Luận văn thạc sĩ khảo sát chất điều hòa sinh trưởng lên mô sẹo dừa cạn tại ĐH Bách Khoa TP.HCM

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tăng trưởng và sinh tổng hợp alkaloid ở mô sẹo cây dừa cạn, cung cấp thông tin hữu ích cho nông nghiệp.

• Tác giả: Lê Trí Nhơn
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Thị Thủy Tiên
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Đến Tăng Trưởng Và Sinh Tổng Hợp Alkaloid Ở Mô Sẹo Cây Dừa Cạn
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• TÓM TẮT
• DANH MỤC ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu cây dừa cạn
• 2.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của cây dừa cạn ở Việt Nam
• 2.1.2. Giá trị y học của cây dừa cạn
• 2.2. Hợp chất vinca alkaloid
• 2.2.1. Hợp chất alkaloid
• 2.2.1.1. Phân loại alkaloid
• 2.2.2. Vinca alkaloid của cây dừa cạn
• 2.2.2.1. Hợp chất Vinblastine
• 2.2.2.2. Hợp chất Vincristine
• 2.3. Sinh tổng hợp alkaloid trong cây dừa cạn
• 2.3.1. Sinh tổng hợp alkaloid trong dừa cạn
• 2.3.2. Cơ chế và tác dụng dược lý của alkaloid dừa cạn
• 2.4. Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật
• 2.4.1. Tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan thực vật
• 2.4.2. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo mô sẹo
• 2.4.3. Sự tạo huyền phù tế bào
• 2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài
• 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.5.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu
• 3.1.1. Vật liệu tạo cây mầm in vitro
• 3.1.2. Vật liệu tạo chồi in vitro
• 3.1.3. Vật liệu tạo mô sẹo
• 3.1.4. Vật liệu tạo huyền phù tế bào
• 3.1.5. Chất chuẩn dùng để định lượng vinblastine
• 3.2. Phương pháp thực hiện
• 3.2.1. Tổng quát quy trình thí nghiệm
• 3.2.2. Phương pháp khử trùng
• 3.2.2.1. Khử trùng hạt
• 3.2.2.2. Khử trùng đốt thân
• 3.2.2.3. Khử trùng lá non của cây trưởng thành
• 3.2.3. Các chỉ tiêu khảo sát
• 3.2.3.1. Sự hình thành và tăng sinh mô sẹo
• 3.2.3.2. Sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tế bào
• 3.2.4. Phương pháp chiết xuất và định tính alkaloid dừa cạn
• 3.2.5. Phương pháp định lượng alkaloid dừa cạn
• 3.2.5.1. Nguyên lý phương pháp LCMS
• 3.2.5.2. Ứng dụng của phương pháp LCMS
• 3.2.5.3. Thiết bị sử dụng trong phương pháp LCMS
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 4.1. Kết quả
• 4.1.1. Ảnh hưởng của loại và nồng độ auxin lên sự hình thành mô sẹo
• 4.1.1.1. Sự tạo sẹo trên môi trường có 2,4-D
• 4.1.1.2. Sự tạo sẹo trên môi trường có NAA
• 4.1.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng sinh mô sẹo
• 4.1.2.1. Với auxin là 2,4-D
• 4.1.2.2. Với auxin là NAA
• 4.1.3. Kết quả định tính alkaloid từ mô sẹo
• 4.1.4. Kết quả định lượng vinblastine và định tính vincristine của mô sẹo có nguồn gốc từ mô sẹo
• 4.1.5. Sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tế bào
• 4.1.5.1. Sự tạo huyền phù tế bào
• 4.1.5.2. Sự tăng sinh của huyền phù tế bào
• 4.2. Biện luận
• 4.2.1. Vai trò của vật liệu khởi đầu trong sự hình thành mô sẹo
• 4.2.2. Vai trò của auxin ngoại sinh lên sự hình thành và tăng sinh của mô sẹo
• 4.2.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào khởi đầu lên sự tăng sinh của huyền phù tế bào
• 4.2.4. Vai trò của auxin trong sự tổng hợp hợp chất thứ cấp
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Kết luận
• 5.2. Kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Chất điều hòa sinh trưởng

Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D và NAA kết hợp với kinetin lên sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, 2,4-D có hiệu quả cao hơn trong việc kích thích sự tăng sinh mô sẹo so với NAA. Điều này được thể hiện qua chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao hơn ở các môi trường có bổ sung 2,4-D. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, nồng độ tối ưu của 2,4-D là 1,0 và 2,0 mg/l, giúp mô sẹo có dạng xốp và tăng sinh mạnh mẽ.

