Tổng quan luận án

Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn Tác giả: Lê Quốc Việt Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi (Mã số: 9.64.01.02) Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS. Đinh Thị Bích Lân; PGS. Bùi Trần Anh Đào Năm: 2019

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S. suis) gây ra xảy ra ở hầu hết các loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ thể chính. Căn cứ vào đặc điểm polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, S. suis được phân thành 35 type huyết thanh, trong đó S. suis type 2 là type thường gây bệnh ở cả người và động vật.

Trên thế giới, đã ghi nhận khoảng 490 ca bệnh liên cầu lợn ở người, tỷ lệ tử vong là 17,5%. Vi khuẩn gây ra hai thể bệnh nguy hiểm là viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết; nếu không phát hiện và điều trị kịp thời, bệnh nhân có thể tử vong hoặc để lại di chứng nặng như điếc hoàn toàn. Thời gian ủ bệnh ngắn, từ vài giờ đến 3 ngày. Nguy cơ lây nhiễm tập trung ở những người tiếp xúc trực tiếp với lợn, sản phẩm từ lợn chưa qua chế biến kỹ, bao gồm thợ giết mổ, công nhân lò mổ và người tiêu dùng ăn tiết canh lợn.

Tác giả chỉ ra rằng tại Việt Nam, các phương pháp chẩn đoán hiện hành chủ yếu là nhuộm gram, phân lập vi khuẩn và PCR — đều đòi hỏi phòng thí nghiệm, thiết bị chuyên dụng và kỹ thuật viên có trình độ. Mặc dù trên thế giới đã có nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh S. suis type 2 (Ju et al., 2010; Yang et al., 2007), và tại Việt Nam đã có các nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh cho một số bệnh khác (Đinh Thị Bích Lân và cs., 2009; Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2015), chưa có tác giả nào trong nước nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2. Đây là khoảng trống trực tiếp mà luận án lựa chọn giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn.

Các nội dung nghiên cứu cụ thể gồm:

  1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2.
  2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2.
  3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suis type 2.
  4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng: Lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis type 2 phân lập từ mẫu dịch mũi lợn.
  • Phạm vi không gian: Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế (lò mổ Bạch Yến, Bãi Dâu, Xuân Phú); Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Phòng thí nghiệm Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại

Nghiên cứu dịch tễ và phân lập vi khuẩn:

  • Windsor and Elliott (1975) đề nghị gọi type huyết thanh R của Moor là Streptococcus suis type 2.
  • Vecht et al. (1985) xác định S. suis lưu hành tại Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan, Trung Quốc và nghiên cứu các phương thức lan truyền vi khuẩn giữa các đàn lợn.
  • Higgins and Gottschalk (2001) ghi nhận tỷ lệ phân lập S. suis type 2 tại Canada tương đối thấp (dưới 25%).
  • Kataoka et al. (1993) ghi nhận tỷ lệ phân lập cao nhất tại Nhật (28%).
  • Smith et al. (1999) và Gottschalk et al. ghi nhận tỷ lệ thấp tại Pháp, Ý, Tây Ban Nha.
  • Perch et al. (1983) mô tả các trường hợp bệnh ở người lần đầu tại Đan Mạch; Sihvonen et al. (1988) và Touil et al. ghi nhận ca bệnh tử vong.
  • Tại Việt Nam: Nguyễn Như Thanh và cs. (2001) xác định nơi cư trú của liên cầu lợn là đường tiêu hóa và sinh dục; Phạm Sĩ Lăng và cs. (2002) nghiên cứu biện pháp phòng bệnh; Lê Văn Tạo (2005) công bố nghiên cứu về sự lan truyền từ lợn sang người; Bùi Thị Hiền và cs. (2016) ghi nhận tỷ lệ nhiễm S. suis trên lợn khỏe tại Thừa Thiên Huế là 17,31%.

Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán:

  • Silva et al. (2006) ứng dụng PCR với cặp mồi CPS2 đặc hiệu để phát hiện đoạn gene 498 bp của S. suis type 2.
  • Tran Vu Thieu Nga et al. (2011) sử dụng Real-time PCR với cặp mồi CPS2J phát hiện S. suis type 2 trong dịch não tủy người bệnh.
  • Torremorell et al. (1997), Okwumabua and Chinnapapakkagari (2005), Mandanici et al. ứng dụng ELISA và dot blot trong chẩn đoán.
  • Yang et al. (2007) phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) phát hiện kháng thể kháng S. suis type 2 với độ nhạy 97,1% và độ đặc hiệu 86,3% so với ELISA.
  • Ju et al. (2010) chế tạo thành công KIT chẩn đoán nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch phát hiện trực tiếp vi khuẩn S. suis type 2.

