ủng hộ, động viên và trợ giúp mỗi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình học tập và làm việc. Xin gửi lời Chúc sức khỏe déi dào đến các Thay Cô, các bạn va gia đình. Xin chân thành cảm ơn. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2014 Học viên thực hiện Lê Trí Nhơn Luận văn Cao Học TÓM TAT Mô sẹo từ trụ hạ diệp của cây mam dừa cạn in vitro, đốt than in vitro và lá non của cây trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung kinetin 0,5 mg/1 kết hợp với 2,4-D (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l) hay NAA (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l).

Kết quả cho thấy thời gian tao seo từ trụ ha diệp của cây mam ngan hon từ đốt thân cay in vitro va la non của cây trưởng thành ở các nghiệm thức khảo sát. Sự cảm ứng m6 sẹo xảy ra nhanh hơn đồng thời chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao hon ở môi trường có bồ sung kinetin và 2,4—D so với môi trường có bố sung kinetin và NAA. Sự tăng sinh của mô sẹo trên môi trường MS bo sung kinetin 0,5mg/1 và 2,4 — D nông độ 1,0 và 2,0 mg/l tốt nhất, mô sẹo có dạng xốp nên 2 nghiệm thức này được sử dụng cho mục đích tạo mô sẹo dé cung cấp nguyên liệu tạo huyền phù tế bao Huyền phù tế bào hình thành và tăng sinh 6n định sau 3 tuần nuôi cấy. Thể tích tế bào khởi đầu có ảnh hưởng quan trọng đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào và thể tích 2,0 ml tế bào khởi đầu/ 20ml môi trường lỏng có hiệu quả cao nhất.

Vinblastine hiện diện trong mô sẹo trên tất cả các môi trường có 2,4 — D. Với huyền phù tế bao, vinblastine chỉ có trong tế bào được nuôi cay trong môi trường có 2,4 — D 0,5 hay 2,0 mg/l. Vincristine được ghi nhận có mặt trong mô sẹo va huyền phù tế bào trong nghiệm thức có 2,4 —D 1,5 mg/l. ii Luận văn Cao Học MỤC LỤC Trang LOT CAM ON 0.

ii MUC LUC 0 —. iii DANH MỤC HÌNIHH. G5 G55 E5 E51 9 9 9 S9 9v gu eo viii 0.1 Tính cấp thiết của dé tài. ch TT TT HT TH HT TH TT HH ru | 1.2 Mur tidu nghién CUU 011.3) NOi dung nghién CUU 20.

2 CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAL LIEU .5-5- <5 << 5° <5 SE x5 sex £eeeseses 3 ° IV) U0// 00000) (.1 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của cây dừa cạn ở Việt nam.2 Giá tri y học của cây dừa Cạn.2 Hop chat vinca alkaloid .1 Hợp chất alkalOid. - c6 E61 3 111K TS ST TH TT người 5 2.1 Phân loại alkaloid ou. Vinca alkaloid của Cay dừa Cat .1 Hợp chất Vinblastine 0.2 Hợp chat Vincristine .3 Sinh tong hop alkaloid trong cây đừa cại.-- s6 SE 911 SE ng neo 9 2.1 Sinh tổng hợp alkaloid trong dita cạn .---- - + S6 SE 1S cv gg re 9 2.2 Cơ chế và tác dụng dược lý của alkaloid dừa cạn.4 _ Các kỹ thuật nuôi cay tẾ bào thực vật. --- c- ke k1 1T ng ng ngu 14 2.1 Tao mô seo từ mô hay cơ quan thực vật.2 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo mô sẹo.