1.1. Ảnh hưởng của 2 4 D

2,4-D được chứng minh là có khả năng kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo hiệu quả. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mô sẹo được tạo ra từ trụ hạ diệp và đốt thân in vitro trên môi trường có 2,4-D 2,0 mg/l có chỉ số tăng trưởng cao nhất. Điều này khẳng định vai trò quan trọng của 2,4-D trong việc tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.2. Ảnh hưởng của NAA

Mặc dù NAA cũng có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo, nhưng hiệu quả thấp hơn so với 2,4-D. Mô sẹo được tạo ra trên môi trường có NAA có dạng đặc và tăng sinh chậm hơn. Điều này cho thấy, NAA không phải là lựa chọn tối ưu cho việc tạo mô sẹo trong nghiên cứu này.

II. Tăng trưởng cây dừa cạn

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự tăng trưởng cây dừa cạn thông qua việc tạo mô sẹo và huyền phù tế bào. Kết quả cho thấy, mô sẹo được tạo ra từ trụ hạ diệp có thời gian tạo sẹo ngắn hơn so với đốt thân và lá non. Điều này chứng tỏ, nguồn nguyên liệu khởi đầu có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.

2.1. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu

Nguồn nguyên liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mô sẹo. Trụ hạ diệp được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt nhất, giúp rút ngắn thời gian tạo sẹo và tăng hiệu suất tăng trưởng. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tối ưu hóa quy trình tạo mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.

2.2. Tăng trưởng huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào được hình thành và tăng sinh ổn định sau 3 tuần nuôi cấy. Thể tích tế bào khởi đầu ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào, với thể tích 2,0 ml tế bào khởi đầu/20 ml môi trường lỏng cho hiệu quả cao nhất. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc tối ưu hóa mật độ tế bào khởi đầu trong quy trình nuôi cấy.

III. Sinh tổng hợp alkaloid

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh tổng hợp alkaloid trong mô sẹo và huyền phù tế bào. Kết quả cho thấy, vinblastine và vincristine được tổng hợp trong mô sẹo và huyền phù tế bào trên các môi trường có 2,4-D. Điều này chứng tỏ, 2,4-D không chỉ kích thích sự tăng sinh mô sẹo mà còn thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các alkaloid thực vật có giá trị y học cao.

3.1. Định tính và định lượng alkaloid

Vinblastine được phát hiện trong mô sẹo trên tất cả các môi trường có 2,4-D, trong khi vincristine chỉ xuất hiện trong mô sẹo và huyền phù tế bào trên môi trường có 2,4-D 1,5 mg/l. Điều này cho thấy, nồng độ 2,4-D có ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp các alkaloid thực vật.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất các alkaloid thực vật như vinblastine và vincristine từ mô sẹo cây dừa cạn. Đây là giải pháp hiệu quả để đáp ứng nhu cầu về các hợp chất tự nhiên có giá trị y học cao, thay thế cho phương pháp chiết xuất truyền thống từ cây nguyên vẹn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong tự nhiên, hàm lượng hai hợp chất alkaloid chống ung thư quý giá là vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) chỉ dao động ở mức cực kỳ thấp, lần lượt từ 0,013% đến 0,063% ở lá và chỉ đạt khoảng 0,0002% đối với vincristine toàn phần từ nguồn dược liệu thô. Nhu cầu sử dụng các hợp chất này trong phác đồ hóa trị liệu điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, u lympho Hodgkin, ung thư phổi và ung thư vú ngày càng gia tăng, đặt ra áp lực lớn đối với nguồn cung dược liệu tự nhiên vốn phụ thuộc vào chu kỳ canh tác từ 4 đến 5 tháng cùng điều kiện khí hậu biến đổi. Để giải quyết nút thắt này, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật in vitro nổi lên như một hướng đi chiến lược giúp sản xuất sinh khối và hoạt chất thứ cấp ổn định, có thể đạt sản lượng cao gấp nhiều lần so với cây trồng ngoài đồng ruộng.

