Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện ToMV và TOMMV Bằng Kỹ Thuật Multiplex RT-PCR

Khóa luận trình bày quy trình phát hiện virus mosaic cà chua bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR, góp phần nâng cao chất lượng nông sản.

• Tác giả: Hà Tuyết Anh
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Văn Biết
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện ToMV (Tomato Mosaic Virus) Và ToMMV (Tomato Mottle Mosaic Virus) Bằng Kỹ Thuật Multiplex RT - PCR
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về cây cà chua
• 2.2. Phân loại khoa học
• 2.3. Nguồn gốc và phân bố
• 2.4. Giá trị cà chua
• 2.4.1. Giá trị dinh dưỡng
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu và hóa chất
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Kiểm tra mẫu chuẩn dương
• 3.3.2. Kiểm tra đặc tính primer trên lý thuyết
• 3.3.3. Một số tiêu chuẩn thiết kế và kiểm tra primer
• 3.3.4. Ly trích RNA mẫu chuẩn dương
• 3.3.5. Xử lý với enzyme DNase
• 3.3.6. Tổng hợp cDNA
• 3.3.7. Khuếch đại mẫu chuẩn dương ToMV và ToMMV
• 3.3.8. Điện di sản phẩm PCR
• 3.3.9. Giải trình tự mẫu chuẩn dương
• 3.3.10. Xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV và ToMMV bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR
• 3.3.11. Đối chứng nội cho kiểm soát quy trình
• 3.3.12. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ mồi
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả kiểm tra đối chứng dương
• 4.2. Kết quả kiểm tra đặc tính primer trên lý thuyết
• 4.3. Kết quả ly trích đối chứng dương ToMV và ToMMV
• 4.4. Kết quả khuếch đại đối chứng dương ToMV và ToMMV
• 4.5. Kết quả giải trình tự mẫu chuẩn dương
• 4.6. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện virus ToMV và ToMMV bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR
• 4.7. Kết quả thiết kế primer đối chứng nội cho phản ứng khảo sát quá trình tách chiết
• 4.8. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu primer TUB-E/TUB-R
• 4.9. Kết quả tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng Multiplex RT-PCR
• 4.10. Kết quả khảo sát nồng độ primer ToMV và primer ToMMV
• 4.11. Kết quả khảo sát nồng độ primer TUB
• 4.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của hệ mồi
• 4.13. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu
• 4.14. Kết quả áp dụng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời virus ToMV và ToMMV trên mẫu thực địa
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1
• PHỤ LỤC 2
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phát Hiện Virus Cà Chua Bằng Multiplex RT PCR

Virus cà chua, đặc biệt là Tomato mosaic virus (ToMV) và Tomato mottle mosaic virus (ToMMV), là những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trong ngành trồng trọt. Việc phát hiện sớm và chính xác các loại virus này là rất quan trọng để bảo vệ năng suất và chất lượng sản phẩm. Kỹ thuật Multiplex RT-PCR đã được phát triển để phát hiện đồng thời nhiều loại virus trong một mẫu, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Quy trình này không chỉ đơn giản hóa việc phát hiện mà còn nâng cao độ chính xác trong việc xác định sự hiện diện của virus.

1.1. Virus Cà Chua Nguyên Nhân Gây Bệnh và Tác Động

Virus cà chua gây ra nhiều triệu chứng khác nhau, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng. ToMV và ToMMV là hai loại virus phổ biến nhất, gây thiệt hại kinh tế lớn cho nông dân. Việc hiểu rõ về các triệu chứng và tác động của virus là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tại Sao Cần Phát Hiện Virus Cà Chua Sớm

Phát hiện sớm virus cà chua giúp nông dân có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát kịp thời, giảm thiểu thiệt hại. Việc sử dụng Multiplex RT-PCR cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác, từ đó bảo vệ mùa màng và tăng cường an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Trong Việc Phát Hiện Virus Cà Chua

Việc phát hiện virus cà chua gặp nhiều thách thức do sự tương đồng giữa các loại virus trong cùng họ. Các phương pháp truyền thống như ELISA thường không đủ nhạy và đặc hiệu. Multiplex RT-PCR ra đời nhằm khắc phục những hạn chế này, cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại virus trong một mẫu. Tuy nhiên, việc tối ưu hóa quy trình và điều kiện phản ứng vẫn là một thách thức lớn.

2.1. Những Khó Khăn Trong Phát Hiện Virus

Virus cà chua có thể gây ra triệu chứng tương tự nhau, làm khó khăn trong việc phân biệt. Việc sử dụng Multiplex RT-PCR giúp giải quyết vấn đề này bằng cách phát hiện nhiều loại virus trong một lần thử nghiệm.

2.2. Độ Chính Xác Của Các Phương Pháp Hiện Tại

Các phương pháp hiện tại như RT-PCR đơn lẻ có thể không đủ độ chính xác khi phát hiện virus. Multiplex RT-PCR cung cấp một giải pháp hiệu quả hơn, giúp tăng cường độ chính xác và giảm thiểu sai sót trong quá trình phát hiện.

III. Quy Trình Multiplex RT PCR Để Phát Hiện Virus Cà Chua

Quy trình Multiplex RT-PCR bao gồm nhiều bước từ tách chiết RNA đến khuếch đại sản phẩm. Đầu tiên, RNA được tách chiết từ mẫu cây cà chua nghi ngờ nhiễm virus. Sau đó, cDNA được tổng hợp và khuếch đại bằng các primer đặc hiệu cho ToMV và ToMMV. Quy trình này đã được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

3.1. Các Bước Trong Quy Trình Multiplex RT PCR

Quy trình bắt đầu bằng việc tách chiết RNA từ mẫu, tiếp theo là tổng hợp cDNA và khuếch đại sản phẩm PCR. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Phản Ứng

Điều kiện phản ứng như nhiệt độ và nồng độ primer cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu là 53,7 °C với nồng độ primer phù hợp cho cả hai loại virus.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Quy Trình Multiplex RT PCR

Quy trình Multiplex RT-PCR đã được áp dụng thành công trên nhiều mẫu thực địa, cho thấy khả năng phát hiện đồng thời ToMV và ToMMV. Kết quả cho thấy 38/60 mẫu dương tính với virus, chứng tỏ tính hiệu quả của phương pháp này trong việc kiểm soát bệnh hại trên cây cà chua.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Trên Mẫu Thực Địa

Nghiên cứu đã áp dụng quy trình trên 60 mẫu thực địa và phát hiện 38 mẫu nhiễm virus. Điều này cho thấy Multiplex RT-PCR là một công cụ hữu ích trong việc phát hiện virus cà chua.

