Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis Tại Trường Đại Học Mở TP.HCM

Khám phá cách nhân giống lan hồ điệp phalaenopsis sp hiệu quả, từ kỹ thuật đến chăm sóc, giúp cây phát triển khỏe mạnh và bền lâu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thục Chi
• Người hướng dẫn: Th.S. Lương Thị Mỹ Ngân
• Trường học: Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Môi Trường – Nông Nghiệp
• Đề tài: Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis Tại Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Loại tài liệu: luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2001 – 2005
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN HOÀ ĐIỆP PHALAENOPSIS
• 1.1.1. Giới thiệu sơ lược về cây lan Hoà Điệp Phalaenopsis sp
• 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố
• 1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của cây
• 1.1.4. Đặc điểm sinh trưởng
• 1.1.5. Kỹ thuật nhân giống Phalaenopsis
• 1.1.5.1. Nhân giống truyền thống
• 1.1.5.2. Nhân giống hữu tính bằng hạt
• 1.1.5.3. Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết
• 1.1.5.4. Vi nhân giống Phalaenopsis
• 1.1.5.5. Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh
• 1.1.5.6. Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis
• 1.1.5.7. Tái sinh PLB Phalaenopsis từ nhiều nguồn mô
• 1.1.5.8. Tạo mô sẹo
• 1.1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy mô lan
• 1.1.6.1. Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin
• 1.1.6.2. Một số chất điều hòa sinh trưởng, dịch chiết quả cây và than hoạt tính
• 1.1.6.3. Ảnh hưởng của pH
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.4. Điều kiện nuôi cấy
• 2.5. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy
• 2.6.1.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.1.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.1.3. Chỉ tiêu theo dõi
• 2.6.2. Thí nghiệm 2: Tạo chồi từ chồi ngủ phát hoa
• 2.6.2.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.2.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.3. Thí nghiệm 3: Tạo PLB (Protocom – Like Body) từ lá của chồi có nguồn gốc từ phát hoa
• 2.6.3.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.3.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.4. Thí nghiệm 4: Tạo PLB và cụm chồi từ chồi ngọn của chồi in-vitro có nguồn gốc từ phát hoa
• 2.6.4.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.4.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.5. Thí nghiệm 5: Tạo chồi từ PLB
• 2.6.5.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.5.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự hình thành rễ của chồi lan
• 2.6.6.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.6.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.6.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát sự phát triển của cây lan con in-vitro ngoài vườn ươm
• 2.6.7.1. Mục đích thí nghiệm
• 2.6.7.2. Phương pháp thí nghiệm
• 2.7. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy
• 3.2. Thí nghiệm 2: Tạo chồi từ chồi ngủ phát hoa
• 3.3. Thí nghiệm 3: Tạo PLB (Protocorm-Like Body) từ lá của chồi có nguồn gốc từ phát hoa
• 3.4. Thí nghiệm 4: Tạo PLB và cụm chồi từ chồi ngọn của chồi Hoà Điệp in-vitro
• 3.5. Thí nghiệm 5: Tạo chồi từ PLB
• 3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự hình thành rễ của chồi lan con
• 3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát sự phát triển của cây lan con in-vitro ngoài vườn ươm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis

Nghiên cứu giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis tại Trường Đại Học Mở TP.HCM mang lại cái nhìn tổng quan về sự phát triển và ứng dụng của giống lan này trong nông nghiệp. Lan Hồ Điệp không chỉ nổi bật với vẻ đẹp mà còn có giá trị kinh tế cao. Việc nghiên cứu giống lan này giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường.

1.1. Đặc Điểm Sinh Thái Của Lan Hồ Điệp Phalaenopsis

Lan Hồ Điệp Phalaenopsis có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới, với đặc điểm sinh thái đa dạng. Chúng thường phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ẩm ướt và ánh sáng vừa phải, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây.

1.2. Lịch Sử Phát Triển Giống Lan Hồ Điệp

Giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis đã được phát hiện từ thế kỷ 18 và nhanh chóng trở thành một trong những loại lan phổ biến nhất trên thế giới. Sự lai tạo và phát triển giống mới đã tạo ra hàng ngàn biến thể với màu sắc và hình dáng khác nhau.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis cũng gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như điều kiện khí hậu, sâu bệnh và kỹ thuật trồng trọt là những yếu tố cần được giải quyết để nâng cao hiệu quả sản xuất.

2.1. Vấn Đề Về Điều Kiện Khí Hậu

Điều kiện khí hậu không ổn định có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của lan Hồ Điệp. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều có thể làm giảm chất lượng hoa và năng suất cây trồng.