Nghiên cứu vắc xin:

  • Tan et al. (2009) nghiên cứu thành công vắc xin phòng chống liên cầu lợn type 2; Li et al. (2006) sử dụng PCR với cặp mồi P1 khuếch đại gene mã hóa protein Sao (110 kDa); Li et al. (2011) khuếch đại gene protein bề mặt HP0245 để nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp.

Nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh cho các tác nhân khác tại Việt Nam:

  • Đinh Thị Bích Lân và cs. (2009): KIT phát hiện kháng thể kháng ký sinh trùng Toxoplasma gondii.
  • Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2015): KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4 của E. coli.
  • Phạm Đức Minh và Hoàng Văn Lương (2016): KIT phát hiện độc tố vi khuẩn tả Vibrio cholera.
  • Nguyễn Thị Tâm Thư và cs. (2016): KIT phát hiện E. coli trong nước thải sinh hoạt.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh phát hiện S. suis type 2 ở lợn. Đồng thời, chưa có nghiên cứu hệ thống về tình hình nhiễm S. suis type 2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm nền tảng

Luận án xây dựng trên ba trụ cột kỹ thuật:

  1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): Sử dụng cặp mồi CPS2 đặc hiệu (CPS2F và CPS2R) để xác định S. suis type 2 với đoạn khuếch đại 498 bp (theo Silva et al., 2006); cặp mồi 6PGD thiết kế dựa trên trình tự từ ngân hàng gene (gb/CP000407) theo Tan et al. để nhân đoạn gene 6-phosphogluconate-dehydrogenase (6PGD) dài 1428 bp.

  2. Nguyên lý miễn dịch kháng nguyên – kháng thể: Kháng nguyên thô được chế tạo từ vi khuẩn S. suis type 2 bất hoạt bằng formaldehyde 1%. Kháng thể đa dòng được tạo ra bằng cách gây đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng swiss albino, sau đó tinh sạch IgG.

  3. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (Immunochromatographic Test – ICT): Dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên – kháng thể trên màng nitrocellulose, trong đó kháng thể được gắn cộng hợp (conjugate) với hạt nano vàng (gold colloid) có kích thước 40 nm để tạo tín hiệu nhìn thấy bằng mắt thường. Kỹ thuật ICT được mở rộng từ ngưng kết hạt latex (Singer and Plotz, 1956). Hạt nano vàng được sử dụng phổ biến từ công bố của Leuvering (1980).

Phương pháp thực tế

Khảo sát dịch tễ:

  • Thu thập mẫu dịch mũi lợn bằng tăm bông vô trùng tại ba lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế.
  • Nuôi tăng sinh trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion), tách ADN theo phương pháp Marois et al., tiến hành PCR với cặp mồi CPS2.

Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử:

  • Phân lập vi khuẩn thuần trên môi trường thạch máu cừu 5% trong tủ ấm CO₂ 5% ở 37°C trong 16 giờ.
  • Xác định bằng các phản ứng sinh hóa (catalase, bile esculin, lên men đường, thử nghiệm di động, kiểm tra sinh indol).
  • Xác định đặc tính sinh học phân tử dựa trên gene bảo thủ 6PGD bằng PCR và tạo dòng gene trong vector pGEM®-T Easy (Promega); phân tích trình tự bằng phương pháp dideoxy terminator trên máy 3031 Analysis tại Công ty 1st BASE, Malaysia; so sánh trình tự bằng phần mềm BioEdit với dữ liệu NCBI.

Chế tạo kháng nguyên:

  • Vi khuẩn S. suis type 2 thuần nuôi trong môi trường Todd Hewitt Broth 7 giờ, bất hoạt bằng formaldehyde 1% ở 37°C trong 7 ngày (theo Ju et al.), rửa 3 lần bằng PBS.

Chế tạo kháng thể:

  • Tiêm kháng nguyên và chất bổ trợ vào phúc mạc chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, khối lượng 30–32 g/con.
  • Bố trí thí nghiệm so sánh ba mức liều kháng nguyên (2×10⁸, 1,5×10⁸, 1×10⁸ CFU/chuột) và ba loại chất bổ trợ: Freund's adjuvant (Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2 (Seppic, Pháp).
  • Tinh sạch kháng thể IgG bằng KIT Econo-Pac Protein A (Bio-Rad, Mỹ).
  • Định lượng kháng thể bằng Pierce BCA Protein Assay Kit.
  • Xác định hiệu giá kháng thể bằng ELISA gián tiếp trên máy BIO-RAD Coda Automated EIA.
  • Phân tích độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue.