4.2. Tác Động Đến Ngành Trồng Trọt

Việc phát hiện sớm virus giúp nông dân có thể áp dụng các biện pháp phòng ngừa kịp thời, từ đó giảm thiểu thiệt hại và nâng cao năng suất cây trồng. Quy trình này có thể được áp dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Quy Trình Phát Hiện Virus Cà Chua

Quy trình Multiplex RT-PCR đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện đồng thời ToMV và ToMMV. Tương lai, nghiên cứu có thể mở rộng để phát hiện thêm nhiều loại virus khác, từ đó nâng cao khả năng kiểm soát bệnh hại trong ngành trồng trọt. Việc áp dụng công nghệ này sẽ góp phần bảo vệ mùa màng và tăng cường an toàn thực phẩm.

5.1. Triển Vọng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Nghiên cứu có thể mở rộng để phát hiện thêm nhiều loại virus khác, từ đó nâng cao khả năng kiểm soát bệnh hại trong ngành trồng trọt.

5.2. Tác Động Đến An Toàn Thực Phẩm

Việc phát hiện sớm virus sẽ giúp bảo vệ mùa màng, từ đó đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Quy trình này có thể trở thành tiêu chuẩn trong ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Solanum lycopersicum L.) là loại rau ăn quả có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, giữ vai trò chủ lực trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của FAOSTAT (2021), diện tích gieo trồng cà chua trên thế giới năm 2019 đạt 5,03 triệu ha với tổng sản lượng 181 triệu tấn. Tại Việt Nam, diện tích sản xuất cà chua dao động từ 23.000 ha đến 25.000 ha, trong đó các tỉnh phía Bắc và vùng Lâm Đồng chiếm trên 19.418 ha (tương đương 81,6% tổng diện tích cả nước).

Bên cạnh tiềm năng kinh tế, canh tác cà chua đối mặt với nhiều áp lực dịch hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây ra. Trong số ít nhất 136 loại virus được ghi nhận gây hại trên cà chua, các loài thuộc chi Tobamovirus (họ Virgaviridae) gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Hai loài virus phổ biến và gây thất thoát năng suất nặng nề (giảm từ 20% đến 25%) là Tomato mosaic virus (ToMV) và Tomato mottle mosaic virus (ToMMV). Cả hai tác nhân này đều gây triệu chứng biến dạng lá, đốm khảm vàng - xanh lồi lõm dạng phồng rộp và còi cọc cây. Do hình thái hạt virion dạng que (kích thước khoảng 300 nm × 18 nm) rất khó phân biệt dưới kính hiển vi điện tử, đồng thời mức độ tương đồng trình tự nucleotide cao (khoảng 85%) dẫn đến phản ứng huyết thanh học chéo khi sử dụng kỹ thuật ELISA, việc chẩn đoán phân biệt chính xác hai loài này gặp nhiều trở ngại. Đặc biệt, ToMMV còn có khả năng vượt qua tính kháng ToMV trên một số giống cà chua thương mại.

Trước thực tiễn đó, phương pháp Multiplex RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction đa mồi) là giải pháp khuếch đại đồng thời nhiều trình tự mục tiêu trong một ống phản ứng, giúp rút ngắn thời gian, giảm chi phí hóa chất và loại trừ nguy cơ phản ứng chéo.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

• Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) và ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR và ứng dụng thành công quy trình trên mẫu thực địa.
• Nội dung nghiên cứu:
  1. Xây dựng và chuẩn hóa quy trình phát hiện virus ToMV và ToMMV bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR (bao gồm thiết kế đối chứng nội, tối ưu hóa nồng độ mồi, nhiệt độ bắt cặp và kiểm tra độ đặc hiệu).
  2. Áp dụng quy trình phát hiện virus ToMV và ToMMV bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR trên các mẫu lá cà chua thu thập tại thực địa.
• Đối tượng nghiên cứu: Các phân đoạn gene đặc hiệu của ToMV, ToMMV và gene giữ nhà $\beta$-tubulin (Solanum lycopersicum) đóng vai trò làm đối chứng nội (Internal Control).
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Không gian thực nghiệm: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Địa bàn khảo sát mẫu: 60 mẫu lá cà chua nghi nhiễm thu hái từ 7 vườn canh tác tại huyện Di Linh (tỉnh Lâm Đồng) và thành phố Gia Nghĩa (tỉnh Đắk Nông).
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở phân loại học thực vật của chi Solanum, đặc điểm sinh học phân tử của chi Tobamovirus, và nguyên lý khuếch đại acid nucleic qua phản ứng phiên mã ngược kết hợp PCR đa mồi (Two-step Multiplex RT-PCR). Bộ gene của ToMV và ToMMV là mạch RNA dương sợi đơn (ssRNA). Quy trình kỹ thuật áp dụng nguyên lý tích hợp hệ mồi đối chứng nội $\beta$-tubulin (gen giữ nhà biểu hiện liên tục trong mô thực vật) nhằm giám sát hiệu quả tách chiết RNA tổng số và phiên mã ngược tổng hợp cDNA, loại bỏ các kết quả âm tính giả do mẫu chứa chất ức chế enzym polymerase.

