Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sai khác di truyền của Dendrobium chrysotoxum

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu tạo đột biến in vitro chọn lọc và đánh giá sai khác di truyền của các dòng hoàng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Quỳnh Chi
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Trường Sơn
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo đột biến in vitro, chọn lọc và đánh giá sai khác di truyền của các dòng Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) đột biến.
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)
• 2.2. Vị trí phân bố và phân loại
• 2.3. Đặc điểm hình thái
• 2.4. Đặc điểm sinh thái
• 2.5. Một số thông tin về Lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)
• 2.6. Nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và Việt Nam
• 2.7. Khái quát về xử lý đột biến trong chọn tạo giống cây trồng
• 2.7.1. Khái niệm về đột biến
• 2.7.2. Các tác nhân gây đột biến
• 2.7.3. Cơ sở di truyền của đột biến
• 2.7.4. Chỉ thị phân tử RAPD
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng - vật liệu nghiên cứu
• 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.4.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide sau các lần cấy chuyển
• 3.4.2. Nhân dòng cho các cá thể đột biến sau chọn lọc
• 3.4.3. Đánh giá sự sai khác di truyền của dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 3.5.2. Phương pháp xử lý đột biến
• 3.5.3. Phương pháp tách chiết DNA
• 3.5.4. Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD
• 3.6. Chỉ tiêu theo dõi
• 3.7. Phân tích số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu
• 4.1.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide
• 4.1.2. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
• 4.1.3. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
• 4.1.4. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
• 4.1.5. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân
• 4.1.6. Kết quả tách chiết DNA tổng số
• 4.1.7. Kết quả phân tích RAPD
• 4.2. Kết luận và kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến in vitro Dendrobium chrysotoxum

Nghiên cứu đột biến in vitro của Dendrobium chrysotoxum là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Đột biến in vitro không chỉ giúp tạo ra các giống mới mà còn nâng cao chất lượng cây trồng. Dendrobium chrysotoxum, một loài lan quý, đang được nghiên cứu để cải thiện tính đa dạng di truyền và khả năng thích nghi với môi trường.

1.1. Đặc điểm sinh học của Dendrobium chrysotoxum

Dendrobium chrysotoxum là một loài lan thuộc chi Dendrobium, nổi bật với vẻ đẹp và hương thơm. Loài này có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu Việt Nam, với đặc điểm hình thái và sinh thái đa dạng.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu đột biến in vitro

Nghiên cứu đột biến in vitro giúp tạo ra các giống lan mới với tính kháng bệnh cao hơn. Điều này không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

II. Thách thức trong nghiên cứu đột biến Dendrobium chrysotoxum

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu đột biến Dendrobium chrysotoxum cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như khả năng duy trì biến dị, sự sai khác di truyền và ảnh hưởng của môi trường đến quá trình đột biến cần được giải quyết.

2.1. Khó khăn trong việc duy trì biến dị di truyền

Việc duy trì biến dị di truyền trong các dòng đột biến là một thách thức lớn. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy và phương pháp xử lý hóa chất có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây.

2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến đột biến

Môi trường nuôi cấy có thể tác động mạnh đến sự phát triển của các dòng đột biến. Các yếu tố như ánh sáng, độ ẩm và dinh dưỡng cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến in vitro Dendrobium chrysotoxum

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra đột biến in vitro cho Dendrobium chrysotoxum. Các phương pháp này bao gồm xử lý hóa chất, nuôi cấy mô và phân tích gen.

3.1. Phương pháp xử lý hóa chất

Sodium azide là một trong những hóa chất được sử dụng để tạo đột biến. Nghiên cứu cho thấy nồng độ và thời gian xử lý có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ tạo đột biến.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào giúp tạo ra các dòng cây đồng nhất từ các mô thực vật. Phương pháp này cho phép nhân nhanh các dòng đột biến và duy trì tính di truyền.