Chế tạo conjugate và lắp ráp KIT:

  • Kháng thể gắn cộng hợp với dung dịch gold colloid 40 nm (DCN, Mỹ).
  • Tối ưu hóa pH dung dịch gold colloid và nồng độ kháng thể để gắn kết.
  • Phun kháng thể lên màng nitrocellulose bằng máy Biodot XYZ3060D0003; cắt que thử bằng máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000.

Đánh giá KIT:

  • Xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp phun lên màng NC.
  • So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT với phương pháp PCR trên tập mẫu thực địa.

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Mẫu dịch mũi lợn thu thập tại ba lò giết mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu, Xuân Phú) ở Thừa Thiên Huế; chủng vi khuẩn phân lập tại chỗ; trình tự gene đối chiếu từ ngân hàng gene NCBI (gb|CP000407); chủng vi khuẩn kiểm tra chéo gồm E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923, và các chủng liên cầu không phải type 2.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1. Tính cấp thiết của đề tài

Chương này làm rõ bối cảnh dịch tễ của bệnh liên cầu lợn, phân tích hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện hành, điểm lại các nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh trong và ngoài nước, từ đó xác định khoảng trống nghiên cứu và lý giải tính cấp thiết của đề tài.

Phần 2. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp tình hình nghiên cứu Streptococcus suis trong nước và trên thế giới theo các nội dung: đặc điểm hình thái, đặc tính nuôi cấy và sinh hóa, sức đề kháng, cấu trúc kháng nguyên (kháng nguyên thân, kháng nguyên giáp mô, kháng nguyên bám dính), khả năng gây bệnh, đường lây truyền. Phần tiếp theo mô tả các phương pháp chẩn đoán (PCR, ELISA) và điều trị (kháng sinh, huyết thanh đặc hiệu). Phần cuối giới thiệu tính chất lý hóa của hạt nano vàng và nguyên lý hoạt động của kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT), bao gồm cấu trúc que thử và cơ chế đọc kết quả dương tính/âm tính.

Về đặc tính sinh hóa, S. suis type 2 có thể lên men glucose, lactose, sucrose, trehalose, maltose, fructose nhưng không lên men sorbitol, dextrose, mannitol, xylose, glycerol, inulin; không di động; phản ứng catalase (−), oxidase (−), indol (−). Vi khuẩn tồn tại trong phân đến 104 ngày ở 0°C, trong bụi 54 ngày ở 0°C; bị diệt bởi formol 1% trong 60 phút.

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết vật liệu thí nghiệm (chuột SA, các chủng vi khuẩn chuẩn, hóa chất, thiết bị) và bốn nhóm phương pháp tương ứng với bốn nội dung nghiên cứu. Các bảng trình bày thành phần phản ứng PCR (bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4), thành phần phản ứng nối vector (bảng 3.5), bố trí thí nghiệm xác định liều kháng nguyên (bảng 3.6) và chất bổ trợ thích hợp (bảng 3.7), thiết kế thí nghiệm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu (bảng 3.8).

Phần 4. Kết quả và thảo luận

4.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 2

Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm:

Lò mổ Tỷ lệ nhiễm S. suis type 2
Bạch Yến 13,33%
Bãi Dâu 7,50%
Xuân Phú 6,67%
Tổng (Thừa Thiên Huế) 9,00%

Kết quả sinh học phân tử: Chủng phân lập được đặt tên TTHSS2. Kết quả sinh hóa xác nhận đặc tính S. suis type 2 (bảng 4.2 trong văn bản). Đoạn gene 6PGD phân lập được có độ dài 1428 bp, tương đồng 99% với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene (gb|CP000407). So sánh trình tự amino acid cho thấy sự tương đồng cao với WP_012028448.

Chế tạo kháng nguyên thô: Chủng TTHSS2 được bất hoạt bằng formaldehyde 1% ở 37°C trong 7 ngày; kết quả kiểm tra an toàn xác nhận kháng nguyên đã mất khả năng gây bệnh.

4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S. suis type 2

Tính sinh miễn dịch: Kháng nguyên TTHSS2 bất hoạt có tính sinh miễn dịch cao, xác nhận qua ELISA gián tiếp.

Liều kháng nguyên tối ưu: 1,5×10⁸ CFU/chuột cho đáp ứng miễn dịch cao nhất trong ba nhóm thử nghiệm.