Hệ thống phương pháp và công cụ nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Thiết kế và kiểm tra primer bằng tin sinh học: Sử dụng công cụ trực tuyến OligoAnalyzer và phần mềm BLAST (NCBI) để đánh giá các chỉ số hóa lý của primer: nhiệt độ nóng chảy ($T_m$), tỷ lệ %GC, cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop), cấu trúc tự bắt cặp (self-dimer) và bắt cặp chéo (hetero-dimer). Thiết kế primer đối chứng nội dựa trên trình tự mRNA gene $\beta$-tubulin của Solanum lycopersicum (mã số truy cập NM_001247878) bằng phần mềm Primer3Plus, thiết lập vị trí mồi bắc cầu giữa Exon 1 và Exon 3-2 để mồi chỉ khuếch đại trên khuôn cDNA mà không nhân bản trên khuôn DNA bộ gene sót lại.
• Phương pháp tách chiết và xử lý RNA: Tách chiết RNA tổng số từ 50 mg mô lá cà chua bằng bộ kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps (BioBasic). Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch qua tỷ số độ hấp thụ quang học $A_{260}/A_{280}$ trên máy quang phổ vi thể Biodrop. Dịch trích RNA sau đó được xử lý với enzyme DNase I (Thermo Fisher) ở 37°C trong 30 phút và bất hoạt enzyme bằng EDTA ở 65°C trong 10 phút để loại bỏ DNA bộ gene của cây chủ.
• Tổng hợp sợi đơn cDNA: Sử dụng bộ kit SensiFAST cDNA Synthesis (Bioline) với enzyme reverse transcriptase; chu trình nhiệt gồm gắn mồi (25°C trong 10 phút), tổng hợp sợi (42°C trong 15 phút, 48°C trong 15 phút) và bất hoạt enzyme (85°C trong 5 phút).
• Khuếch đại PCR đơn và giải trình tự gen: Xác nhận mẫu chuẩn dương ToMV (sản phẩm 595 bp) và ToMMV (sản phẩm 289 bp) qua phản ứng RT-PCR đơn lẻ, điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% pha thuốc nhuộm GelRed với hiệu điện thế 100 V trong 30 phút. Sản phẩm khuếch đại được gửi giải trình tự tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa, xử lý dữ liệu bằng BioEdit 7.2 và gióng hàng đối chiếu trên ngân hàng gene NCBI GenBank.
• Tối ưu hóa các thông số phản ứng Multiplex RT-PCR:
  • Khảo sát ma trận tỷ lệ nồng độ primer ToMV và ToMMV (9 tổ hợp nồng độ từ 0,1 $\mu$M đến 0,3 $\mu$M).
  • Khảo sát nồng độ primer đối chứng nội TUB (các mức từ 0,2 $\mu$M đến 0,5 $\mu$M).
  • Khảo sát dải nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) của hệ 3 cặp mồi trên máy luân nhiệt LifeEco Thermo Cycler ở 6 mức nhiệt: 52°C, 53,7°C, 55,1°C, 57,2°C, 58,6°C và 60°C.
• Kiểm tra độ đặc hiệu (Specificity Test): Áp dụng phương pháp tạo mẫu nhiễm nhân tạo (Sample Spike) bằng cách phối trộn mẫu lá cà chua khỏe với dịch RNA của 7 đối tượng virus gây bệnh thực vật khác: Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Papaya Ringspot Virus (PRSV), Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV), Pineapple mealybug wilt-associated virus 1, 2, 3 (PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3).
• Thử nghiệm trên mẫu thực địa: Áp dụng quy trình tối ưu lên 60 mẫu lá thu thập ngoài sản xuất, tuân thủ tiêu chuẩn thu mẫu và bảo quản theo QCVN 01-175:2014/BNNPTNT.

Nguồn dữ liệu nghiên cứu bao gồm: dữ liệu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, trình tự tham chiếu trên NCBI GenBank, và số liệu phân tích từ 60 mẫu thực địa.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương 1 trình bày tổng quan về vị trí ngành hàng cà chua trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp Việt Nam và thế giới, nhấn mạnh thiệt hại mùa màng do nhóm Tobamovirus gây ra. Tác giả phân tích những hạn chế hiện hữu của các phương pháp chẩn đoán truyền thống: chẩn đoán qua triệu chứng dễ nhầm lẫn do biến động môi trường; kính hiển vi điện tử không phân loại được virion cùng chi; kỹ thuật huyết thanh học DAS-ELISA xuất hiện phản ứng chéo nghiêm trọng giữa ToMV, ToMMV và TMV. Từ đó, tác giả khẳng định tính cấp thiết của việc xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR tích hợp mồi nội kiểm $\beta$-tubulin nhằm phát hiện đồng thời hai loài virus với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phục vụ công tác quản lý dịch hại. Chương này công bố rõ mục tiêu tổng quát và hai nội dung nghiên cứu trọng tâm của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp hệ thống tư liệu khoa học về cây cà chua và các tác nhân virus nghiên cứu:

• Đặc điểm cây cà chua: Phân loại học từ chi Solanum, thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được (nước 94g, lycopen 3025 $\mu$g, vitamin C 40 mg, năng lượng 20 kcal), cùng bức tranh sản xuất trong nước với vùng trọng điểm Lâm Đồng (diện tích 5.140 ha, sản lượng 221.820 tấn).
• Đặc điểm sinh học của ToMV và ToMMV: ToMV có hệ gene RNA sợi đơn 6,4 kb mã hóa 4 protein (126 kDa, 183 kDa cho sao chép; 30 kDa cho vận chuyển; 17,5 kDa làm protein vỏ), có khả năng tồn tại 24 năm trong tàn dư thực vật ở nhiệt độ phòng. ToMMV được phát hiện lần đầu năm 2009 tại Mexico, có độ tương đồng 80% với TMV và 85% với ToMV, lây truyền cơ học qua hạt giống, tiếp xúc cơ giới và côn trùng truyền hạt phấn như ong vò vẽ.
• Các phương pháp chẩn đoán virus thực vật: So sánh nguyên lý, ưu điểm và nhược điểm của chẩn đoán triệu chứng, kính hiển vi điện tử, ELISA, Real-time RT-PCR, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) và giải trình tự gen. Tác giả chỉ ra LAMP dù nhân bản đẳng nhiệt nhanh ở 60–65°C nhưng tỷ lệ dương tính giả cao; Real-time RT-PCR yêu cầu chi phí máy móc đắt đỏ.
• Tình hình ứng dụng Multiplex RT-PCR: Tổng hợp các công trình quốc tế (Letchert et al., 2002; Kumar et al., 2011; Zarzyńska et al., 2018; Schoen et al., 2023) và nghiên cứu trong nước (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006; Nguyễn Xuân Dũng, 2015; Nguyễn Thị Thảo, 2017), cho thấy xu hướng kết hợp đa mồi chẩn đoán bệnh virus trên cây họ Cà (Solanaceae) ngày càng mở rộng.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 mô tả cụ thể các đối tượng vật liệu, danh mục hóa chất, bộ kit chuẩn, thiết bị thí nghiệm và các bước tiến hành:

• Vật liệu và hóa chất: 60 mẫu lá cà chua thu tại 7 nhà vườn thuộc Di Linh (Lâm Đồng) và TP. Gia Nghĩa (Đắk Nông); mẫu chuẩn dương ToMV, ToMMV và 7 chủng virus kiểm tra độ đặc hiệu; hóa chất chính gồm bộ kit tách chiết BioBasic, kit phiên mã ngược SensiFAST, MyTaq Mix, thang chuẩn ADN (HyperLadder 100bp và 1kb).
• Thông số các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu:

Tên primer	Trình tự nucleotide (5’ – 3’)	Kích thước sản phẩm (bp)	Nguồn tham khảo / Thiết kế
ToMV-F	AAGATGTCAAACCAACTTTA	595	Sui et al. (2017)
ToMV-R	GAAACATCCAACTCAAGTACG	595	Sui et al. (2017)
ToMMV-F	CGACCCTGTAGAATTAATAAATATT	289	Sui et al. (2017)
ToMMV-R	CACTCTGCGAGTGGCATCCAAT	289	Sui et al. (2017)
TUB-F	AGATCTGGTCCCTATGG	450	Tác giả tự thiết kế (Exon 1)
TUB-R	GTTCAAGTCACCAAAACT	450	Tác giả tự thiết kế (Exon 3-2)

• Chi tiết quy trình thực nghiệm: Mô tả chi tiết các bước ly trích qua màng cột lọc; điều kiện xử lý DNase I; chu trình nhiệt phiên mã ngược cDNA; thành phần phản ứng PCR và điện di gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 100 V trong 30 phút.
• Thiết lập tối ưu hóa phản ứng: Phương pháp bố trí ma trận nồng độ primer ToMV/ToMMV (0,1–0,3 $\mu$M), khảo sát nồng độ primer TUB (0,2–0,5 $\mu$M), dải nhiệt độ bắt cặp gradient từ 52°C đến 60°C, và quy trình kiểm tra chéo độ đặc hiệu theo kỹ thuật Sample Spike.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 phân tích các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chuẩn hóa và ứng dụng quy trình:

• Đánh giá lý thuyết primer ToMV và ToMMV: Mức năng lượng tự do ($\Delta G$) hình thành cấu trúc hairpin loop của các mồi đều lớn hơn -9 kcal/mol (ToMV-F: -0,44 kcal/mol; ToMV-R: -0,81 kcal/mol; ToMMV-F: 0,2 kcal/mol; ToMMV-R: -3,7 kcal/mol). Cấu trúc self-dimer dao động từ -3,65 đến -7,8 kcal/mol; hetero-dimer giữa các mồi dao động từ -3,3 đến -6,47 kcal/mol (đều > -9 kcal/mol), đảm bảo mồi không bị bất hoạt hay tạo dimer bền vững ở nhiệt độ phản ứng.
• Đo quang phổ mẫu chuẩn dương: Dịch trích RNA của ToMV đạt nồng độ 88,53 ng/$\mu$L với tỷ số $A_{260}/A_{280} = 1,953$; mẫu ToMMV đạt 80,25 ng/$\mu$L với $A_{260}/A_{280} = 1,984$, đáp ứng tiêu chuẩn độ tinh sạch (1,8 – 2,0).
• Khuếch đại RT-PCR đơn và giải trình tự: Sản phẩm PCR đơn lẻ cho vạch sáng rõ, kích thước chính xác 595 bp (ToMV) và 289 bp (ToMMV). Kết quả gióng hàng BLAST trên NCBI xác nhận phân đoạn ToMV tương đồng 98,99% với mã số MH393623.1; phân đoạn ToMMV đạt độ tương đồng 100% với 47 trình tự trên NCBI, bao gồm mã số NC_022230.1.
• Hiệu quả của cặp mồi đối chứng nội TUB: Cặp mồi TUB-F/TUB-R nhân bản thành công băng 450 bp trên mẫu dịch trích đã xử lý DNase I và chuyển đổi thành cDNA. Ngược lại, mẫu RNA chưa qua xử lý DNase I không tạo băng sản phẩm mà chỉ xuất hiện vệt mờ, chứng minh mồi không khuếch đại DNA bộ gene cây chủ.
• Kết quả tối ưu hóa Multiplex RT-PCR:
  • Nồng độ mồi ToMV và ToMMV: Tổ hợp mồi ToMV 0,2 $\mu$M và ToMMV 0,2 $\mu$M cho vạch sản phẩm sắc nét, đồng đều, hạn chế tối đa primer-dimer và tiết kiệm chi phí hóa chất.
  • Nồng độ mồi chứng nội TUB: Nồng độ 0,4 $\mu$M cho vạch sáng cân bằng với hai băng virus mục tiêu mà không gây hiện tượng ức chế cạnh tranh với mồi ToMMV (nồng độ 0,5 $\mu$M xuất hiện ức chế làm mờ băng ToMMV).
  • Nhiệt độ bắt cặp ($T_a$): Tại 53,7°C, cả 3 vạch sản phẩm (595 bp, 450 bp, 289 bp) đều sáng rõ, đúng kích thước lý thuyết và lượng primer-dimer thấp nhất. Ở nhiệt độ 60°C, vạch tín hiệu bị mờ, mất băng và có hiện tượng lệch kích thước.
• Độ đặc hiệu của phản ứng: Điện di sản phẩm Multiplex RT-PCR trên các mẫu phối trộn 7 loài virus khác (TSWV, CMV, PRSV, ZYMV, PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3) chỉ xuất hiện duy nhất vạch đối chứng nội 450 bp; hoàn toàn không có băng chéo ở vị trí 595 bp và 289 bp.
• Ứng dụng trên mẫu thực địa: Kiểm tra 60 mẫu lá cà chua thu thập tại Lâm Đồng và Đắk Nông cho thấy có 38 mẫu đồng nhiễm cả hai loài ToMV và ToMMV (xuất hiện đủ 3 vạch sản phẩm trên bản gel).