3.3. Phân tích di truyền bằng chỉ thị RAPD

Chỉ thị RAPD được sử dụng để phân tích sự sai khác di truyền giữa các dòng đột biến và đối chứng. Phương pháp này giúp xác định các biến thể gen và tính đa dạng di truyền.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của các dòng đột biến Dendrobium chrysotoxum là khả quan. Các dòng đột biến đã được chọn lọc và nhân nhanh in vitro, mở ra hướng đi mới cho ngành nông nghiệp.

4.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các dòng đột biến

Các dòng đột biến cho thấy khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường nuôi cấy. Kết quả cho thấy dòng đột biến 4 có tỷ lệ nhân cao nhất, trong khi dòng 1 và 5 có tỷ lệ thấp hơn.

4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp

Các dòng đột biến Dendrobium chrysotoxum có thể được ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp, đáp ứng nhu cầu thị trường về hoa lan chất lượng cao và đa dạng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến in vitro Dendrobium chrysotoxum đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghệ sinh học. Việc phát triển các giống lan mới không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu đột biến

Nghiên cứu sẽ tiếp tục mở rộng để tìm kiếm các phương pháp mới và hiệu quả hơn trong việc tạo ra các giống lan mới. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị kinh tế cho ngành nông nghiệp.

5.2. Định hướng phát triển bền vững

Định hướng phát triển bền vững trong nghiên cứu và sản xuất hoa lan sẽ giúp bảo tồn nguồn gen và phát triển các giống lan có giá trị cao, đáp ứng nhu cầu của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường hoa lan toàn cầu và trong nước ghi nhận mức tăng trưởng giá trị thương mại trên 12% mỗi năm, trong đó chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) chiếm tỷ trọng lớn nhờ giá trị thẩm mỹ cao cùng tiềm năng dược liệu phong phú. Tại Việt Nam, loài lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum Lindl.) phân bố tự nhiên chủ yếu tại các vùng rừng núi Tây Nguyên, Lâm Đồng, Nghệ An ở độ cao từ 600 m đến 1200 m, được đặc biệt ưa chuộng nhờ sắc hoa vàng óng và hương thơm nhẹ nhàng. Tuy nhiên, nguồn gen bản địa trong tự nhiên đang đứng trước nguy cơ suy giảm mạnh do khai thác quá mức, trong khi các giống hiện có trong sản xuất chưa đa dạng về kiểu hình để đáp ứng trọn vẹn thị hiếu ngày càng khắt khe của người tiêu dùng. Trước thực tế đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại nhằm tạo biến dị di truyền nhân tạo mở ra hướng đi đột phá trong công tác chọn tạo giống mới.

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập trung vào 3 mục tiêu cốt lõi: xác định nồng độ và thời gian xử lý tác nhân sodium azide tối ưu trên thể protocorm; đánh giá khả năng duy trì tính trạng biến dị qua 6 chu kỳ cấy chuyển in vitro liên tiếp; và phân tích mức độ sai khác di truyền của các dòng đột biến chọn lọc. Nghiên cứu đã xác lập thành công quy trình xử lý hóa chất ở nồng độ 0,5 mM trong 30 phút, tạo ra 12 cá thể đột biến hình thái ổn định và tối ưu hóa hệ số nhân chồi đạt 3,14 chồi/mẫu trên môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp. Kết quả này mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống lan quý từ 3 đến 5 năm xuống còn 12 đến 18 tháng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên 2 nền tảng lý thuyết chủ đạo: thuyết đột biến thực nghiệm trong di truyền học thực vật và lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency). Đột biến nhân tạo là quá trình can thiệp có chủ đích nhằm làm biến đổi cấu trúc DNA hoặc nhiễm sắc thể, giúp tăng tần số xuất hiện các biến dị có lợi lên gấp nhiều lần so với tần số đột biến tự nhiên vốn chỉ đạt xấp xỉ 10^-6 ở thực vật bậc cao. Tác nhân hóa học sodium azide (NaN3) hoạt động theo cơ chế ức chế chuỗi vận chuyển điện tử, phong tỏa hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa quan trọng như catalase, peroxidase và cytochrome oxidase, từ đó cản trở quá trình hô hấp tế bào và giảm hiệu quả tự sửa chữa sai hỏng DNA, tạo điều kiện phát sinh các đột biến gen bền vững.