Chất bổ trợ tối ưu: Freund's adjuvant (complete lần 1, incomplete lần 2 và 3) với liều tiêm 400 µl/chuột (200 µl kháng nguyên + 200 µl chất bổ trợ).

Hàm lượng kháng thể thu được sau tinh sạch:

Chỉ tiêu Giá trị
Nồng độ cao nhất 2000 µg/ml
Nồng độ thấp nhất 100 µg/ml
Hiệu giá (ở nồng độ 1000 µg/ml, pha loãng 10 lần) 7log₂ – 8log₂

SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue xác nhận kháng thể có nồng độ và độ tinh sạch cao.

4.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S. suis type 2

Điều kiện tối ưu gắn kháng thể với hạt nano vàng:

Thông số Giá trị tối ưu
pH dung dịch gold colloid 8,0
Nồng độ kháng thể gắn với hạt vàng nano 360 µg/µl
Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn phun lên màng NC 2000 µg/ml

4.4. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT

Ngưỡng phát hiện: Nồng độ vi khuẩn tối thiểu mà KIT có thể phát hiện là 5×10⁶ CFU/ml (tương đương 5×10⁵ CFU trong 100 µl mẫu).

Độ đặc hiệu: KIT không có phản ứng chéo với E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và các chủng liên cầu không phải type 2.

So sánh với PCR:

Chỉ tiêu Kết quả
Độ nhạy 93,33%
Độ đặc hiệu 100,00%

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn

Luận án tự nêu các đóng góp mới như sau:

  1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế, xác định tổng tỷ lệ nhiễm 9,00% trên ba lò mổ.

  2. Mẫu vi khuẩn S. suis type 2 phân lập (chủng TTHSS2) được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử, xác định đoạn gene 6PGD dài 1428 bp, tương đồng 99% với trình tự đã công bố.

  3. KIT chẩn đoán nhanh S. suis type 2 do đề tài nghiên cứu đạt độ nhạy 93,33% và độ đặc hiệu 100,00% khi so với PCR, cho kết quả tương đương với KIT chẩn đoán S. suis type 2 do Ju et al. (2010) công bố.

Kiến nghị

  • Sản phẩm KIT thích hợp cho chẩn đoán lâm sàng trên thực địa, phù hợp cho cán bộ thú y và cán bộ dịch tễ sử dụng mà không cần phòng thí nghiệm chuyên dụng.
  • Kết quả khảo sát dịch tễ tại Thừa Thiên Huế có thể làm cơ sở để đánh giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh liên cầu lợn, từ đó xây dựng chương trình phòng tránh phù hợp.
  • Kết quả là tài liệu tham khảo cho giảng dạy và nghiên cứu về bệnh do S. suis type 2 trong các trường và viện nghiên cứu chuyên ngành thú y.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản không trình bày phần riêng về hạn chế của nghiên cứu. Tuy nhiên, căn cứ vào phạm vi nghiên cứu được xác định, có thể ghi nhận một số giới hạn khách quan:

  • Khảo sát dịch tễ chỉ thực hiện tại ba lò giết mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế, do đó kết quả tỷ lệ nhiễm (9,00%) có giới hạn về tính đại diện cho phạm vi rộng hơn.
  • Kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng sản xuất trên chuột nhắt trắng swiss albino; việc so sánh với kháng thể đơn dòng không được đề cập trong văn bản.
  • Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu thực hiện bằng so sánh với phương pháp PCR; chưa có dữ liệu về thử nghiệm lâm sàng trên quy mô lớn tại thực địa.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo cho các nhóm đối tượng và lĩnh vực cụ thể sau:

  • Nghiên cứu sinh và giảng viên ngành Thú y, Bệnh lý học thú y: Phần tổng quan tài liệu (Phần 2) cung cấp tư liệu hệ thống về đặc tính sinh học, cấu trúc kháng nguyên, cơ chế gây bệnh và các phương pháp chẩn đoán S. suis type 2; phần phương pháp (Phần 3) cung cấp quy trình chi tiết từ phân lập, định danh đến chế tạo kháng nguyên và kháng thể.

  • Nhà nghiên cứu chuyên về công nghệ sinh học chẩn đoán: Quy trình chế tạo conjugate kháng thể – hạt nano vàng, tối ưu hóa pH và nồng độ kháng thể gắn cộng hợp, thiết kế vạch T và vạch C trên màng nitrocellulose là tài liệu thực hành cụ thể cho việc phát triển các KIT ICT cho tác nhân gây bệnh khác.

  • Cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ: Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm tại ba lò mổ tỉnh Thừa Thiên Huế và thông số vận hành của KIT (ngưỡng phát hiện, thời gian đọc kết quả 5–10 phút, không cần thiết bị phòng thí nghiệm) là căn cứ thực tế cho triển khai giám sát tại thực địa.

  • Nhà quản lý và hoạch định chính sách an toàn thực phẩm, y tế dự phòng: Số liệu dịch tễ về tỷ lệ mang mầm bệnh trên lợn khỏe tại lò mổ cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình kiểm soát giết mổ và cảnh báo nguy cơ lây nhiễm sang người.

Phần đáng tham khảo nhất là mục 3.2 (phương pháp nghiên cứu) với quy trình đầy đủ từng bước và mục 4 (kết quả) với bảng số liệu về tối ưu hóa các thông số chế tạo KIT.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên lợn khỏe tại Thừa Thiên Huế là bao nhiêu và có sự khác biệt giữa các lò mổ không?

Tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00%. Có sự khác biệt giữa ba lò mổ: lò mổ Bạch Yến có tỷ lệ cao nhất (13,33%), tiếp theo là lò mổ Bãi Dâu (7,50%) và lò mổ Xuân Phú (6,67%). Xác định bằng phương pháp PCR với cặp mồi CPS2 từ mẫu dịch mũi lợn.

2. Điều kiện tối ưu để gắn kháng thể kháng S. suis type 2 với hạt nano vàng là gì?

Theo kết quả thực nghiệm, pH dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano là pH 8,0 và nồng độ kháng thể thích hợp là 360 µg/µl. Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn phun lên màng nitrocellulose là 2000 µg/ml.

3. KIT chẩn đoán nhanh có thể phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 ở nồng độ tối thiểu là bao nhiêu và có phản ứng chéo với vi khuẩn khác không?

Ngưỡng phát hiện tối thiểu của KIT là 5×10⁶ CFU/ml (tương đương 5×10⁵ CFU trong 100 µl mẫu). KIT không có phản ứng chéo với E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và các chủng liên cầu không phải type 2, đạt độ đặc hiệu 100,00% khi so với phương pháp PCR.

4. Chủng vi khuẩn TTHSS2 phân lập được có đặc điểm sinh học phân tử như thế nào so với chủng tham chiếu đã công bố?

Đoạn gene 6PGD của chủng TTHSS2 có độ dài 1428 bp và tương đồng 99% với gene 6PGD của chủng S. suis type 2 SC 19 đã được công bố trên ngân hàng gene (gb|CP000407). So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD của TTHSS2 với trình tự đã công bố WP_012028448 cũng cho thấy độ tương đồng cao.

5. Liều kháng nguyên và chất bổ trợ nào cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất ở chuột nhắt trắng swiss albino trong quá trình chế tạo kháng thể?

Từ ba nhóm thử nghiệm với liều 2×10⁸, 1,5×10⁸ và 1×10⁸ CFU/chuột kết hợp Montanide ISA 50V2, kết quả xác định 1,5×10⁸ CFU/chuột là liều kháng nguyên tối ưu. Khi so sánh ba loại chất bổ trợ (Freund's adjuvant, Montanide ISA 201 VG, Montanide ISA 50V2), Freund's adjuvant (complete lần tiêm 1, incomplete lần tiêm 2 và 3) kết hợp với liều tiêm 400 µl/chuột (200 µl kháng nguyên + 200 µl chất bổ trợ) cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất, đạt hiệu giá kháng thể sau tinh sạch trong khoảng 7log₂ – 8log₂.

Kết luận

Luận án của Lê Quốc Việt (2019) trình bày quy trình hoàn chỉnh từ phân lập và định danh S. suis type 2, sản xuất kháng nguyên thô, chế tạo kháng thể đa dòng đến lắp ráp và đánh giá KIT chẩn đoán nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch với hạt nano vàng. Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên lợn khỏe tại ba lò mổ Thừa Thiên Huế là 9,00%, cung cấp dữ liệu dịch tễ cơ bản cho khu vực chưa từng được nghiên cứu hệ thống. KIT chế tạo được đạt độ nhạy 93,33% và độ đặc hiệu 100,00% so với PCR, không phản ứng chéo với bốn loại vi khuẩn thử nghiệm, với ngưỡng phát hiện 5×10⁶ CFU/ml. Sản phẩm có tiềm năng ứng dụng tại thực địa do không đòi hỏi phòng thí nghiệm, cho kết quả trong 5–10 phút, phù hợp với nhu cầu chẩn đoán và giám sát bệnh liên cầu lợn trong điều kiện chăn nuôi và giết mổ tại Việt Nam.