2.2. Sâu Bệnh Và Cách Phòng Ngừa

Sâu bệnh là một trong những thách thức lớn trong việc trồng lan Hồ Điệp. Việc phát hiện sớm và áp dụng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả là rất cần thiết để bảo vệ cây trồng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis

Để nghiên cứu giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis, Trường Đại Học Mở TP.HCM đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao chất lượng giống mà còn tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Kỹ Thuật Nhân Giống In Vitro

Kỹ thuật nhân giống in-vitro là phương pháp chính được sử dụng để tạo ra giống lan Hồ Điệp. Phương pháp này giúp sản xuất số lượng lớn cây con với chất lượng đồng đều và nhanh chóng.

3.2. Thí Nghiệm Về Điều Kiện Nuôi Cấy

Các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, độ ẩm và dinh dưỡng được thực hiện để tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát triển của lan Hồ Điệp.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp

Nghiên cứu giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis không chỉ dừng lại ở lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Việc áp dụng các kỹ thuật mới trong trồng trọt giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

4.1. Tăng Cường Giá Trị Kinh Tế

Việc phát triển giống lan Hồ Điệp chất lượng cao giúp tăng cường giá trị kinh tế cho người trồng. Sản phẩm không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn có khả năng xuất khẩu.

4.2. Bảo Tồn Giống Lan Quý

Nghiên cứu giống lan Hồ Điệp cũng góp phần vào việc bảo tồn các giống lan quý hiếm, giúp duy trì đa dạng sinh học và bảo vệ môi trường.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis

Nghiên cứu giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis tại Trường Đại Học Mở TP.HCM đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp. Những kết quả đạt được không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn sản xuất.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Giống Lan

Tương lai của nghiên cứu giống lan Hồ Điệp hứa hẹn sẽ tiếp tục phát triển với nhiều công nghệ mới. Việc áp dụng công nghệ sinh học sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng giống.

5.2. Khuyến Khích Nghiên Cứu Thêm

Cần khuyến khích các nghiên cứu thêm về giống lan Hồ Điệp để tìm ra những giải pháp mới, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là một trong những giống phong lan thương mại giá trị bậc nhất trên thị trường hoa cảnh quốc tế, nổi bật với thời gian hoa tươi kéo dài từ 3 đến 4 tháng và số lượng trung bình từ 7 đến 15 hoa trên mỗi phát hoa. Hiện nay, thế giới đã ghi nhận khoảng 60 loài nguyên thủy và hơn 40.000 giống lan lai được đăng ký, tạo nên phân khúc tiêu thụ vô cùng sôi động cả ở thị trường nội địa lẫn xuất khẩu hoa cắt cành.

Tuy nhiên, lan Hồ Điệp thuộc nhóm thực vật đơn thân sinh trưởng theo chiều cao, không có giả hành nên khả năng tự đẻ nhánh ngoài tự nhiên vô cùng hạn chế. Phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt thường tạo ra quần thể cây con phân ly mạnh, không đồng nhất về mặt di truyền, thời gian quả chín kéo dài từ 130 đến 150 ngày và bắt buộc phải có nấm cộng sinh hoặc môi trường dinh dưỡng chuyên biệt để nảy mầm. Mặt khác, phương pháp tách chiết vô tính truyền thống chỉ tạo ra khoảng 2 đến 3 cây con mỗi năm từ một cây mẹ, hệ số nhân quá thấp và dễ gây tổn thương nghiêm trọng đến cây giống gốc.

Để giải quyết triệt để rào cản này, nghiên cứu tập trung xây dựng quy trình vi nhân giống in vitro hoàn chỉnh cho lan Hồ Điệp từ nguồn mẫu phát hoa mang chồi ngủ. Mục tiêu trọng tâm là xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp, công thức phối hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật tối ưu cho từng giai đoạn tái sinh chồi, tạo thể chồi giả hạt (Protocorm-Like Body - PLB), kích thích ra rễ và thuần dưỡng ngoài vườn ươm. Đề tài được triển khai thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Bán công Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2004 đến tháng 11 năm 2005. Kết quả của nghiên cứu đóng vai trò then chốt trong việc chuẩn hóa công nghệ sản xuất cây giống đồng đều, sạch bệnh với tỷ lệ sống sót đạt trên 86%, phục vụ đắc lực cho các nhà vườn và trang trại quy mô công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên thuyết toàn năng của tế bào thực vật do Gottlieb Haberlandt khởi xướng, kết hợp cùng mô hình tương tác hormone kinh điển của Folke Skoog và Carlos Miller (1957). Theo nguyên lý này, sự phát sinh hình thái của mô thực vật trong điều kiện vô trùng chịu sự điều khiển trực tiếp bởi tỷ lệ cân bằng giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin. Khi tỷ lệ auxin/cytokinin cao, mô có xu hướng cảm ứng sinh rễ; khi tỷ lệ này thấp, mô chuyển sang kích thích hình thành chồi thân; và khi tỷ lệ xấp xỉ cân bằng, mô tế bào sẽ tăng sinh tạo khối mô sẹo chưa biệt hóa.