Các khái niệm chuyên ngành then chốt được vận dụng trong nghiên cứu bao gồm:

• Đột biến soma (somatic mutation): Những biến đổi vật chất di truyền xảy ra ở tế bào sinh dưỡng trong điều kiện nuôi cấy mô in vitro, có thể duy trì và nhân rộng ổn định thông qua con đường nhân giống vô tính.
• Thể protocorm và cơ quan tương tự protocorm (PLB): Cấu trúc phôi non hình thành sau khi hạt lan nảy mầm trong ống nghiệm, có khả năng phân chia tế bào mạnh mẽ và là vật liệu tối ưu để xử lý các tác nhân gây đột biến.
• Chỉ thị phân tử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA bằng phản ứng PCR sử dụng các mồi ngắn 10 nucleotide, cho phép đánh giá mức độ đa hình di truyền mà không đòi hỏi thông tin giải trình tự hệ gen trước đó.

Phương pháp nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu chính gồm hệ thống protocorm lan Hoàng thảo Kim Điệp 8 tuần tuổi phát triển từ hạt gieo in vitro và các đoạn thân mang mắt ngủ khỏe mạnh. Quy mô mẫu gồm hàng trăm protocorm được phân bố ngẫu nhiên vào 4 công thức nồng độ sodium azide (0,0 mM; 0,5 mM; 1,0 mM; 2,0 mM) kết hợp 4 khoảng thời gian xử lý khác nhau (0, 30, 60, 120 phút). Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên hoàn toàn có lặp lại được áp dụng nhằm triệt tiêu các sai số hệ thống và đảm bảo tính đại diện cao cho các chỉ tiêu sinh học.

Sau khi xử lý hóa chất trong buồng cấy vô trùng, mẫu được rửa sạch 4 đến 5 lần bằng nước cất vô trùng và cấy chuyển định kỳ 4 tuần một lần qua tổng cộng 6 chu kỳ trên môi trường dinh dưỡng MS cơ bản bổ sung 30 g/l saccarose và 8 g/l agar ở pH 5,75 đến 5,80. Điều kiện nuôi cấy duy trì nghiêm ngặt ở nhiệt độ 25 ± 2 độ C, độ ẩm 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux với chu kỳ quang 16 giờ sáng mỗi ngày. Đối với nội dung nhân dòng, 6 dòng đột biến được tiến hành giâm thân trên môi trường MS bổ sung BA, Kinetin đơn lẻ (3 mg/l) hoặc kết hợp với IBA (0,5 mg/l). Để đánh giá bản chất di truyền, 12 dòng đột biến và 7 dòng đối chứng được tách chiết DNA tổng số bằng kit chuyên dụng, sau đó phân tích PCR với 13 mồi RAPD ngẫu nhiên ở nhiệt độ bắt cặp 34 độ C. Toàn bộ số liệu sinh trưởng được xử lý phương sai ANOVA bằng phần mềm SAS 9.0 và Excel, trong khi dữ liệu phân tử được tính toán ma trận tương đồng di truyền UPGMA và PCA bằng phần mềm NTSYSpc 2.2 nhằm đảm bảo độ chuẩn xác tối đa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nồng độ và thời gian xử lý sodium azide đóng vai trò quyết định đến hiệu suất tạo biến dị. Xử lý protocorm ở nồng độ 0,5 mM trong thời gian 30 phút mang lại tỷ lệ tạo chồi biến dị cao nhất, đạt 21,43% ở lần cấy chuyển thứ 3, vượt trội rõ rệt so với nồng độ 1,0 mM (17,15%), nồng độ 2,0 mM (11,25%) và công thức đối chứng không xử lý (0,00%). Khi thời gian xử lý kéo dài lên 60 phút hoặc 120 phút, độc tính của hóa chất làm giảm mạnh sức sống của mô và hoàn toàn không xuất hiện chồi biến dị.

