Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học của tác giả Trần Anh Phương (Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, năm 2021, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Duy) tập trung vào đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RAPD-PCR đánh giá đa dạng di truyền của cam Bố Hạ với các dòng cây có múi".

Theo thống kê của Niên giám thống kê năm 2019, diện tích trồng cây có múi tại Việt Nam đạt khoảng 210.000 ha, trong đó diện tích cam chiếm khoảng 120.000 ha với sản lượng đạt trên 1 triệu tấn. Tại miền Bắc Việt Nam, cam Bố Hạ (có nguồn gốc từ huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang) là một giống cây ăn quả đặc sản nổi tiếng, thường chín rộ vào tháng 11 - 12 âm lịch phục vụ dịp Tết Nguyên đán. Quả cam Bố Hạ có đặc điểm cùi dày, da hơi sần, lòng vàng đỏ, tép mọng nước, vị ngọt đậm và khối lượng trung bình từ 100 g đến trên 250 g. Tuy nhiên, trước tác động của dịch bệnh tàn phá cùng sự thay đổi cơ cấu cây trồng, vùng cam Bố Hạ đang đối mặt với nguy cơ suy thoái và mai một nguồn gen bản địa. Nhằm phục vụ công tác bảo tồn, tuyển chọn và phục tráng giống, việc đánh giá chính xác các đặc điểm hình thái học và mức độ đa dạng di truyền ở mức độ phân tử giữa các cá thể cam Bố Hạ còn sót lại với các giống cây có múi phổ biến là nhiệm vụ cấp thiết.

Mục tiêu của đề tài:

  • Mục tiêu tổng quát: Xác định được mối quan hệ di truyền giữa một số giống cam, quýt khác nhau bằng phương pháp chỉ thị phân tử.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Tách chiết được DNA tổng số từ cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD, ISSR.
    2. Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD, ISSR.
    3. Phân tích được mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa trên sơ đồ phả hệ DNA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 20 mẫu dòng/giống cây có múi thuộc chi Citrus gồm các nhóm cam chanh Bố Hạ (CBH1, CBH51/CBH5), cam sành Bố Hạ (CS1, CS4, CS5), các dòng cam sành Hàm Yên (SO1-5, SO16-2, SO19-2, SO1-6, SO32-2, C36, MVL5-2), cam sành Hưng Yên (HY), cam Xã Đoài Cao Phong (XĐCP), cam Xã Đoài Nghệ An (XĐNA), cam chanh Chín Sớm (CHS), cam chanh Chín Muộn (CMV), quýt Cam canh (CC), quýt Ôn Châu (OC) và quýt Ngọt (QN).
  • Phạm vi và địa điểm thực hiện: Các mẫu được thu thập tại Vườn sản xuất và Vườn bảo tồn các dòng cam thuộc Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên; các thí nghiệm phân tích hình thái và sinh học phân tử được triển khai tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên vào năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên khung lý thuyết phân loại thực vật học chi Citrus (họ Rutaceae, phân họ Aurantoideae) theo hệ thống phân loại của Swingle (1915, 1948, 1967) và tài liệu của GS.TS. Trần Thế Tục. Về mặt sinh học phân tử, nghiên cứu sử dụng nguyên lý phát hiện đa hình DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase với các đoạn mồi ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA) và các đoạn trình tự lặp lại đơn giản nội tại (ISSR - Inter Simple Sequence Repeat).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