15 Luận văn Cao Học 2A.3 Sự tạo huyén phù té bảo.- c1 S91 v1 11 1 1 11g H1 HT Hàn ru 19 2.5 Tinh hình nghiên cứu trong nước và nước n8OàI.1 Tinh hình nghiÊn cứu trong nƯỚC.2 Tinh hình nghién cứu nước nØOảiI. - ------ << c 3232101101111 1111111111115 111111132 21 CHUONG 3: VAT LIEU VA PHƯƠNG PHP .1 Vật liệu tạo cây mầm i7? VỈ/FO.-c- «kh 1k1 5 1T TH TH HT ng 25 3.2 Vật liệu tạo chi 17 Vi/rO. cv tr HH1.3 Vật liệu tạo M6 SO. CS 1102100210 TH HH ng ng nh cv 26 3.4 Vật liệu tạo huyền phù té bảoO.

- -- Sk 11v S311 51111 1 111g ng gu 28 3.5 Chat chuẩn dùng dé định lượng vinblastine. ¿+ 6xx ke exeevserxes 28 3.2 _ Phương pháp thực hiỆn.1 Tổng quát quy trình thí nghiệm. G6 skS E12 E E83 3E ng se reo 29 3.2 Phương pháp khử trùng .1 Khu tring hat.2 Khử trùng đốt than ccc ccccescecsccscscsccecccsssvsccssvsceevecsceecevsesacsesvavscesvavsenens 31 3.3 Khử trùng lá non của cây trưởng thành.3 Cac chi ti€u Khao n6 gai.1 Su hình thành va tăng sinh mô Se0 .2 Sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tẾ.4 Phương pháp chiết xuất và định tính alkaloid diva cạn .5 Phương pháp định lượng alkaloid dừa cạn.1 Nguyên lý phương pháp LCMS.2 Ứng dụng của phương pháp LCMS.3 Thiết bi sử dung trong phương pháp LCMS ou. cesecesessceseseesssssceseecseeees 38 CHƯƠNG 4: KET QUA VA BIEN LUAN wu.

cccccsccscscsssssscscsscsssscsssssssscssesssssssssssscessesess 41 AL KẾT Quacccccccccccscsssccscssscsscssescscsctscscsccssvscssssvsccavscsssecscnessvacsesevavscavscavavsaavscneeess 41 4.1 Ảnh hưởng của loại và nông độ auxin lên sự hình thành mô sẹo. 4] IV Luận văn Cao Học 4.1 Sự tạo sẹo trên môi trường có 2,4 — Ì).2 Su tạo seo trên môi trường CO NAA .2 Anh huong cua chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng sinh mô sẹo.1 Với auxin là 2,4 - Ï.2 Voi auxin là NA A.3 Kết quả định tính alkaloid từ mô Se .4 Kết qua định lượng vinblastine va định tinh vincristine của mô sẹo có nguồn gốc TỪ MO SEO.--- ---- CC Q0 01900 TH HT cu HT ch cha 56 4.5 Sự hình thành và tăng sinh của huyén phủ té bảo.1 Sự tạo huyền phù tẾ bảO.-- ch 1n HT HH HT ng ro 57 4. Sự tăng sinh của huyén phù tế bảo. - G1 11T TT TH TT TH TT HT HT TH TT TH TH ng gu 62 Đa -adaa.

Vai trò của vật liệu khởi đầu trong sự hình thành mô sẹo. Vai trò cua auxin ngoại sinh lên sự hình thành va tăng sinh của mô sẹo. Ảnh hưởng của mật độ tế bào khởi đầu lên sự tăng sinh của huyền phù tế bào. Vai trò của auxin trong sự tong hợp hợp chất thứ cấp.--- - se se sex sersed 65 CHƯƠNG 5: KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ,.

2 5 <5 5 <5 << x<Ssx e9 cueg cu 67 5.G- SH HT TT TT TH TT TH TT TH TT ng HH nh rkt 67 TÀI LIEU THAM IKHÁOO. Error! Bookmark not defined. Luận văn Cao Học DANH MỤC ANH Trang Ảnh 2.1 Cây và hoa dita cạn.1 Qua va hat của cây dita cạn. c1 TT TT HT TT TT ng HT ng ưyn 25 Ảnh 3.2 Cây dừa cạn trưởng thành cung cấp vật liệu tạo ChOi 177 vi#rO.