Thứ hai, tính ổn định của các biến dị hình thái được chứng minh vững chắc qua 6 chu kỳ cấy chuyển liên tiếp kéo dài 24 tuần. Đề tài đã chọn lọc được 12 cá thể đột biến mang các đặc điểm hình thái đặc trưng gồm: cấu trúc phát sinh nhiều chồi trên cùng một nách lá, phiến lá xẻ thùy lệch và xuất hiện các sọc trắng dọc theo gân lá. Tỷ lệ chồi biến dị ở lần cấy chuyển thứ 6 ghi nhận ở mức 6,88% trên tổng số chồi tích lũy, các cá thể biến dị thu nhận đều duy trì hình thái nguyên vẹn mà không xuất hiện hiện tượng phục hồi về kiểu hình ban đầu.

Thứ ba, sự kết hợp giữa Cytokinin và Auxin tạo ưu thế sinh trưởng vượt trội cho các dòng đột biến khi nhân nhanh in vitro. Môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA cho kết quả nhân dòng tốt nhất, trong đó dòng đột biến 4 đạt chiều cao chồi trung bình 1,74 cm, hệ số nhân đạt 3,14 chồi/mẫu và tỷ lệ ra rễ đạt tuyệt đối 100,00% sau 6 tuần nuôi cấy, cao hơn 18,37% về chiều cao chồi so với mẫu đối chứng bình thường (đạt 1,47 cm).

Thứ tư, phân tích đa dạng di truyền bằng 13 mồi RAPD đã chứng minh sự sai khác kiểu gen rõ rệt giữa 12 dòng đột biến so với 7 mẫu đối chứng, khẳng định các thay đổi hình thái quan sát được bắt nguồn từ sự tái cấu trúc vật chất di truyền DNA chứ không phải do tác động sinh lý tạm thời của môi trường nuôi cấy.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả tạo đột biến cao nhất ở nồng độ 0,5 mM trong 30 phút được lý giải bởi liều lượng này nằm trong phạm vi tác động thích hợp, vừa đủ để gây rối loạn các liên kết nucleotide trong chuỗi DNA mà không phá hủy cấu trúc màng tế bào. Khi nồng độ tăng lên 2,0 mM hoặc thời gian tiếp xúc vượt quá 60 phút, tác dụng ức chế hô hấp của sodium azide diễn ra quá mạnh mẽ, dẫn đến tình trạng suy thoái mô và làm giảm tỷ lệ sống sót của thể protocorm. Hiện tượng này hoàn toàn nhất quán với các báo cáo khoa học gần đây về xử lý đột biến hóa học trên các loài hoa phong lan nhiệt đới.

Trong quá trình nhân nhanh, việc bổ sung Kinetin đơn lẻ mang lại hiệu quả rất thấp khi chiều cao chồi chỉ đạt từ 0,79 cm đến 1,14 cm. Ngược lại, sự phối hợp giữa BA và IBA đã kích hoạt cơ chế tương tác hiệp đồng giữa phân chia tế bào chồi và cảm ứng phân hóa rễ. Dữ liệu thực nghiệm này có thể được biểu diễn trực quan thông qua biểu đồ cột so sánh tốc độ tăng trưởng chiều cao chồi giữa các công thức hormone, kết hợp cùng sơ đồ hình cây dendrogram UPGMA thể hiện khoảng cách di truyền phân tử. Qua đó, người nghiên cứu có thể dễ dàng nhận thấy dòng đột biến 4 tách thành một nhánh di truyền độc lập với hệ số tương đồng di truyền sai khác đáng kể so với quần thể đối chứng ban đầu.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình xử lý đột biến in vitro bằng sodium azide cho các loài lan Hoàng thảo. Các cơ sở nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật cần áp dụng thông số kỹ thuật chuẩn gồm nồng độ 0,5 mM sodium azide với thời gian xử lý 30 phút trên thể protocorm 8 tuần tuổi, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ cảm ứng đột biến ổn định trên 15% trong vòng 6 tháng thực nghiệm.

