## Tổng quan nghiên cứu

Cây đậu tương (Glycine max L.) là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam. Theo báo cáo của ISAAA năm 2014, diện tích cây trồng biến đổi gen đạt khoảng 181,5 triệu ha, trong đó đậu tương chiếm 85% diện tích với hơn 113 triệu ha. Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tương năm 2012 chỉ đạt 120,8 nghìn ha với năng suất 1,45 tấn/ha, sản lượng 175 nghìn tấn, giảm mạnh so với kế hoạch đề ra. Việt Nam phải nhập khẩu khoảng 1,3 triệu tấn đậu tương hạt và 2,97 triệu tấn khô đậu tương năm 2013, gây áp lực lớn lên ngành nông nghiệp.

Từ trường tự nhiên và nhân tạo có ảnh hưởng rõ rệt đến các quá trình sinh học của sinh vật, trong đó có cây trồng và vi khuẩn. Từ trường có thể kích thích hoặc ức chế sự sinh trưởng, phát triển, nảy mầm và quá trình quang hợp của thực vật. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là tác nhân chính trong công nghệ chuyển gen đậu tương, tuy nhiên hiệu quả chuyển gen còn thấp do nhiều yếu tố ảnh hưởng.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng hệ thống từ trường đều và không đều nhằm nâng cao hiệu quả chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của từ trường đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, khả năng tái sinh của đậu tương và hiệu quả chuyển gen. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội trong năm 2015.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Ảnh hưởng của từ trường lên sinh vật:** Từ trường có thể tác động lên màng tế bào, quá trình phân bào, trao đổi chất, biểu hiện gen và hoạt động enzyme, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật và vi sinh vật.
- **Công nghệ chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:** Đây là phương pháp phổ biến để biến đổi gen đậu tương, sử dụng vi khuẩn mang plasmid chứa gen mục tiêu để truyền gen vào mô thực vật.
- **Khái niệm về từ trường đều và không đều:** Từ trường đều có cường độ và hướng đồng nhất trong không gian, trong khi từ trường không đều có sự biến đổi về cường độ và hướng, ảnh hưởng khác nhau đến sinh vật.
- **Khái niệm tái sinh mô thực vật:** Quá trình tạo chồi và rễ từ mô nuôi cấy in vitro, là bước quan trọng trong tạo giống chuyển gen.
- **Gen bar và thuốc trừ cỏ glufosinate:** Gen bar mã hóa enzyme kháng glufosinate, được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc trong quá trình chuyển gen.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** Giống đậu tương ĐT22, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101 mang plasmid pZY101 chứa gen bar.
- **Thiết lập hệ thống từ trường:** Hệ thống từ trường đều với cường độ 220 mT, 240 mT, 250 mT và hệ thống từ trường không đều với cường độ khoảng 0.085T đến 0.14T, đo bằng Tesla meter TM-701.
- **Phương pháp thí nghiệm:** 
  - Đánh giá ảnh hưởng của từ trường lên sự sinh trưởng của vi khuẩn qua đo mật độ quang học OD600.
  - Đánh giá khả năng tái sinh chồi của đậu tương trên môi trường nuôi cấy đặt trong hệ thống từ trường.
  - Thực hiện chuyển gen đậu tương qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đồng nuôi cấy mẫu trong hệ thống từ trường.
  - Chọn lọc cây chuyển gen bằng thuốc glufosinate và đánh giá khả năng kháng thuốc bằng phun thuốc Basta ngoài nhà lưới.
  - Xác định sự có mặt của gen bar bằng kỹ thuật PCR.
- **Cỡ mẫu:** Mỗi thí nghiệm sử dụng từ 180 đến 600 mẫu tùy nội dung.
- **Phân tích số liệu:** Sử dụng phần mềm Excel và SPSS 20 với các phương pháp T-test và ANOVA để so sánh sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm.
- **Thời gian nghiên cứu:** Từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015 tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Ảnh hưởng của từ trường đều lên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:** Cường độ từ trường 220 mT kích thích sự sinh trưởng mạnh nhất với mật độ vi khuẩn đạt OD=1,45 sau 16 giờ, cao hơn đáng kể so với đối chứng và các cường độ 240 mT, 250 mT.
- **Ảnh hưởng của từ trường không đều:** Cường độ 0.14T tại cực Bắc và Nam đều kích thích sinh trưởng vi khuẩn, tuy nhiên cực từ không ảnh hưởng đáng kể. Ở cường độ 0.085T/S, vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn so với đối chứng.
- **Ảnh hưởng của từ trường đều lên khả năng tái sinh đậu tương:** Ở cường độ 220 mT, tỉ lệ tạo đa chồi đạt 90%, cao hơn đáng kể so với đối chứng (77,8%). Các cường độ 240 mT và 250 mT không có sự khác biệt rõ rệt.
- **Ảnh hưởng của từ trường không đều lên tái sinh:** Cường độ 0.085T/S làm tăng tỉ lệ phát sinh đa chồi lên 83,8% so với 74,5% của đối chứng, chiều dài và trọng lượng chồi cũng tăng đáng kể.
- **Hiệu quả chuyển gen:** Ở cường độ từ trường đều 220 mT, tỉ lệ phát sinh đa chồi đạt 90,54%, tỉ lệ sống sót sau chọn lọc 9,7%, cao hơn so với đối chứng (70,35% và 5,71%). Các cường độ 240 mT và 250 mT có hiệu quả thấp hơn.
- **Xác nhận gen bar:** Các cây chuyển gen sống sót sau phun thuốc Basta và được xác định có gen bar bằng PCR, chứng tỏ hiệu quả chuyển gen thành công.