  1. Phương pháp đánh giá hình thái thực vật: Đánh giá các chỉ tiêu hình thái lá (chiều dài, chiều rộng, kích thước eo lá của 5 lá/cây), hình thái hoa (số cánh hoa, chiều dài cánh, số chỉ nhị, chiều dài chỉ nhị, số nhụy, chiều dài nhụy của 5 hoa/dòng), hình thái quả và hạt (khối lượng quả, đường kính, chiều cao, khối lượng thịt ăn được, số múi, tổng số hạt, số hạt mẩy, số hạt lép) và chỉ tiêu phôi hạt (phân loại hạt đơn phôi, hạt đa phôi, đếm số phôi/hạt sau khi bóc tách lớp vỏ cứng và vỏ lụa).
  2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Ứng dụng quy trình của Doyle & Doyle (1987) có cải tiến cho mô lá cây có múi: nghiền 0,5 g lá tươi trong 1 ml Lysis buffer, ủ ấm 65°C trong 60 phút (đảo trộn định kỳ 10 phút/lần bằng máy Vortex), chiết tách tạp chất bằng dung dịch CIAA (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol tỉ lệ 25:24:1), kết tủa DNA bằng Isopropanol lạnh và Sodium acetate ở -20°C, rửa tủa bằng Ethanol 70% và hòa tan lại trong 200 µl đệm TE 1X.
  3. Kỹ thuật điện di và phản ứng PCR:
    • Kiểm tra chất lượng DNA tổng số trên gel Agarose 1,0% trong đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium bromide, soi trên máy UVP Gel Logic 1500 (Kodak).
    • Phản ứng PCR thực hiện với thể tích 25 µl chứa: 5,0 µl PCR Buffer 5X, 1,5 µl MgCl2, 3,0 µl dNTPs, 3,0 µl Primer (nồng độ 10 µM), 0,2 µl GoTaq DNA Polymerase, 2,0 µl DNA khuôn và 10,3 µl H2O.
    • Chu trình nhiệt trên máy Mastercycler X50s (Eppendorf): Biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; 40 chu kỳ khuếch đại (95°C trong 1 phút, gắn mồi 35°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 2 phút); kéo dài kết thúc 72°C trong 5 phút; giữ mẫu ở 10°C.
    • Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra trên gel Agarose 2,0%.
  4. Phương pháp xử lý số liệu và phân tích đa dạng di truyền: Ghi nhận dữ liệu băng điện di dưới dạng ma trận nhị phân (1: xuất hiện băng, 0: không xuất hiện băng). Phân tích hệ số tương đồng di truyền và dựng sơ đồ cây phân loại (dendrogram) bằng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc phiên bản 2.0.

Hóa chất và vật liệu sinh học: Sử dụng 10 mồi RAPD ngẫu nhiên (OPA-04, OPA-08, OPB-18, OPC-08, OPG-16, OPG-17, OPQ-18, OPM-13, OPO-04, OPT-01) thiết kế theo nghiên cứu của Oliveira et al. (2010) sản xuất tại Hàn Quốc và 3 mồi ISSR (ISSR-T1, ISSR-T2, ISSR-T3). Các hóa chất tinh khiết của Merck và Promega.


Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của việc nghiên cứu, cơ sở thực tiễn của giống cam Bố Hạ tại Bắc Giang, mục tiêu tổng quát, 3 mục tiêu cụ thể, ý nghĩa khoa học trong việc bổ sung cơ sở dữ liệu phân tử cho chi Citrus tại Việt Nam và ý nghĩa thực tiễn đối với công tác bảo tồn nguồn gen quý.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa nguồn gốc địa lý và phân loại thực vật học của cây cam quýt; phân tích giá trị dinh dưỡng, kinh tế, dược liệu và sinh thái. Tác giả tổng thuật số liệu sản xuất cam quýt thế giới và Việt Nam giai đoạn 2015-2019 (sản lượng trong nước tăng từ 727,4 nghìn tấn năm 2015 lên trên 1 triệu tấn năm 2019). Chương này cũng phân tích nguyên lý, ưu - nhược điểm của các chỉ thị phân tử RAPD, ISSR, AFLP, SSLP, SSR, RFLP và điểm luận các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước và quốc tế trên các đối tượng cây trồng (Salvia, Lilium, chè Tân Cương, đậu xanh, cam sành Hà Giang, sâm Lai Châu).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết 20 mẫu vật liệu nghiên cứu kèm ký hiệu; danh mục trình tự nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) của 13 đoạn mồi; danh mục thiết bị, hóa chất; thiết kế 3 nội dung nghiên cứu; chi tiết các bước thực nghiệm đánh giá hình thái lá, hoa, quả, hạt đa phôi, quy trình tách chiết DNA tổng số gồm 12 bước, thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt độ.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu

Trình bày toàn bộ số liệu thu thập được qua các bảng biểu và hình ảnh điện di:

  • Đặc điểm hình thái: Kích thước phiến lá dao động từ 8,1 - 11,9 cm chiều dài và 3,1 - 5,4 cm chiều rộng. Hoa có 5 cánh trắng ngà, 1 nhụy, số chỉ nhị dao động từ 19,16 đến 27,1 chỉ nhị/hoa. Quả cam chanh Bố Hạ đạt khối lượng cao nhất (258,5 g), vỏ nhẵn, 10 múi, 26 hạt; cam sành Hàm Yên đạt 220,65 g, 12 múi, 15 hạt; cam sành Bố Hạ CS5 đạt 123,0 g, 13 múi, 30 hạt. Tỷ lệ hạt đa phôi đạt 17,5 hạt/quả ở cam chanh CBH và 13,6 hạt/quả ở cam Hàm Yên; số phôi trung bình/hạt đa phôi của cam chanh Bố Hạ đạt cao nhất (3,7 phôi/hạt).
  • Kết quả tách chiết DNA: 20 mẫu đều thu được DNA tổng số rõ nét, không đứt gãy trên gel 1,0%.
  • Kết quả phân tích PCR: Mồi OPM-13 hoàn toàn không nhân bản được đoạn DNA nào. 9 mồi RAPD còn lại và 3 mồi ISSR cho các phân đoạn đa hình kích thước từ 100 bp đến 1000 bp (mồi OPG-17 và ISSR-T1 khuếch đại thành công trên 19/20 mẫu; ISSR-T3 trên 15 mẫu; OPA-04 trên 16 mẫu; OPA-08 và OPG-16 trên 12 mẫu; ISSR-T2 trên 9 mẫu; OPC-08 và OPQ-18 trên 8 mẫu; OPO-04 trên 6 mẫu; OPT-01 và OPB-18 trên 2 mẫu).
  • Quan hệ di truyền: Sơ đồ cây NTSYSpc 2.0 phân chia 20 mẫu thành 2 nhóm lớn rõ rệt (Nhóm I gồm 9 mẫu, Nhóm II gồm 11 mẫu).

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết quả đạt được về đặc trưng hình thái học, hiệu quả của 12/13 mồi chỉ thị phân tử và cấu trúc phân nhóm phát sinh chủng loại của cam Bố Hạ đối với tập đoàn cây có múi nghiên cứu.


Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã cung cấp hệ thống số liệu định lượng chi tiết về hình thái và hệ số phân tử của 20 mẫu nghiên cứu:

Tên dòng/giống Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) Số chỉ nhị trung bình Khối lượng quả (g) Khối lượng thịt (g) Số múi Số hạt/quả Số phôi TB/hạt đa phôi
Cam chanh Bố Hạ (CBH) 10,8 4,9 22,82 258,50 190,41 10 26 (20 mẩy, 6 lép) 3,7
Cam sành Bố Hạ 1 (CS1) 8,4 4,5 19,30 92,91 62,99 12 26 (15 mẩy, 11 lép) 3,1
Cam sành Bố Hạ 5 (CS5) 8,8 4,1 19,31 123,00 102,50 13 30 (12 mẩy, 18 lép) 2,9
Cam sành Hàm Yên (SO) 11,2 5,1 23,50 220,65 117,01 12 15 (14 mẩy, 1 lép) 3,4
Cam Xã Đoài 9,9 - 10,4 4,3 - 4,4 27,10 - - - - -

Bảng tổng hợp đặc tính khuếch đại của các mồi chỉ thị phân tử:

STT Tên mồi Loại chỉ thị Trình tự mồi (5' - 3') Giá trị Tm (°C) Số mẫu khuếch đại (trên 20 mẫu) Kích thước phân đoạn DNA (bp)
1 OPA-04 RAPD AATCGGGCTG 33 16 200 - 750
2 OPA-08 RAPD GTGACGTAGG 29 12 100 - 500
3 OPB-18 RAPD CCACAGCAGT 32 2 120 - 200
4 OPC-08 RAPD TGGACCGGTG 36 8 150 - 750
5 OPG-16 RAPD AGCGTCCTCC 36 12 270 - 600
6 OPG-17 RAPD ACGACCGAGA 34 19 300 - 1000
7 OPQ-18 RAPD GGGCCACTCA 36 8 150 - 800
8 OPM-13 RAPD GGTGGTCAAG 29 0 Không khuếch đại
9 OPO-04 RAPD AAGTCCGCTC 32 6 300 - 1000
10 OPT-01 RAPD GGGCCACTCA 36 2 200 - 350
11 ISSR-T1 ISSR GTGTGTGTGTGTCC 45 19 180 - 1000
12 ISSR-T2 ISSR CTCTCTCTCTCTTG 38 9 400
13 ISSR-T3 ISSR ACACACACACACCG 48 15 350 - 1000

Phân nhóm di truyền dựa trên sơ đồ cây phả hệ (Dendrogram):

  • Nhóm I (9 mẫu): Gồm 2 nhóm phụ. Nhóm phụ I gồm Cụm 1 (XĐCP, CBH1, CBH5) và Cụm 2 (XĐNA). Nhóm phụ II gồm Cụm 3 (CMV) và Cụm 4 (CC, OC, CHS, QN). Kết quả chứng minh cam chanh Bố Hạ (CBH1, CBH5) có quan hệ di truyền rất gần gũi với giống cam Xã Đoài (XĐCP, XĐNA).
  • Nhóm II (11 mẫu): Gồm 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 3 có mẫu cam sành Hưng Yên (HY). Nhóm phụ 4 gồm Cụm 5 và Cụm 6 (MVL). Trong đó Cụm 5a gồm các mẫu C36, SO1, SO16, SO19 cùng với toàn bộ các mẫu cam sành Bố Hạ (CS1, CS4, CS5). Điều này khẳng định các dòng cam sành Bố Hạ có tính đồng nhất di truyền cao và có quan hệ họ hàng gần gũi với nhóm cam sành Hàm Yên.

Đóng góp của đề tài:

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm khẳng định sự phân ly di truyền rõ rệt giữa hai dòng mang tên "cam Bố Hạ" (dòng cam chanh thuộc nhóm quan hệ gần với cam Xã Đoài; dòng cam sành thuộc nhóm quan hệ gần với cam sành Hàm Yên).
  • Thiết lập bộ thông số kỹ thuật tối ưu cho quy trình PCR-RAPD và PCR-ISSR đối với nguồn gen cây có múi bản địa, phục vụ việc phân loại và lưu giữ nguồn gen chuẩn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu mới khảo sát 13 đoạn mồi, trong đó mồi OPM-13 không hoạt động và một số mồi có số lượng băng thấp (OPT-01, OPB-18); kỹ thuật RAPD vốn có nhược điểm về độ ổn định và tính lặp lại phụ thuộc điều kiện phòng thí nghiệm; các mẫu nghiên cứu thu thập chủ yếu trong phạm vi các vườn bảo tồn và thực nghiệm tại trường đại học, chưa mở rộng ra toàn bộ các cá thể ngoài quần thể tự nhiên tại vùng địa lý Bố Hạ cũ.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng số lượng chỉ thị phân tử có độ lặp lại và tính đồng trội cao hơn (như SSR, AFLP hoặc SNP); khảo sát thêm các mẫu cây bố mẹ và các dòng đột biến tại địa bàn tỉnh Bắc Giang nhằm hỗ trợ chương trình nhân giống invitro sạch bệnh và phục tráng thương hiệu cam Bố Hạ.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Khoa học cây trồng, Di truyền và Chọn giống thực vật; các cán bộ tại các Trung tâm Giống cây trồng nông lâm nghiệp và cơ quan bảo tồn quỹ gen thực vật.
  • Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
    • Quy trình chiết tách DNA tổng số 12 bước cải tiến từ Doyle & Doyle xử lý hiệu quả mô lá giàu hợp chất thứ sinh và tinh dầu của cây có múi.
    • Bộ số liệu hình thái học chi tiết và trình tự các đoạn mồi PCR-RAPD/ISSR có khả năng nhân bản phân đoạn đa hình rõ nét phục vụ đánh giá nguồn gen thực vật chi Citrus.