Thứ hai, tối ưu hóa công thức môi trường nhân dòng thương mại cho các cá thể đột biến. Các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô cần sử dụng môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l IBA cho giai đoạn nhân nhanh đoạn thân mang mắt ngủ, nhằm thiết lập mục tiêu đạt hệ số nhân chồi trên 3,0 chồi/mẫu và tỷ lệ ra rễ đạt 100% trong khung thời gian 6 đến 8 tuần cho mỗi chu kỳ nuôi cấy.

Thứ ba, mở rộng hệ thống đánh giá di truyền ở cấp độ phân tử chuyên sâu. Đội ngũ nghiên cứu di truyền cần tích hợp chỉ thị RAPD với các chỉ thị phân tử có độ lặp lại cao hơn như SSR, ISSR hoặc công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), hoàn thành việc lập bản đồ sai khác cấu trúc genome chi tiết cho 12 dòng đột biến trong thời gian 12 tháng tới.

Thứ tư, đẩy mạnh công tác thuần hóa và khảo nghiệm tính trạng ngoài vườn ươm. Các doanh nghiệp sản xuất giống hoa phối hợp cùng viện nghiên cứu triển khai đưa dòng đột biến 4 ra nhà màng, theo dõi chỉ tiêu ra hoa, màu sắc cánh hoa, độ bền hoa và khả năng chống chịu sâu bệnh trong thời gian từ 18 đến 24 tháng trước khi đưa vào sản xuất thương phẩm đại trà.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Cán bộ nghiên cứu và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp nguồn tài liệu thực nghiệm giá trị về phương pháp xử lý đột biến hóa học bằng sodium azide, kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro và quy trình phân tích sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD trên cây hoa cảnh bản địa.
• Kỹ thuật viên tại các trung tâm nhân giống cây trồng: Công trình đưa ra công thức môi trường dinh dưỡng khoáng và tỷ lệ chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA chi tiết, giúp tối ưu hóa hệ số nhân chồi và nâng tỷ lệ tạo rễ đạt 100% trong sản xuất giống lan Hoàng thảo in vitro.
• Doanh nghiệp và chủ trang trại kinh doanh hoa lan cao cấp: Tài liệu mang lại định hướng thương mại rõ ràng về việc khai thác các dòng đột biến mang tính trạng độc đáo như phân cành nhiều, lá sọc biến dị để tạo ra các dòng sản phẩm hoa chậu độc quyền có giá trị kinh tế vượt trội trên thị trường.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Sinh học: Luận văn là một case study khoa học chuẩn mực, phục vụ trực tiếp cho công tác giảng dạy các môn học Chọn tạo giống thực vật, Nuôi cấy mô tế bào và Di truyền học ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao nồng độ sodium azide 0,5 mM lại cho hiệu quả đột biến cao nhất trên lan Hoàng thảo Kim Điệp? Nồng độ 0,5 mM trong 30 phút đem lại tỷ lệ chồi biến dị cao nhất đạt 21,43% vì tạo ra mức độ tác động vừa đủ làm biến đổi cấu trúc DNA mà không gây độc tế bào nghiêm trọng. Khi tăng nồng độ lên 2,0 mM, độc tính hóa chất ức chế mạnh chuỗi hô hấp tế bào, khiến tỷ lệ biến dị suy giảm xuống còn 11,25%.

• Làm thế nào để khẳng định biến dị thu được là đột biến di truyền thực sự chứ không phải biến dị sinh lý? Tính chất di truyền được xác định nhờ sự duy trì ổn định của kiểu hình lá sọc, lá xẻ thùy và nhiều chồi qua 6 chu kỳ cấy chuyển liên tiếp trong 24 tuần mà không bị thoái hóa. Đồng thời, kết quả điện di 13 mồi RAPD đã chứng minh sự sai khác rõ ràng về cấu trúc DNA giữa các dòng đột biến và mẫu đối chứng.

• Vì sao tổ hợp BA và IBA lại vượt trội hơn hẳn so với việc sử dụng Kinetin đơn lẻ trong nhân dòng? Tổ hợp 3 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA tạo ra sự cân bằng hoàn hảo giữa Cytokinin và Auxin, kích thích dòng đột biến 4 đạt chiều cao 1,74 cm và hệ số nhân 3,14 chồi/mẫu. Trong khi đó, Kinetin đơn lẻ phản ứng rất kém trên mô thân lan Hoàng thảo Kim Điệp, khiến chồi chỉ đạt chiều cao từ 0,79 cm đến 1,14 cm.