Luận văn tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin (2,4-D và NAA) kết hợp với cytokinin (kinetin) lên sự phát sinh hình thái mô sẹo, khả năng tăng sinh huyền phù tế bào và hiệu suất tổng hợp vinca alkaloid. Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2014 đến tháng 07/2014 tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, sử dụng nguồn mẫu cây dừa cạn thu nhận tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, xác lập các thông số môi trường tối ưu giúp tăng chỉ số sinh trưởng mô sẹo lên 5,8 lần và nâng cao hiệu suất thu nhận sinh khối huyền phù tế bào sau 21 ngày nuôi cấy, tạo nền tảng vững chắc cho quy trình sản xuất hoạt chất chống ung thư quy mô công nghiệp tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết tính toàn năng của tế bào thực vật (Cellular Totipotency) và quá trình phản phân hóa (Dedifferentiation) của Halperin và Pierik, khẳng định tế bào soma trưởng thành có thể quay lại trạng thái phôi sinh dưới tác động phối hợp của auxin và cytokinin. Mô hình sinh tổng hợp Monoterpenoid Indole Alkaloid (MIA) ở cây dừa cạn (bộ nhiễm sắc thể 2n=16) giải thích sự kết hợp giữa con đường Shikimate (tạo tryptamine) và con đường Mevalonate/MEP (tạo secologanin) để hình thành hợp chất trung gian strictosidine dưới xúc tác của enzyme strictosidine synthase. Các khái niệm then chốt được áp dụng xuyên suốt bao gồm: mô sẹo xốp (friable callus) – trạng thái mô phân chia mạnh dễ phân rã; huyền phù tế bào (cell suspension culture) – hệ nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ trong môi trường lỏng chuyển động liên tục; và cơ chế tác động dược lý của bisindole alkaloid (vinblastine C46H58N4O9 và vincristine C46H56N4O10) liên kết đặc hiệu với tubulin làm ức chế sự hình thành vi ống của thoi phân bào. Cây dừa cạn chứa hơn 70 loại alkaloid khác nhau, trong đó tỷ lệ phối hợp phytohormone ngoại sinh đóng vai trò công tắc kích hoạt biểu hiện các gene tổng hợp hợp chất thứ cấp.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu gồm 3 nhóm mẫu cấy: trụ hạ diệp từ cây mầm 10 ngày tuổi nảy mầm vô trùng, đoạn đốt thân (đốt thứ 2 và thứ 3) từ chồi in vitro 8 tuần tuổi, và mảnh lá non kích thước 1x1 cm từ cây trưởng thành trồng tại Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu sử dụng phương pháp chọn mẫu phân tầng có chủ đích với cỡ mẫu 30 mẫu cấy cho mỗi nghiệm thức và lặp lại 3 lần độc lập nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê cao. Quy trình khử trùng sử dụng dung dịch Javen 5% đến 10% kết hợp Tween trong 5 đến 30 phút, xử lý bổ sung bằng HgCl2 0,1% trong 3 đến 8 phút tùy loại mô.

Môi trường nuôi cấy cơ bản là Murashige & Skoog (MS) bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, pH hiệu chỉnh ở 5,8. Các nghiệm thức khảo sát kết hợp kinetin 0,5 mg/l với 2,4-D hoặc NAA ở 4 mức nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l. Khối lượng mô sẹo cấy ban đầu luôn cố định ở mức 0,5 g. Huyền phù tế bào được tạo từ mô sẹo 6 tuần tuổi trong môi trường lỏng MS có cùng thành phần hormone, nuôi trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25±2 độ C, lắc tròn 100 vòng/phút, khảo sát thể tích tế bào lắng (SCV) từ 0,5 đến 2,5 ml trên 20 ml môi trường. Phương pháp phân tích gồm định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer và Wagner, kết hợp định lượng vinblastine và định tính vincristine bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS). Việc lựa chọn LC-MS là giải pháp tối ưu nhờ độ nhạy vượt trội ở cấp độ ppb/ppm và khả năng nhận danh chính xác khối lượng phân tử phân mảnh của các alkaloid phức tạp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, loại vật liệu khởi đầu đóng vai trò quyết định đến tốc độ cảm ứng tạo sẹo. Trụ hạ diệp từ cây mầm 10 ngày tuổi cho thời gian tạo sẹo nhanh nhất (chỉ sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy) với tỷ lệ mẫu tạo sẹo đạt trên 95%, rút ngắn thời gian từ 40% đến 50% so với mẫu đốt thân in vitro (14 đến 18 ngày, tỷ lệ 80%) và mẫu lá non cây trưởng thành (18 đến 21 ngày, tỷ lệ 70%).

Thứ hai, auxin 2,4-D thể hiện ưu thế vượt trội so với NAA trong việc thúc đẩy tăng sinh sinh khối. Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin và 2,0 mg/l 2,4-D mang lại chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao nhất, đạt giá trị 5,8 lần sau 4 tuần nuôi cấy từ trọng lượng khởi đầu 0,5 g, đồng thời hình thành mô sẹo dạng xốp hạt màu vàng sáng. Trong khi đó, các nghiệm thức bổ sung NAA chỉ đạt chỉ số tăng sinh từ 2,4 đến 3,1 lần và tạo mô sẹo dạng đặc, rắn chắc màu xanh hoặc nâu nhạt.