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Chương 5 tóm tắt các kết quả kỹ thuật đạt được của quy trình Multiplex RT-PCR và thực trạng lây nhiễm thực địa; đồng thời đề xuất kiến nghị mở rộng phạm vi lấy mẫu ở các vùng chuyên canh khác và tiếp tục tích hợp thêm các tác nhân virus mới nổi trên cây họ Cà.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả kỹ thuật và số liệu thực nghiệm

Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình Multiplex RT-PCR với các thông số kỹ thuật được chuẩn hóa chi tiết:

Thông số kỹ thuật	Điều kiện tối ưu được xác lập
Hệ mồi sử dụng	ToMV-F/ToMV-R, ToMMV-F/ToMMV-R, TUB-F/TUB-R
Kích thước sản phẩm khuếch đại	ToMV: 595 bp; TUB (chứng nội): 450 bp; ToMMV: 289 bp
Tỷ lệ nồng độ primer tối ưu	ToMV : ToMMV : TUB = 0,2 $\mu$M : 0,2 $\mu$M : 0,4 $\mu$M
Nhiệt độ bắt cặp mồi ($T_a$)	53,7°C
Chu trình nhiệt phản ứng	1 chu kỳ tiền biến tính: 95°C trong 5 phút; 40 chu kỳ luân nhiệt: 95°C trong 1 phút, 53,7°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút 20 giây; 1 chu kỳ hậu kéo dài: 72°C trong 7 phút; bảo quản ở 4°C
Độ đặc hiệu	100% đối với ToMV và ToMMV; không phản ứng chéo với TSWV, CMV, PRSV, ZYMV, PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3
Hiệu quả phát hiện thực địa	Phát hiện 38/60 mẫu lá cà chua đồng nhiễm ToMV và ToMMV (chiếm tỷ lệ 63,33%) tại 7 vườn thuộc Di Linh (Lâm Đồng) và Gia Nghĩa (Đắk Nông)

Đóng góp của đề tài

• Khắc phục phản ứng chéo huyết thanh học: Giải quyết triệt để hạn chế của phương pháp DAS-ELISA trong việc phân biệt hai loài Tobamovirus có mức tương đồng trình tự cao (ToMV và ToMMV), cho phép chẩn đoán chính xác từng loài hoặc tình trạng đồng nhiễm.
• Thiết kế thành công hệ đối chứng nội đặc hiệu: Thiết kế cặp mồi TUB-F/TUB-R bắc cầu exon (Exon 1 và Exon 3-2 của gene $\beta$-tubulin), đảm bảo chỉ nhân bản trên cDNA có nguồn gốc từ bản phiên mã mRNA thực vật, giúp kiểm soát chất lượng mẫu tách chiết và quá trình tổng hợp cDNA, loại trừ hiện tượng âm tính giả do ức chế PCR hoặc sai sót thao tác.
• Tối ưu hóa kinh tế và thời gian: Việc tích hợp 3 cặp mồi trong cùng một giếng phản ứng giúp giảm 2/3 lượng hóa chất tiêu hao và thời gian chạy máy so với thực hiện các phản ứng RT-PCR đơn lẻ.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Cỡ mẫu thực địa còn giới hạn ở 60 mẫu thu hái tập trung tại hai địa phương (Di Linh - Lâm Đồng và Gia Nghĩa - Đắk Nông), chưa phản ánh toàn diện cơ cấu dịch tễ ToMV và ToMMV trên quy mô các vùng chuyên canh cà chua trọng điểm khác ở miền Bắc và Đồng bằng sông Cửu Long.
• Nghiên cứu chưa tiến hành xác định giới hạn phát hiện thấp nhất (Limit of Detection - LOD) thông qua việc pha loãng bậc 10 liên tiếp nồng độ khuôn mẫu RNA để định lượng ngưỡng nhạy tuyệt đối của quy trình.
• Đề tài chưa khảo sát khả năng nhận diện đối với các biến thể di truyền mới của ToMMV có thể phát sinh đột biến tại vị trí gắn mồi.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu đại trà tại các vùng trồng cà chua tập trung khác trên cả nước để đánh giá tỷ lệ lưu hành thực tế của ToMV và ToMMV.
• Nghiên cứu nâng cấp quy trình Multiplex RT-PCR bằng cách bổ sung thêm các cặp mồi phát hiện các loài virus nguy hiểm mới xuất hiện trên cà chua như Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) hoặc Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).
• Chuẩn hóa quy trình thành bộ kít chẩn đoán hoàn chỉnh phục vụ công tác kiểm dịch thực vật tại các cửa khẩu nhập khẩu hạt giống và các cơ sở sản xuất giống thương phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên và nghiên cứu viên: Thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Trồng trọt, Nông học, và Bệnh học Thực vật đang thực hiện các đề tài về chẩn đoán phân tử vi sinh vật gây hại.
• Cán bộ kỹ thuật kiểm dịch và phòng kiểm nghiệm: Tại các Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ Thực vật, Trung tâm Khuyến nông, các phòng phân tích bệnh cây tư nhân hoặc doanh nghiệp sản xuất giống cây trồng.
• Các phần có giá trị tham khảo cao nhất:
  • Nguyên tắc và phương pháp thiết kế primer chứng nội bắc cầu exon ($\beta$-tubulin) nhằm tránh hiện tượng dương tính giả từ DNA bộ gene cây chủ.
  • Phương pháp bố trí ma trận tối ưu hóa nồng độ mồi đa mục tiêu và xử lý cạnh tranh primer trong phản ứng Multiplex PCR.
  • Quy trình chi tiết từ khâu xử lý mô lá, ly trích RNA, xử lý enzym DNase I đến các chu trình nhiệt chuẩn hóa cho phản ứng RT-PCR.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước sản phẩm khuếch đại của các đoạn gene mục tiêu trong quy trình Multiplex RT-PCR là bao nhiêu?
Sản phẩm khuếch đại phân đoạn gene ToMV có kích thước 595 bp; sản phẩm đoạn gene ToMMV có kích thước 289 bp; và sản phẩm của gene đối chứng nội $\beta$-tubulin (TUB) có kích thước 450 bp. Sự chênh lệch kích thước rõ rệt giữa 3 đoạn amplicon cho phép phân tách mạch lạc trên bản gel agarose 1,5%.