• Dòng đột biến số 4 có những đặc tính sinh trưởng nổi bật nào so với các dòng còn lại? Dòng đột biến 4 thể hiện sức sống vượt bậc trên môi trường dinh dưỡng tối ưu với hệ số nhân chồi đạt 3,14 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 1,74 cm, tỷ lệ ra rễ đạt 100,00% sau 6 tuần nuôi cấy, đồng thời biểu hiện cấu trúc phân cành dày đặc và vị trí phân dị rõ nét trên biểu đồ phân tích thành phần chính PCA.

• Kỹ thuật chỉ thị phân tử RAPD có ưu điểm và hạn chế gì khi đánh giá cây trồng đột biến in vitro? Chỉ thị RAPD có ưu thế nổi bật là thao tác đơn giản, chi phí thực hiện thấp, lượng mẫu DNA yêu cầu rất ít và không cần biết trước trình tự gen của cây lan. Dẫu vậy, phương pháp này đòi hỏi sự kiểm soát cực kỳ chuẩn xác về nhiệt độ bắt cặp mồi 34 độ C để đảm bảo tính lặp lại ổn định của sản phẩm PCR.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác lập thành công quy trình tạo đột biến in vitro hiệu quả trên protocorm lan Hoàng thảo Kim Điệp bằng sodium azide nồng độ 0,5 mM trong thời gian 30 phút.
• Sàng lọc và duy trì ổn định 12 cá thể đột biến hình thái độc đáo qua 6 chu kỳ cấy chuyển in vitro kéo dài 24 tuần mà không xảy ra hiện tượng phục hồi kiểu hình gốc.
• Xác định môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA là công thức tối ưu giúp dòng đột biến 4 đạt hệ số nhân 3,14 chồi/mẫu và tỷ lệ ra rễ đạt 100,00%.
• Khẳng định sự sai khác bản chất di truyền ở mức độ phân tử của các cá thể đột biến so với cây đối chứng thông qua 13 mồi chỉ thị ngẫu nhiên RAPD.
• Đóng góp quy trình kỹ thuật toàn diện từ khâu xử lý hóa chất, chọn lọc biến dị đến nhân nhanh vô tính, mở ra tiềm năng lớn cho công tác phát triển giống lan Hoàng thảo Kim Điệp thương phẩm.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu cần tiếp tục đưa các dòng đột biến ưu tú ra vườn ươm để đánh giá tính trạng nở hoa và độ bền di truyền ngoài đồng ruộng. Quý độc giả, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm có thể ứng dụng ngay các thông số kỹ thuật từ luận văn để nâng cao hiệu quả chọn tạo và nhân giống hoa lan chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN QUỲNH CHI NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO, CHỌN LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG HOÀNG THẢO KIM ĐIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) ĐỘT BIẾN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Đinh Trường Sơn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được dùng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin được trích dẫn trong khóa luận đều được chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn.

Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Chi i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, được sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm cùng sự cố gắng, nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn của mình. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kỹ năng vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Trường Sơn đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Thu Hằng, cán bộ tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các phòng, ban của khoa Công nghệ Sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, rèn luyện cũng như thực hiện đề tài. Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình cùng những người thân đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Chi ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục bảng. vi Danh mục hình.

vii Danh mục chữ viết tắt. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tổng quan tài liệu.

Giới thiệu chung về chi lan hoàng thảo (Dendrobium). Vị trí phân bố và phân loại. Đặc điểm hình thái. Đặc điểm sinh thái.

Một số thông tin về Lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum). Nghiên cứu nhân giống lan hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và Việt Nam. Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo (Dendrobium) trên thế giới. Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam.

Khái quát về xử lý đột biến trong chọn tạo giống cây trồng. Khái niệm về đột biến. Các tác nhân gây đột biến. Cơ sở di truyền của đột biến.