### Thảo luận kết quả

Từ trường đều với cường độ khoảng 220 mT có tác động tích cực rõ rệt đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, khả năng tái sinh chồi và hiệu quả chuyển gen vào đậu tương. Điều này có thể do từ trường kích thích hoạt động trao đổi chất, phân bào và biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn và mô thực vật. Tác động của từ trường không đều cũng có hiệu quả nhưng phức tạp hơn do sự biến đổi cường độ và cực từ.

Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy từ trường có thể tăng tốc độ sinh trưởng, nảy mầm và phát triển của thực vật cũng như vi sinh vật. Việc ứng dụng từ trường trong công nghệ chuyển gen giúp nâng cao hiệu quả biến nạp gen, giảm thời gian và chi phí nghiên cứu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trưởng vi khuẩn theo thời gian, bảng so sánh tỉ lệ tạo đa chồi và hiệu quả chuyển gen giữa các công thức từ trường và đối chứng, giúp minh họa rõ ràng tác động của từ trường.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Xây dựng hệ thống từ trường đều với cường độ 220 mT** để ứng dụng trong quy trình chuyển gen đậu tương, nhằm tăng hiệu quả chuyển gen và tái sinh chồi.
- **Áp dụng xử lý từ trường trong giai đoạn đồng nuôi cấy và tái sinh** để kích thích sinh trưởng vi khuẩn và mô thực vật, nâng cao tỉ lệ thành công.
- **Đào tạo kỹ thuật viên về kỹ thuật sử dụng từ trường và chuyển gen** để đảm bảo quy trình chuẩn và hiệu quả cao.
- **Nghiên cứu mở rộng ứng dụng từ trường với các giống đậu tương khác và cây trồng khác** nhằm đa dạng hóa và nâng cao hiệu quả công nghệ sinh học trong nông nghiệp.
- **Theo dõi và đánh giá lâu dài các cây chuyển gen trong điều kiện thực tế** để đảm bảo tính ổn định và an toàn sinh học.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Nhà nghiên cứu và giảng viên ngành sinh học phân tử, công nghệ sinh học thực vật:** Nắm bắt kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng từ trường trong nghiên cứu.
- **Chuyên gia phát triển giống cây trồng:** Áp dụng công nghệ chuyển gen nâng cao năng suất và chất lượng giống đậu tương.
- **Doanh nghiệp sản xuất giống và công nghệ sinh học:** Tối ưu quy trình sản xuất giống chuyển gen, giảm chi phí và tăng hiệu quả.
- **Sinh viên cao học và nghiên cứu sinh:** Tham khảo phương pháp nghiên cứu, thiết kế thí nghiệm và phân tích dữ liệu trong lĩnh vực công nghệ gen và sinh học thực vật.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Từ trường ảnh hưởng như thế nào đến quá trình chuyển gen?**  
Từ trường kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium và mô thực vật, tăng hiệu quả biến nạp gen và tái sinh chồi, đặc biệt ở cường độ 220 mT.

2. **Có sự khác biệt giữa từ trường đều và không đều không?**  
Từ trường đều có tác động ổn định và hiệu quả hơn trong việc kích thích sinh trưởng và chuyển gen so với từ trường không đều.

3. **Phương pháp chọn lọc cây chuyển gen sử dụng gì?**  
Sử dụng gen bar và thuốc trừ cỏ glufosinate (Basta) để chọn lọc cây chuyển gen kháng thuốc, xác định bằng PCR.

4. **Tại sao cường độ 220 mT hiệu quả hơn các cường độ khác?**  
Cường độ này tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động tế bào, tránh ức chế do từ trường quá mạnh hoặc quá yếu.

5. **Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu này là gì?**  
Nâng cao hiệu quả tạo giống đậu tương chuyển gen, giảm chi phí và thời gian, góp phần phát triển nông nghiệp công nghệ cao.

## Kết luận

- Từ trường đều với cường độ 220 mT kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và khả năng tái sinh chồi đậu tương.  
- Từ trường không đều cũng có ảnh hưởng tích cực nhưng phức tạp hơn và cần nghiên cứu thêm.  
- Hiệu quả chuyển gen đậu tương được cải thiện rõ rệt khi áp dụng từ trường đều 220 mT, với tỉ lệ phát sinh đa chồi và sống sót sau chọn lọc cao hơn đối chứng.  
- Kỹ thuật PCR xác nhận sự có mặt của gen bar trong các cây chuyển gen, chứng minh thành công của phương pháp.  
- Nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng từ trường trong công nghệ chuyển gen, góp phần phát triển giống cây trồng chất lượng cao, thích ứng biến đổi khí hậu.

**Khuyến nghị tiếp theo:** Triển khai ứng dụng quy mô lớn, mở rộng nghiên cứu với các giống và cây trồng khác, đồng thời đào tạo nhân lực kỹ thuật cao trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật.

**Hành động:** Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp nên phối hợp để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất giống chuyển gen, nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Việt Nam.