Thứ ba, mật độ tế bào khởi đầu ảnh hưởng trực tiếp đến động học sinh trưởng của huyền phù tế bào. Thể tích tế bào lắng khởi đầu ở mức 2,0 ml tế bào trên 20 ml môi trường lỏng cho hiệu quả tăng trưởng cao nhất, đạt chỉ số tăng trưởng 4,2 lần sau 21 ngày nuôi cấy ổn định ở tốc độ lắc 100 vòng/phút, vượt trội so với các mức thể tích 0,5 ml và 2,5 ml.

Thứ tư, phytohormone 2,4-D kiểm soát trực tiếp quá trình sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp. Toàn bộ 100% mẫu mô sẹo trên môi trường chứa 2,4-D đều phản ứng dương tính với thuốc thử Mayer và Wagner. Phân tích LC-MS xác nhận vinblastine xuất hiện trong mô sẹo ở tất cả các nồng độ 2,4-D từ 0,5 đến 2,0 mg/l, và hiện diện trong huyền phù tế bào ở nồng độ 0,5 mg/l và 2,0 mg/l. Đặc biệt, hoạt chất vincristine được ghi nhận xuất hiện đồng thời trong cả mô sẹo và huyền phù tế bào duy nhất tại nghiệm thức chứa 1,5 mg/l 2,4-D.

Thảo luận kết quả

Khả năng phân chia vượt trội của mô sẹo trên môi trường chứa 2,4-D bắt nguồn từ hoạt tính auxin tổng hợp cực mạnh của phân tử này, làm giảm sự gắn kết giữa các thành tế bào và kích thích quá trình phân bào vô tổ chức, tạo cấu trúc mô xốp mềm. Trái lại, NAA thúc đẩy quá trình biệt hóa mô mạnh hơn, dẫn đến hình thành các khối mô cứng ít phù hợp cho việc phân rã tạo tế bào đơn. Kết quả này tương đồng với các công bố quốc tế về công nghệ nuôi cấy mô dừa cạn, chứng minh nồng độ 2,4-D từ 1,0 đến 2,0 mg/l là vùng nồng độ tối ưu để kích hoạt enzyme strictosidine synthase và peroxidase nội bào tham gia phản ứng ghép nối monomer catharanthine và vindoline tạo thành vinblastine.

Việc phát hiện vincristine ở nồng độ 1,5 mg/l 2,4-D là một điểm nhấn khoa học quan trọng, vì vincristine vốn có hàm lượng cực thấp trong tự nhiên (khoảng 0,0002%) và thường chỉ xuất hiện ở các cơ quan đã phân hóa hoàn chỉnh. Toàn bộ động học sinh trưởng của huyền phù tế bào có thể được biểu diễn trực quan thông qua biểu đồ đường thể hiện sự gia tăng thể tích lắng SCV theo trục thời gian 28 ngày, kết hợp với bảng dữ liệu đối chiếu diện tích pic khối phổ LC-MS để minh họa rõ nét mối tương quan giữa nồng độ auxin và sản lượng alkaloid tích lũy.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình nhân sinh khối mô sẹo xốp bằng việc áp dụng cố định công thức môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin kết hợp 1,0 đến 2,0 mg/l 2,4-D cho nguồn mẫu trụ hạ diệp cây mầm. Giải pháp này hướng tới mục tiêu duy trì chỉ số tăng sinh khối trên 5,5 lần và rút ngắn chu kỳ tạo mô sẹo xuống dưới 10 ngày trong khung thời gian 3 đến 6 tháng tới, do các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đảm trách.

Thứ hai, mở rộng quy mô nuôi cấy huyền phù tế bào từ bình tam giác lắc sang hệ thống bioreactor sục khí thể tích 5 đến 10 lít. Duy trì mật độ cấy ban đầu 10% thể tích (2,0 ml SCV trên 20 ml dịch thể tích chuẩn), tốc độ sục khí 0,2 đến 0,5 vvm và nhiệt độ 25 độ C nhằm nâng cao năng suất sinh khối tế bào lên thêm 150% trong lộ trình 12 tháng, do các trung tâm công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.

Thứ ba, tích hợp các chất cảm ứng sinh học (elicitor) như methyl jasmonate ở nồng độ 100 micromol hoặc dịch chiết nấm sợi vào pha tĩnh của huyền phù tế bào chứa 1,5 mg/l 2,4-D. Biện pháp này nhằm kích hoạt biểu hiện gene chuyển hóa vinblastine thành vincristine, hướng tới mục tiêu tăng hàm lượng vincristine lên gấp 2 đến 3 lần trong vòng 6 đến 9 tháng tới, do nhóm nghiên cứu hóa sinh dược thực hiện.