Bên cạnh đó, đề tài ứng dụng sâu rộng các khái niệm học thuật chuyên ngành:

• Thể chồi giả hạt (Protocorm-Like Body - PLB): Cấu trúc phát sinh cơ quan trung gian đặc thù ở họ Lan, mang tiềm năng phôi vô tính với khả năng tái sinh chồi và rễ đồng loạt với hệ số nhân giống vượt trội.
• Chồi ngủ phát hoa (Floral nodal bud): Nguồn mẫu cấy sơ cấp lý tưởng chứa các mô phân sinh đỉnh có sức sống cao, cho phép nhân giống vô tính mà không làm tổn hại đến đỉnh sinh trưởng của cây mẹ.
• Hiện tượng hóa nâu do hợp chất phenol: Quá trình oxy hóa dịch tiết từ vết cắt mô cấy ra môi trường gây độc tế bào, được kiểm soát nhờ bổ sung than hoạt tính với nồng độ 1 g/l và nước dừa tự nhiên từ 15% đến 20%.

Về mặt sinh thái, lan Hồ Điệp sinh trưởng thích hợp ở biên độ nhiệt từ 24 đến 35°C và nhu cầu che bóng khoảng 70%, đòi hỏi điều kiện vi khí hậu phòng nuôi cấy phải được kiểm soát nghiêm ngặt.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu là các đoạn phát hoa mang chồi ngủ thu thập từ cây lan Hồ Điệp trưởng thành tại Công ty Lâm Thăng (quận Bình Thạnh, TP.HCM), cùng các mẫu lá non kích thước 5 x 5 mm và chồi ngọn từ cây in vitro 8 đến 12 tuần tuổi. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng để tuyển chọn các mắt ngủ ở vị trí thứ 4 và thứ 5 tính từ đỉnh phát hoa xuống, nhằm tối ưu hóa khả năng tái sinh mô phân sinh. Cỡ mẫu thực nghiệm được thiết kế đồng bộ với 30 đến 45 mẫu cấy cho mỗi nghiệm thức xử lý.

Môi trường nền tảng được lựa chọn là môi trường Knudson C (KD) cải tiến, phối chế cùng khoáng vi lượng Heller 5 ml/l, Fe-EDTA Murashige & Skoog 4 ml/l, vitamin Morel 2 ml/l, bổ sung 2 mg/l Glycin, 100 mg/l Myo-inositol, 5 mg/l Vitamin B1, 60 g/l khoai tây nghiền, 200 ml/l nước dừa, 30 g/l đường saccharose, 7 g/l agar và 1 g/l than hoạt tính. Chỉ số pH của môi trường được hiệu chuẩn chuẩn xác trong khoảng 5,5 đến 5,6 trước khi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 30 phút.

Phòng nuôi cấy duy trì ổn định nhiệt độ 27 ± 2°C, độ ẩm 70% đến 80%, cường độ ánh sáng 2000 đến 3000 Lux với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày. Toàn bộ các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần độc lập. Dữ liệu định lượng về tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ sống, số chồi trung bình, số lượng PLB và chiều dài rễ được thu thập định kỳ và phân tích thống kê thông qua phần mềm MSTATC nhằm bảo đảm tính khách quan và độ tin cậy khoa học cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận nhiều kết quả mang tính đột phá cho từng công đoạn trong chuỗi vi nhân giống lan Hồ Điệp:

Khử trùng mẫu phát hoa ban đầu: Xử lý đoạn phát hoa bằng dung dịch Calcium hypochlorite Ca(OCl)2 ở nồng độ 10% trong thời gian 30 phút mang lại hiệu quả vượt trội với 86,1% mẫu cấy sống khỏe mạnh, hoàn toàn không bị nhiễm nấm hay vi khuẩn sau 1 tuần. Ngược lại, nồng độ Ca(OCl)2 8% trong 25 phút khiến 100% mẫu cấy bị nhiễm trùng hoại tử, trong khi nồng độ cao 12% trong 30 phút làm cháy mô cấy do độc tính hóa chất, khiến tỷ lệ mẫu sống sót tái sinh chỉ đạt 11,1%.