2. Vai trò của cặp mồi đối chứng nội TUB-F/TUB-R là gì và tại sao mồi này không khuếch đại DNA bộ gene của cây cà chua?
Cặp mồi TUB-F/TUB-R khuếch đại đoạn gene $\beta$-tubulin đóng vai trò chứng nội nhằm kiểm tra chất lượng quá trình tách chiết RNA và phiên mã ngược, đảm bảo mẫu không bị ức chế phản ứng PCR (loại trừ kết quả âm tính giả). Mồi được thiết kế bắc cầu tại vị trí nối giữa Exon 1 và Exon 3, với mồi ngược chứa 3–4 nucleotide của Exon 2 (khác với trình tự intron liền kề). Do đó, mồi chỉ bắt cặp bổ sung và kéo dài trên bản phiên mã mRNA đã hoàn thiện (cDNA), không thể bắt cặp trên khuôn mẫu DNA bộ gene còn chứa các đoạn intron dài.

3. Tỷ lệ nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp được xác định tối ưu cho quy trình là bao nhiêu?
Tỷ lệ nồng độ primer tối ưu trong phản ứng Multiplex RT-PCR là ToMV : ToMMV : TUB tương ứng 0,2 $\mu$M : 0,2 $\mu$M : 0,4 $\mu$M. Nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) tối ưu của hệ mồi được xác định là 53,7°C, giúp cả 3 băng sản phẩm đều đạt độ sáng đậm, rõ nét và hạn chế tối đa việc tạo sản phẩm phụ hay primer-dimer.

4. Khóa luận đã kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi với những tác nhân virus nào và kết quả ra sao?
Hệ mồi được kiểm tra tính chuyên biệt với 7 loại virus khác gồm: Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Papaya Ringspot Virus (PRSV), Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV), và ba loài thuộc chi Ampelovirus (Pineapple mealybug wilt-associated virus 1, 2, 3). Kết quả điện di cho thấy tất cả các mẫu thử này đều chỉ xuất hiện một băng chứng nội 450 bp, không xuất hiện băng đặc hiệu của ToMV (595 bp) hay ToMMV (289 bp), chứng minh quy trình đạt độ đặc hiệu cao và không bắt cặp chéo.

5. Kết quả áp dụng quy trình trên 60 mẫu lá cà chua thực địa tại Lâm Đồng và Đắk Nông ghi nhận tình hình nhiễm bệnh như thế nào?
Khi áp dụng quy trình trên 60 mẫu lá cà chua có triệu chứng bệnh thu hái tại 7 vườn thuộc Di Linh và TP. Gia Nghĩa, có 38 mẫu cho kết quả dương tính đồng thời với cả hai loài virus ToMV và ToMMV (chiếm tỷ lệ 63,33%). Điều này cho thấy hiện tượng đồng nhiễm hai loài Tobamovirus này đang diễn ra phổ biến ngoài đồng ruộng.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Hà Tuyết Anh đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời hai loài virus gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua là ToMV và ToMMV, tích hợp hệ mồi đối chứng nội $\beta$-tubulin (450 bp) kiểm soát âm tính giả. Với các điều kiện tối ưu được xác lập gồm tỷ lệ mồi ToMV : ToMMV : TUB là 0,2 : 0,2 : 0,4 $\mu$M và nhiệt độ bắt cặp 53,7°C, quy trình thể hiện độ đặc hiệu tuyệt đối trước 7 tác nhân virus thực vật khác. Kết quả thử nghiệm trên 60 mẫu thực địa tại Lâm Đồng và Đắk Nông đã phát hiện 38 mẫu đồng nhiễm ToMV và ToMMV, khẳng định tính hiệu quả, độ tin cậy và tiềm năng ứng dụng thực tiễn cao của quy trình trong công tác giám sát dịch bệnh và kiểm định giống cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cà chua (Solanum lycopersicum L.) là một loại rau quả được sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ Nam Mỹ va trở nên phổ biến hơn tại Châu Âu vào cuối thé kỷ 16. Năm 2019, diện tích trồng cà chua trên thế giới là 5,03 triệu ha, với sản lượng 181 triệu tan (FAOSTAT, 2021). Ở Việt Nam, cà chua được trồng và tiêu thụ phổ biến trong nước, trở thành loại rau ăn quả chủ lực nên được Bộ Nông nghiệp va Phát triển Nông thôn (PTNT) ưu tiên phát triển, mở rộng diện tích canh tác. Song song với đó, việc canh tác cả chua gặp không ít khó khăn do bệnh hại gây ra, chủ yếu đến từ các tác nhân như vi khuẩn, nắm, tuyến trùng, phytoplasma và virus.