Chỉ thị phân tử rapd. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. 14 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Địa điểm nghiên cứu.

Thời gian nghiên cứu. Đối tượng - vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide sau các lần cấy chuyển. Nhân dòng cho các cá thể đột biến sau chọn lọc. Đánh giá sự sai khác di truyền của dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Phương pháp xử lý đột biến. Phương pháp tách chiết DNA.

Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD. Chỉ tiêu theo dõi. Phân tích số liệu. Kết quả và thảo luận.

Kết quả nghiên cứu. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide. Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA của 6 dòng dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân.

Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l kinetine + 0.5 mg/l IBA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân. 36 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Kết quả tách chiết DNA tổng số. Kết quả phân tích RAPD. Kết luận và kiến nghị. 45 Tài liệu tham khảo.

49 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Danh sách và trình tự các mồi. Thành phần phản ứng PCR. Đánh giá sinh trưởng và khả năng duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 3 (sau 4 tuần).

Đánh giá sinh trưởng và khả năng duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 4 (sau 4 tuần). Đánh giá sinh trưởng và khả năng duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 5 (sau 4 tuần). Đánh giá sinh trưởng và khả năng duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 6 (sau 4 tuần). Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 3 (sau 4 tuần).

Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 4 (sau 4 tuần). Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 5 (sau 4 tuần). Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi ở lần cấy chuyển thứ 6 (sau 4 tuần). Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l BA (sau 6 tuần).

Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin (sau 6 tuần). Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0. Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin + 0. Kết quả sử dụng 13 mồi RAPD.

Hệ số tương đồng di truyền của 12 dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dòng đối chứng. 39 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cơ chế tác động và tạo đột biến gen của sodium azide. Sinh trưởng của chồi ở lần cấy chuyển thứ 3.

Sinh trưởng của cây ở lần cấy chuyển thứ 4. Sinh trưởng của cây ở lần cấy chuyển thứ 5. Sinh trưởng của cây ở lần cấy chuyển thứ 6. Sinh trưởng của chồi ở lần cấy chuyển thứ 3.

Sinh trưởng của cây ở lần cấy chuyển thứ 4. Sinh trưởng của chồi ở lần cấy chuyển thứ 5. Sinh trưởng của chồi ở lần cấy chuyển thứ 6. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh các dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân trên môi trường MS + 3 mg/l BA.

Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin. Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0. Sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến giả định trên môi trường MS + 3 mg/l kinetin + 0. Kết quả điện di DNA tổng số 12 dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dòng đối chứng.

Sơ đồ hình cây biểu hiện mối tương quan về di truyền của 12 dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến và 7 dòng đối chứng. Phân tích thành phần chính của 12 dòng đột biến và nhóm đối chứng. 41 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA 6 - Benzylaminopurine CT Công thức CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide ĐC Đối chứng IBA Indol butyric acid MS Murashige and Skoog NAA Naphthalene acetic acid PCR Polymerase chain reaction PLB Protocorm Like Bodies TCS Thin cross section RAPD Random Amplified Polymorphic DNA viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Quỳnh Chi Tên luận văn: Nghiên cứu tạo đột biến in vitro, chọn lọc và đánh giá sai khác di truyền của các dòng Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) đột biến. Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định được kỹ thuật xử lý tạo đột biến phù hợp, đánh giá khả năng duy trì biến dị trong giai đoạn nuôi cấy in vitro.

- Nghiên cứu nhân nhanh, tạo dòng cho các cá thể đột biến chọn lọc được. - Đánh giá sự sai khác di truyền của dòng Hoàng thảo Kim Điệp đột biến. Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide sau các lần cấy chuyển - Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide với các nồng độ khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6. - Đánh giá khả năng sinh trưởng và duy trì biến dị của chồi sau xử lý với sodium azide tại các thời gian khác nhau ở lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, 6.

Nội dung 2: Nhân dòng cho các cá thể đột biến sau chọn lọc - Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro trên môi trường MS + 3 mg/l BA của 6 dòng đột biến giả định bằng phương pháp giâm thân.