Tái sinh chồi từ chồi ngủ phát hoa: Môi trường KD bổ sung 1 mg/l NAA phối hợp cùng 7 mg/l BA (nghiệm thức KD4) kích thích khả năng tạo chồi mạnh nhất, đạt trung bình 4,33 ± 0,3 chồi dinh dưỡng trên mỗi mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. Con số này cao hơn 333% so với môi trường đối chứng không chứa hormone chỉ tạo được 1,0 chồi/mẫu. Tuy nhiên, khi nâng nồng độ BA lên 10 mg/l (KD5), số chồi giảm xuống còn 2,33 ± 0,3 chồi/mẫu và xuất hiện hiện tượng chồi bị ức chế, hóa nâu dần.

Cảm ứng tạo thể chồi giả hạt (PLB) từ mô lá in vitro: Mảnh lá non kích thước 5 x 5 mm nuôi cấy trên môi trường KD8 chứa 1 mg/l NAA, 5 mg/l BA và 10 mg/l Adenin sau 10 tuần (gồm 2 tuần đầu ủ tối) đã hình thành trung bình 13 ± 2 PLB trực tiếp từ đỉnh lá. Ở nghiệm thức KD9 (1 mg/l NAA, 7 mg/l BA, 10 mg/l Adenin), số lượng đạt 9 ± 2 PLB/mẫu nhưng phân bố tại thân lá. Tỷ lệ mẫu lá cảm ứng tạo PLB đạt khoảng 5% và chỉ xuất hiện ở các mô lá non còn giữ nguyên tiềm năng phân bào.

Ra rễ và thuần dưỡng ngoài vườn ươm: Chồi in vitro hoàn chỉnh cấy chuyển sang môi trường bổ sung 0,5 mg/l NAA kết hợp 1 mg/l Adenin đạt tỷ lệ ra rễ 100%, rễ phát triển mập mạp với chiều dài từ 3 đến 5 cm, chiều cao cây đạt 3 đến 5 cm với 2 đến 4 lá xanh dày sau 10 tuần. Cây con chuyển ra vườn ươm trồng trên giá thể than củi vụn phối trộn dớn, kết hợp chế độ phun sương định kỳ 5 đến 6 giờ/lần, đạt tỷ lệ sống sót thực tế trên 88% sau 8 tuần chăm sóc.

Thảo luận kết quả

Cơ chế sinh lý điều hòa hình thái: Sự tương tác giữa nồng độ BA tăng dần từ 1 mg/l đến 7 mg/l với 1 mg/l NAA cố định đã giải phóng chồi bên khỏi hiện tượng ưu thế đỉnh, thúc đẩy quá trình phân chia tế bào mô phân sinh diễn ra mạnh mẽ. Mặc dù vậy, ngưỡng nồng độ BA vượt quá 7 mg/l gây ra phản ứng ngộ độc hormone, làm rối loạn cân bằng nội sinh và thúc đẩy tổng hợp hợp chất phenol gây đen mô. Sự hiện diện của Adenin ở nồng độ 10 mg/l hoạt động như một tiền chất purine tăng cường hoạt tính của cytokinin, xúc tác hiệu quả cho sự chuyển hóa các tế bào biểu bì lá non thành các thể PLB đa năng.

Mô tả trực quan dữ liệu: Phổ dữ liệu khử trùng có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ đường cong hình chuông, thể hiện mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ Ca(OCl)2 (8% - 10% - 12%) và tỷ lệ mẫu sạch bệnh (tăng vọt từ 0% lên đỉnh 86,1% rồi sụt giảm nhanh về 11,1%). Đồng thời, bảng số liệu so sánh các nghiệm thức tạo chồi chỉ ra rõ nét sự cách biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức KD4 (4,33 chồi) với nghiệm thức đối chứng KD (1,0 chồi), minh chứng cho sự tối ưu hóa của công thức phối chế hormone.

So sánh với y văn quốc tế: Kết quả tạo 13 PLB/mẫu lá non hoàn toàn tương thích với các nghiên cứu của Park và cộng sự (thu được 10 đến 13 PLB/mẫu lá trên nền môi trường MS bổ sung 88,8 µM BA và 5,4 µM NAA). Nghiên cứu cũng củng cố kết luận của Tanaka khi chứng minh mô lá lấy từ cây trưởng thành hầu như không có khả năng phát sinh PLB do đã biệt hóa hoàn toàn, trong khi mô lá non sinh ra từ nuôi cấy in vitro vẫn duy trì tính toàn năng xuất sắc.