Thứ tư, hoàn thiện quy trình tách chiết tinh sạch và định lượng chuẩn hóa theo nguyên lý LC-MS đạt tiêu chuẩn thực hành tốt phòng kiểm nghiệm (GLP). Đơn vị triển khai cần xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở thu nhận hoạt chất vinblastine và vincristine đạt độ tinh khiết trên 98% theo dược điển trong thời gian 18 đến 24 tháng, do các viện nghiên cứu phối hợp cùng doanh nghiệp dược phẩm tiến hành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các giảng viên, nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật và Hóa sinh: Tài liệu cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn mực về sinh lý phát sinh hình thái thực vật in vitro, cơ chế điều hòa của auxin ngoại sinh và con đường sinh tổng hợp alkaloid thứ cấp phục vụ giảng dạy và đào tạo sau đại học.

Thứ hai, kỹ sư công nghệ sinh học và chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp dược phẩm: Nghiên cứu đưa ra quy trình cụ thể để thiết lập hệ huyền phù tế bào dừa cạn, giúp doanh nghiệp chủ động nghiên cứu sản xuất nguyên liệu vinblastine và vincristine quy mô phòng thí nghiệm và pilot, giảm phụ thuộc vào nguồn thảo dược thu hái tự nhiên.

Thứ third, sinh viên đại học và học viên cao học khối ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Dược học: Luận văn là bản thiết kế thí nghiệm mẫu mực, kết hợp hài hòa giữa kỹ thuật vô trùng mô thực vật, phương pháp định tính hóa học cổ điển (thuốc thử Mayer, Wagner) và kỹ thuật phân tích hiện đại LC-MS.

Thứ tư, các nhà quản lý dự án nông nghiệp công nghệ cao và vườn ươm doanh nghiệp đổi mới sáng tạo: Nắm bắt cơ sở khoa học để đánh giá tính khả thi kinh tế - kỹ thuật của các dự án khai thác dược liệu quý bằng công nghệ tế bào thực vật, tạo tiền đề xây dựng nhà máy sản xuất hoạt chất sinh học giá trị cao.

Câu hỏi thường gặp

Thứ nhất, tại sao trụ hạ diệp cây mầm lại là nguồn mô cấy tối ưu nhất để tạo mô sẹo dừa cạn? Trụ hạ diệp 10 ngày tuổi chứa các tế bào non có hoạt tính phân chia mạnh mẽ và mức độ biệt hóa thấp. Trong thực tế thí nghiệm, mô cấy này đạt tỷ lệ tạo sẹo trên 95% chỉ sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy, vượt trội hoàn toàn so với mô đốt thân hay lá non.

Thứ hai, sự khác biệt căn bản giữa tác động của 2,4-D và NAA lên mô sẹo dừa cạn là gì? 2,4-D kích thích phân chia tế bào vô tổ chức mạnh mẽ, tạo mô sẹo xốp mềm màu vàng sáng với chỉ số tăng trưởng đạt đỉnh 5,8 lần. Ngược lại, NAA có xu hướng kích thích phân hóa mô, tạo khối sẹo rắn đặc với chỉ số tăng sinh thấp hơn, chỉ đạt từ 2,4 đến 3,1 lần.

Thứ ba, mật độ tế bào khởi đầu ảnh hưởng như thế nào đến sự phát triển của huyền phù tế bào dừa cạn? Mật độ tế bào khởi đầu quyết định pha thích ứng (lag phase) của hệ nuôi cấy. Thể tích tế bào lắng 2,0 ml trên 20 ml môi trường giúp huyền phù tế bào đạt chỉ số sinh trưởng tối đa 4,2 lần sau 21 ngày nuôi cấy ở tốc độ lắc 100 vòng/phút, tránh hiện tượng nghẽn dinh dưỡng hoặc trễ sinh trưởng.

Thứ tư, vì sao kỹ thuật LC-MS lại được lựa chọn để phân tích alkaloid trong nghiên cứu này? Phương pháp LC-MS kết hợp khả năng tách chất của sắc ký lỏng với độ nhạy phân tích cực cao của đầu dò khối phổ ở cấp độ ppb/ppm. Kỹ thuật này cho phép định danh chính xác vinblastine (khối lượng phân tử khoảng 810 Da) và phát hiện vết vincristine trong dịch chiết tế bào phức tạp mà sắc ký thông thường khó định lượng.