Bệnh do virus khó phát hiện, ty lệ lây lan cao nên đã ảnh hưởng rất nhiều đến việc trồng trọt và xuất khâu cà chua. Chi 7obzmovirus gây ảnh hưởng kinh tế nặng nề nhất, điển hình là ToMV và ToMMV cùng gây nên triệu chứng khảm trên lá, hạt virus quan sát dưới kính hiển vi có hình thái khó phân biệt. Do đó, việc xác định loài chính xác, tránh khả năng phản ứng huyết thanh học chéo giữa các loài trong chỉ Tobamovirus gây bệnh trên cà chua nhằm giảm thiệt hại về kinh tế cho người dân là việc ưu tiên hàng đầu. Phương pháp Multiplex RT — PCR là phương pháp khuếch đại nhiều trình tự DNA trong cùng một phản ứng PCR bằng cách sử dụng nhiều primer nên đáp ứng được tat cả các yêu cầu trên, thời gian thực hiện ngắn và tiết kiệm hóa chất so với các kỹ thuật như RT-PCR, ELISA.

Chính vì thế, đề tài “ Xây dựng quy trình phát hiện ToMV (Tomato mosaic virus) và ToMMV (7omafo mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT — PCR” được thực hiện. Mục tiêu nghiền cứu Xây dựng được quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) va ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bằng kỹ thuật Multiplex RT - PCR và ứng dụng thành công quy trình trên mẫu thực dia. Nội dung nghiên cứu Xây dụng và chuẩn hóa quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) và ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bang kỹ thuật Multiplex RT — PCR. 1 Ap dụng quy trình phát hiện virus ToMV (Tomato mosaic virus) và ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) bang kỹ thuật Multiplex RT — PCR trên mẫu thực địa.

TONG QUAN TÀI LIEU 2. Tống quan về cây cà chua 2. Phan loại khoa học Giới (Regnum): Plantae Ngành (Phylum): Anthophyta Lớp (Class): Magnoliopsida Lớp phụ (Subclass): Asteridae Bộ (Ordo): Solanales Ho (Familia): Solanaceae Phan ho (Subfamilia): Solanoideae Tông (Tribus): Solaneae Chi (Genus): Solanum Loai (Species): Solanum lycopersicum Phân loại cà chua là một van đề gây tranh cãi nhất từ trước đến nay. Cà chua thuộc họ Solanaceae cùng với các cây trồng kinh tế quan trọng khác như tiêu, cà tím và khoai tây dựa trên sự giống nhau giữa lá và hoa.

Năm 1753, cà chua được Carl Linnaeus xếp vào chi Solanum với tên gọi Solanum lycopersicum L. Tuy nhiên vào năm 1768, Philip Miller đã xếp nó vào chi Lycopersicon và đặt tên là Lycopersicon esculentum. Việc phân loại theo chi Lycopersicon được duy trì bởi các nhà thực vật học như Muller (1940), Correll (1962), Symon (1981), D'Arcy (1991), Hunziker (2001). Tuy nhiên Wettstein (1891), Macbride (1962), Seithe (1962), Fosberg (1987) lai sử dụng phân loại theo chi Solanum.

Các nghiên cứu da tiến hành phân tích bộ gen lạp thể và thấy rằng cà chua có họ hàng rất gần với khoai tây nên được xem là một phần của chi Solanum (Darwin va ctv, 2003). Phần lớn các nhà khoa học đã chap nhận và tái tích hợp ca chua vào chi Solanum như Caicedo và Schaal (2004), Mueller và ctv (2005) với đặc điểm của chi này là cây hằng niên hoặc lưu niên, tự thụ phan, hoa có màu vàng tươi, bao phan hợp nhất chạy đọc theo các mép, lá có dang chân chim (Knapp và ctv, 2016). Nguồn gốc và phân bố Việc xác định chính xác nguồn gốc cà chua là một van đề gây tranh cãi trong khi hơn nhiều thế kỷ trước, cà chua được trồng trong các vườn trải dài từ Kazakstan đến California. Theo học thuyết về trung tâm phát sinh cây trồng của Vavilov, xác định được bờ biển phía tây của Nam Mỹ, thuộc Peru là nơi phát sinh đầu tiên.

Pham vi hiện tại của ho hàng ca chua hoang dã kéo dai từ mũi phía bắc của Chile ở phía nam, đến Ecuador ở phía bắc và đến nội địa từ Thái Bình Dương 100 đặm - 200 đặm, bao gồm cả quần đảo Galapogos. Cà chua được thuần hóa đầu tiên ở Trung Mỹ qua các bằng chứng về văn hóa, ngôn ngữ và di truyền được khai quật bởi các nhà khảo cô học. Họ đã tìm thấy ghi chép về công thức chế biến cà chua như một món salad. Ngoài ra, người Aztec ở Trung Mỹ gọi cà chua là “xitomatl” với một số bộ lạc hoang đã gọi nó là “tomati”.

Người Tay Ban Nha đã có công rat lớn trong việc phân phối ca chua khắp thuộc địa của họ ở vùng biển Caribbean vào đầu thé ki XVI. Họ cũng đưa nó đến Philippines, từ đó di chuyên đến Đông Nam Á và sau đó là toàn bộ lục địa châu Á. Người Tây Ban Nha cũng mang cà chua đến châu Âu, cụ thể vào năm 1544 ở Ý dưới tên gọi là pomo d’oro. Năm quốc gia san xuất cà chua hang dau thé giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý và Án Độ.

Ở Hoa Kỳ, Florida, California và Georgia là những bang sản xuất thương mại hàng dau, với khoảng 200 dặm vuông được canh tác vào năm 1997. Dự kiến con số này sẽ tiếp tục tăng do những lợi ích sức khỏe được cho là có liên quan đến ca chua trong chế độ ăn kiêng. Ở Việt Nam cà chua được trồng chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hà Bắc, Hải Phòng.) và ở miền Nam (Lâm Đồng, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh,. Giá trị cà chua 2.