Câu hỏi thường gặp

1. Phản ứng RAPD-PCR trong nghiên cứu này sử dụng thành phần và chu trình nhiệt như thế nào?

Phản ứng được thực hiện trong tổng thể tích 25 µl (gồm 5,0 µl đệm 5X; 1,5 µl MgCl2; 3,0 µl dNTPs; 3,0 µl mồi 10 µM; 0,2 µl Taq polymerase; 2,0 µl DNA khuôn; 10,3 µl H2O). Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 40 chu kỳ lặp lại (biến tính 95°C trong 1 phút, gắn mồi 35°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 2 phút); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 5 phút và giữ ở 10°C.

2. Mồi nào trong số các mồi khảo sát không khuếch đại được phân đoạn DNA?

Mồi RAPD ký hiệu OPM-13 (trình tự 5'-GGTGGTCAAG-3', nhiệt độ Tm = 29°C) hoàn toàn không khuếch đại được phân đoạn DNA nào trên cả 20 mẫu nghiên cứu, do đó không được sử dụng để phân tích đa hình di truyền.

3. Sự khác biệt về hình thái quả giữa cam sành Bố Hạ và cam chanh Bố Hạ là gì?

Cam sành Bố Hạ có quả hình cầu dẹt, túi tinh dầu thô hiện rõ, đỉnh và đáy quả bằng hoặc hơi lõm, vỏ chín màu vàng thẫm sáng giòn, thịt quả màu vàng đậm, khối lượng trung bình từ 92,91 g (CS1) đến 123,0 g (CS5). Cam chanh Bố Hạ có quả hình cầu hơi tròn, túi tinh dầu chìm nên vỏ nhẵn hơn, thịt quả màu vàng sáng, có mùi thơm đặc trưng, khối lượng quả lớn hơn rõ rệt (trung bình đạt 258,5 g).

4. Kết quả sơ đồ cây phả hệ phản ánh mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ như thế nào?

Cam Bố Hạ phân lập thành hai nhóm di truyền riêng biệt: Dòng cam chanh Bố Hạ (CBH1, CBH5) nằm ở Nhóm I và có quan hệ di truyền gần nhất với cam Xã Đoài (Cao Phong và Nghệ An). Các dòng cam sành Bố Hạ (CS1, CS4, CS5) nằm ở Nhóm II, có tính đồng nhất di truyền nội bộ cao và có quan hệ họ hàng gần gũi với nhóm cam sành Hàm Yên.


Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Anh Phương đã mô tả chi tiết các đặc trưng hình thái lá, hoa, quả, hạt và phân tích thành công tính đa hình di truyền của 20 mẫu cây có múi bằng 12 chỉ thị phân tử RAPD và ISSR. Kết quả phân tích phả hệ bằng phần mềm NTSYSpc 2.0 đã chỉ rõ cam chanh Bố Hạ có quan hệ di truyền gần với cam Xã Đoài, trong khi các dòng cam sành Bố Hạ đồng nhất về mặt di truyền và có họ hàng gần với cam sành Hàm Yên. Công trình là tài liệu thực nghiệm quan trọng, cung cấp cơ sở khoa học tin cậy phục vụ công tác giám định, bảo tồn và khai thác phát triển nguồn gen cam Bố Hạ tại Việt Nam.