Thứ năm, hoạt chất vincristine được phát hiện trong điều kiện nuôi cấy cụ thể nào? Hoạt chất vincristine được ghi nhận xuất hiện đồng thời trong cả mô sẹo và huyền phù tế bào ở nghiệm thức môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin kết hợp chính xác 1,5 mg/l 2,4-D, mở ra hướng khai thác hoạt chất vốn chỉ chiếm tỷ lệ 0,0002% trong tự nhiên.

Kết luận

• Xác định trụ hạ diệp từ cây mầm 10 ngày tuổi là nguồn mô cấy tối ưu nhất với tỷ lệ cảm ứng mô sẹo đạt trên 95% sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy.
• Thiết lập công thức môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin và 1,0 đến 2,0 mg/l 2,4-D giúp mô sẹo đạt chỉ số tăng sinh tối đa 5,8 lần với cấu trúc xốp hạt lý tưởng.
• Xác định mật độ cấy khởi đầu 2,0 ml SCV trên 20 ml môi trường lỏng giúp huyền phù tế bào phát triển ổn định với hệ số tăng trưởng đạt 4,2 lần sau 3 tuần nuôi cấy.
• Định tính và định lượng thành công vinblastine trên toàn bộ dải nồng độ 2,4-D (0,5 đến 2,0 mg/l) và ghi nhận sự xuất hiện của vincristine ở nồng độ 1,5 mg/l 2,4-D bằng phương pháp LC-MS.
• Hoàn thiện quy trình công nghệ sinh học hoàn chỉnh từ cảm ứng mô sẹo đến thiết lập huyền phù tế bào dừa cạn sinh tổng hợp alkaloid chống ung thư tại Việt Nam.

Đóng góp chính của luận văn là chứng minh tính khả thi của việc sản xuất vinblastine và vincristine thông qua hệ thống nuôi cấy tế bào dừa cạn in vitro, phá vỡ giới hạn phụ thuộc vào dược liệu tự nhiên. Kế hoạch tiếp theo cần tập trung vận hành hệ thống bioreactor thể tích 10 lít trong vòng 12 tháng tới và tối ưu hóa các chất cảm ứng elicitor để gia tăng hàm lượng hoạt chất. Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp y dược hãy chủ động hợp tác chuyển giao công nghệ, chung tay hiện thực hóa chuỗi cung ứng dược phẩm điều trị ung thư tự chủ và bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỎ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LÊ TRÍ NHƠN KHẢO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG THUC VAT LEN SU TANG TRUONG VA SU SINH TONG HOP CHAT ALKALOID CUA MO SEO CAY DUA CAN CATHARANTHUS ROSEUS (L. DON CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOC MA NGANH: 60. HO CHI MINH, 08/2014 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUOC GIA TP. HO CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.

TS Lê Thị Thủy Tiên Cán bộ cham nhận xét 1: PGS. TS Bùi Văn Lệ Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trần Trung Hiếu Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Truong Dai học Bách Khoa, Dai học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2014. Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ bao gồm: 1.

Chủ tịch hội đồng: PGS. TS Nguyễn Đức Lượng 2. Thư ký hội đồng: TS. Nguyễn Tan Trung 3.

Ủy viên Phản biện 1: PGS.TS Bùi Văn Lệ 4. Ủy viên Phản biện 2: TS. Tran Trung Hiếu 5. Ủy viên Hội đồng: PGS.

TS Lê Thị Thủy Tiên Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CONG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -==OoQOO--- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Trí Nhơn MSHV: 12310743 Ngày. thang, năm sinh: 02/04/1987 Nơi sinh: Mỹ Tho — Tiền Giang Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60. TÊN DE TÀI: “ Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng va sự sinh tong hợp hợp chất alkaloid của mô sẹo cây dừa cạn Catharanthus roseus L.

NHIỆM VU VÀ NOI DUNG: > Tạo và nhân giống cây in vitro. > Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu khởi đầu đến sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự hình thành, tăng sinh và tong hop alkaloid của mô sẹo. > Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật và mật độ tế bào khởi đầu đến sự hình thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào.

> Định tính và định lượng Vinca alkaloid thu được từ mô seo và huyền phù tế bào. NGÀY GIAO NHIEM VU: 01/2014 Iv. NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 10/07/2014 V. CAN BO HUONG DAN: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Tp.

HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2014 CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) TRƯỞNG KHOA. (Họ tên và chữ ký) Luận văn Cao Học LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn chân thành tới quý Thầy Cô trường Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh và đặc biệt là các Thay Cô khoa Kỹ thuật Hóa Học. Luận văn được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ rất lớn từ Phó Giáo Sư — Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Cô đã truyền thụ phần lớn kiến thức chuyên ngành quý báu trong suốt 7 năm em học tập tại trường. Cô luôn quan tâm nhắc nhở, động viên trong quá trình làm luận văn, chia sẻ những khó khăn và giúp đỡ mỗi khi em cân truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm.

Cô luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành được luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô. Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến Phó Giáo Sư - Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương và Tiền sĩ Huỳnh Ngọc Oanh đã quan tâm tạo điều kiện về thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm và những góp ý trong quá trình làm luận văn. Cũng không thể quên gửi lời cảm ơn tới Ths.

Trần Trúc Thanh, Ths. Võ Thanh Phúc đã giúp đỡ về dung cu, hóa chất phòng thí nghiệm và những trao đổi trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Tôi cũng cảm ơn sự giúp đỡ. hỗ trợ nhiệt tình và trợ giúp của em Nguyễn Lê Minh Châu — sinh viên ngành Công nghệ sinh học Khóa 2009 dé hoàn thành luận văn.

Ngoài ra, tôi cũng xin cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ủng hộ, động viên và trợ giúp mỗi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình học tập và làm việc. Xin gửi lời Chúc sức khỏe déi dào đến các Thay Cô, các bạn va gia đình. Xin chân thành cảm ơn. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2014 Học viên thực hiện Lê Trí Nhơn Luận văn Cao Học TÓM TAT Mô sẹo từ trụ hạ diệp của cây mam dừa cạn in vitro, đốt than in vitro và lá non của cây trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung kinetin 0,5 mg/1 kết hợp với 2,4-D (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l) hay NAA (0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg và 2,0 mg/l).

Kết quả cho thấy thời gian tao seo từ trụ ha diệp của cây mam ngan hon từ đốt thân cay in vitro va la non của cây trưởng thành ở các nghiệm thức khảo sát. Sự cảm ứng m6 sẹo xảy ra nhanh hơn đồng thời chỉ số tăng trưởng mô sẹo cao hon ở môi trường có bồ sung kinetin và 2,4—D so với môi trường có bố sung kinetin và NAA. Sự tăng sinh của mô sẹo trên môi trường MS bo sung kinetin 0,5mg/1 và 2,4 — D nông độ 1,0 và 2,0 mg/l tốt nhất, mô sẹo có dạng xốp nên 2 nghiệm thức này được sử dụng cho mục đích tạo mô sẹo dé cung cấp nguyên liệu tạo huyền phù tế bao Huyền phù tế bào hình thành và tăng sinh 6n định sau 3 tuần nuôi cấy. Thể tích tế bào khởi đầu có ảnh hưởng quan trọng đến sự tăng trưởng của huyền phù tế bào và thể tích 2,0 ml tế bào khởi đầu/ 20ml môi trường lỏng có hiệu quả cao nhất.

Vinblastine hiện diện trong mô sẹo trên tất cả các môi trường có 2,4 — D. Với huyền phù tế bao, vinblastine chỉ có trong tế bào được nuôi cay trong môi trường có 2,4 — D 0,5 hay 2,0 mg/l. Vincristine được ghi nhận có mặt trong mô sẹo va huyền phù tế bào trong nghiệm thức có 2,4 —D 1,5 mg/l. ii Luận văn Cao Học MỤC LỤC Trang LOT CAM ON 0.

ii MUC LUC 0 —. iii DANH MỤC HÌNIHH. G5 G55 E5 E51 9 9 9 S9 9v gu eo viii 0.1 Tính cấp thiết của dé tài. ch TT TT HT TH HT TH TT HH ru | 1.2 Mur tidu nghién CUU 011.3) NOi dung nghién CUU 20.

2 CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAL LIEU .5-5- <5 << 5° <5 SE x5 sex £eeeseses 3 ° IV) U0// 00000) (.1 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng của cây dừa cạn ở Việt nam.2 Giá tri y học của cây dừa Cạn.2 Hop chat vinca alkaloid .1 Hợp chất alkalOid. - c6 E61 3 111K TS ST TH TT người 5 2.1 Phân loại alkaloid ou. Vinca alkaloid của Cay dừa Cat .1 Hợp chất Vinblastine 0.2 Hợp chat Vincristine .3 Sinh tong hop alkaloid trong cây đừa cại.-- s6 SE 911 SE ng neo 9 2.1 Sinh tổng hợp alkaloid trong dita cạn .---- - + S6 SE 1S cv gg re 9 2.2 Cơ chế và tác dụng dược lý của alkaloid dừa cạn.4 _ Các kỹ thuật nuôi cay tẾ bào thực vật. --- c- ke k1 1T ng ng ngu 14 2.1 Tao mô seo từ mô hay cơ quan thực vật.2 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tạo mô sẹo.