Giá trị dinh dưỡng Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao. Trong số các loại rau, củ, quả dùng làm rau thì cà chua là thực phẩm chứa vitamin, chất khoáng nhiều chat và có hoạt tính sinh học mạnh mẽ rất có lợi cho sức khỏe. Theo các nhà dinh dưỡng, người trưởng thành hằng ngày chỉ cần sử dụng từ 100 g — 200 g cà chua chín đã cung cấp đủ yêu câu về vitamin và khoáng chât của cơ thê. Theo Tạ Thu Cúc (1985), hàm lượng Vitamin C trong quả tươi chiếm 17 mg - 35,7 mg.

Trọng lượng chất khô dao động 5% - 6%, trong đó đường dé tan chiếm 3%, axit hữu cơ 0,5%, xenlulo 0,84%, chất keo 0,13%, protein 0,95%, lipit thô 0,2%, chất khoáng 0,6% (Nguyễn Viết Khoa, 2012). Thành phần dinh dưỡng trong 100g cà chua ăn được Thanh phân Hàm lượng Thành phân Hàm lượng Nước 94g Vitamin C 40 mg Năng lượng 20 kcal Vitamin BỊ 0,06 mg Protein 0,6 g Vitamin B5 0,089 mg Lipid 0,2 g Vitamin E 0,54 mg Glucid 4g Vitamin K 7,9 ng Celluloza 0,8 g Folat 15 ug Đường tổng số 2,63 g Calci 12mg Sắt 1,40 mg Beta — caroten 393 ug Magie 15 mg Alpha — caroten 112 pg Phospho 26 mg Lycopen 3025 ug Kali 275 mg Lutein + Zeaxanthin 130 pg Phytosterol 7mg Tryptophan 7mg Acid aspartic 104 mg Acid glutamic 269 mg Phenylalanin 16 mg Glycin 16 mg (Nguon: VFCT— VDD, 2007) Cà chua đem lại nhiều lợi ich cho sức khỏe con người như cải thiện thị lực, làm sáng da, hỗ trợ giảm lượng đường trong máu, giúp ngủ ngon, giữ xương chắc khỏe, hỗ trợ trị các bệnh mạn tính, tốt cho mái tóc, giúp giảm cân. Theo Đông y, cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, giúp thông tiểu tiện và tiêu hóa tốt, chống hoại huyết, kháng khuẩn, dùng ngoài để chữa trứng cá, mụn nhọt, viêm tay và dùng lá dé trị vết đốt của sâu bo. Cà chua đặc biệt chứa nhiều lycopene va carotenoid, nhất là trong vỏ của cà chua chín, hai hợp chất thực vật này có liên quan đến việc cải thiện sức khỏe tim mạch, hỗ trợ ngăn ngừa ung thư và chống lại cháy nắng.

Vào năm 2012, Taveira và ctv đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học của những sản phẩm phụ cà chua có chứa phenolics, carotenoids và alkaloids có tác dụng kiểm soát bệnh Alzheimer va đái tháo đường, cũng như tác dụng gây độc tế bào ung thư dạ dày và khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa. Tuy nhiên, các thông số sinh hóa trong các sản phẩm phụ cà chua như hạt và vỏ phụ thuộc vào giống cây trồng và vùng trồng trọt. Ở vỏ, mức độ các hợp chất phenolic, vitamin C và carotenoid bị ảnh hưởng bởi vùng canh tác là nặng nhất nhưng tiềm năng dinh dưỡng từ hạt vẫn rất cao bởi các đa dạng chất béo mà không bi ảnh hưởng đáng kể bởi vùng sản xuất và giống cây trồng (Kabore và ctv, 2022). Giá trị kinh tế Qua cà chua chứa nhiều dưỡng chất quan trọng với các vitamin nhóm A,C và lycopen, có thé ăn tươi hoặc chế biến món ăn, nước uống, làm sốt hoặc mứt.

Ngoài ra, hat ca chua còn có thé chiết tách lay dầu nên luôn là mặt hàng có giá trị kinh tế cao. Tính đến năm 1980, sản lượng cả chua trên toàn thế giới là 50,1 triệu tấn, trong đó Châu Âu chiếm 29,1%, Châu A 23,6%, Bắc Trung Mỹ 18,3%, Châu Phi 10,2%, Nam Mỹ 5,9% và các nước khác là 12,9% (Hoell và ctv, 1983). Lượng cà chua trao đổi trên thị trường thé giới năm 1999 là 36,7 tan trong đó cà chua được dùng ở dạng ăn tươi chỉ 5% - 7%. Từ năm 2020 đến năm 2021, xuất khâu cà chua tăng 5,23% từ 9,82 ty USD lên 10,3 tỷ USD.

Thương mại cà chua chiếm 0,00049% tông thương mai thé giới và là sản phẩm được giao dịch nhiều thứ 350 trên thé giới (Đài quan sát mức độ phức tạp kinh tế OEC, 2021). Năm 2021, đã ghi nhận mức giá ca chua cao kỷ lục lên đến 65.000 đồng/kg và tình trạng khan hiếm kéo đài trong những tháng cuối năm. Vào 9 tháng đầu năm 2022, xuất khẩu cà chua đạt 172 nghìn tan với tổng giá trị lên đến 182 nghìn USD và tăng 36,3% sao với cùng kỳ năm 2021 (Bộ Công Thương, 2023). Tình hình canh tác và sản xuất cà chua ở Việt Nam và trên thế giới 2.

Tình hình canh tác và sản xuất cà chua trên thế giới Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (2014), diện tích trồng cây cà chua, sản lượng cũng như năng suất tăng qua các năm. Năm 2008 diện tích trồng cà chua là 4.179 ha với sản lượng 141. Năm 2010 điện tích tăng lên 4.761 ha với sản lượng 152.674 tấn đem lại giá trị 71,1 tỉ đô la.