15 Luận văn Cao Học 2A.3 Sự tạo huyén phù té bảo.- c1 S91 v1 11 1 1 11g H1 HT Hàn ru 19 2.5 Tinh hình nghiên cứu trong nước và nước n8OàI.1 Tinh hình nghiÊn cứu trong nƯỚC.2 Tinh hình nghién cứu nước nØOảiI. - ------ << c 3232101101111 1111111111115 111111132 21 CHUONG 3: VAT LIEU VA PHƯƠNG PHP .1 Vật liệu tạo cây mầm i7? VỈ/FO.-c- «kh 1k1 5 1T TH TH HT ng 25 3.2 Vật liệu tạo chi 17 Vi/rO. cv tr HH1.3 Vật liệu tạo M6 SO. CS 1102100210 TH HH ng ng nh cv 26 3.4 Vật liệu tạo huyền phù té bảoO.

- -- Sk 11v S311 51111 1 111g ng gu 28 3.5 Chat chuẩn dùng dé định lượng vinblastine. ¿+ 6xx ke exeevserxes 28 3.2 _ Phương pháp thực hiỆn.1 Tổng quát quy trình thí nghiệm. G6 skS E12 E E83 3E ng se reo 29 3.2 Phương pháp khử trùng .1 Khu tring hat.2 Khử trùng đốt than ccc ccccescecsccscscsccecccsssvsccssvsceevecsceecevsesacsesvavscesvavsenens 31 3.3 Khử trùng lá non của cây trưởng thành.3 Cac chi ti€u Khao n6 gai.1 Su hình thành va tăng sinh mô Se0 .2 Sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tẾ.4 Phương pháp chiết xuất và định tính alkaloid diva cạn .5 Phương pháp định lượng alkaloid dừa cạn.1 Nguyên lý phương pháp LCMS.2 Ứng dụng của phương pháp LCMS.3 Thiết bi sử dung trong phương pháp LCMS ou. cesecesessceseseesssssceseecseeees 38 CHƯƠNG 4: KET QUA VA BIEN LUAN wu.

cccccsccscscsssssscscsscsssscsssssssscssesssssssssssscessesess 41 AL KẾT Quacccccccccccscsssccscssscsscssescscsctscscsccssvscssssvsccavscsssecscnessvacsesevavscavscavavsaavscneeess 41 4.1 Ảnh hưởng của loại và nông độ auxin lên sự hình thành mô sẹo. 4] IV Luận văn Cao Học 4.1 Sự tạo sẹo trên môi trường có 2,4 — Ì).2 Su tạo seo trên môi trường CO NAA .2 Anh huong cua chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tăng sinh mô sẹo.1 Với auxin là 2,4 - Ï.2 Voi auxin là NA A.3 Kết quả định tính alkaloid từ mô Se .4 Kết qua định lượng vinblastine va định tinh vincristine của mô sẹo có nguồn gốc TỪ MO SEO.--- ---- CC Q0 01900 TH HT cu HT ch cha 56 4.5 Sự hình thành và tăng sinh của huyén phủ té bảo.1 Sự tạo huyền phù tẾ bảO.-- ch 1n HT HH HT ng ro 57 4. Sự tăng sinh của huyén phù tế bảo. - G1 11T TT TH TT TH TT HT HT TH TT TH TH ng gu 62 Đa -adaa.

Vai trò của vật liệu khởi đầu trong sự hình thành mô sẹo. Vai trò cua auxin ngoại sinh lên sự hình thành va tăng sinh của mô sẹo. Ảnh hưởng của mật độ tế bào khởi đầu lên sự tăng sinh của huyền phù tế bào. Vai trò của auxin trong sự tong hợp hợp chất thứ cấp.--- - se se sex sersed 65 CHƯƠNG 5: KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ,.

2 5 <5 5 <5 << x<Ssx e9 cueg cu 67 5.G- SH HT TT TT TH TT TH TT TH TT ng HH nh rkt 67 TÀI LIEU THAM IKHÁOO. Error! Bookmark not defined. Luận văn Cao Học DANH MỤC ANH Trang Ảnh 2.1 Cây và hoa dita cạn.1 Qua va hat của cây dita cạn. c1 TT TT HT TT TT ng HT ng ưyn 25 Ảnh 3.2 Cây dừa cạn trưởng thành cung cấp vật liệu tạo ChOi 177 vi#rO.