Đề xuất và khuyến nghị

Chuẩn hóa quy trình khử trùng và tuyển chọn vật liệu khởi đầu: Ban hành quy trình kỹ thuật cố định việc thu thập chồi ngủ ở vị trí thứ 4 và thứ 5 trên phát hoa lan Hồ Điệp, xử lý bằng Ca(OCl)2 10% trong đúng 30 phút. Mục tiêu cụ thể là duy trì tỷ lệ mẫu cấy vô trùng và sống sót đạt từ 85% đến 90% ngay trong 7 ngày đầu. Thời gian triển khai áp dụng trong vòng 3 tháng do các kỹ thuật viên phòng nuôi cấy mô phụ trách.

Ứng dụng công thức hormone tối ưu hóa hệ số nhân chồi và PLB: Triển khai môi trường KD4 (KD + 1 mg/l NAA + 7 mg/l BA) cho giai đoạn nhân nhanh chồi nhằm đạt hiệu suất trên 4 chồi/mẫu/chu kỳ 4 tuần, đồng thời sử dụng môi trường KD8 (KD + 1 mg/l NAA + 5 mg/l BA + 10 mg/l Adenin) để cảm ứng tạo PLB từ phiến lá non. Mục tiêu kỳ vọng là nâng tỷ lệ tạo PLB lên trên 20% và tạo ra hơn 500 cây con sạch bệnh từ một phát hoa ban đầu. Lộ trình thực hiện kéo dài 6 tháng do các phòng thí nghiệm giống cây trồng làm chủ lực.

Cải tiến chế độ vi khí hậu và giá thể thuần dưỡng vườn ươm: Hoàn thiện quy trình luyện cây con xuất vườn khi đạt chiều cao từ 3 đến 5 cm và hệ rễ dài 3 đến 5 cm, sử dụng giá thể hỗn hợp than củi đập vụn kết hợp dớn mềm tiệt trùng, tích hợp hệ thống tưới phun sương tự động chu kỳ 5 đến 6 giờ/lần. Mục tiêu nâng tỷ lệ cây con sống sót và thích nghi ngoài vườn ươm lên trên 95% sau 8 tuần ra ngôi. Thời gian thực hiện liên tục trong 12 tháng tại các vườn ươm nông nghiệp.

Mở rộng nghiên cứu hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS): Đầu tư nâng cấp công nghệ nuôi cấy lỏng thoáng khí và bioreactor nhằm tăng sinh khối PLB dạng huyền phù, cắt giảm chi phí agar và hạn chế tối đa công lao động cấy chuyển thủ công. Mục tiêu dài hạn là giảm 35% giá thành sản xuất mỗi cây giống thương phẩm và nâng công suất cung ứng lên 100.000 cây giống/năm. Timeline kéo dài từ 18 đến 24 tháng do các viện nghiên cứu chuyên ngành phối hợp với doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Kỹ sư và cán bộ nghiên cứu công nghệ sinh học nông nghiệp: Tiếp cận một quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh từ khâu xử lý phát hoa, kỹ thuật cảm ứng PLB từ tế bào lá non đến công thức phối chế khoáng vi lượng và chất điều hòa sinh trưởng, phục vụ công tác nghiên cứu chuyên sâu về sinh lý học thực vật và nhân giống các loài lan quý hiếm.

Chủ trang trại và nhà vườn trồng hoa lan quy mô thương mại: Khai thác giải pháp kỹ thuật nhân giống vô tính nhằm tự chủ nguồn cây con chất lượng cao, bảo đảm tính đồng nhất 100% về màu sắc và kích thước hoa, loại bỏ nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh virus, từ đó gia tăng sản lượng hoa thương phẩm phục vụ thị trường trong nước và xuất khẩu.

Giảng viên và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nông học: Sử dụng công trình như một tài liệu tham khảo học thuật chuẩn mực về phương pháp bố trí thí nghiệm đa yếu tố trong nuôi cấy mô thực vật, kỹ thuật phân tích phương sai bằng phần mềm MSTATC và kỹ năng xử lý các phản ứng sinh hóa của mô cấy in vitro.

Doanh nghiệp đầu tư nông nghiệp công nghệ cao: Tham khảo các thông số kỹ thuật thực nghiệm để xây dựng báo cáo khả thi, thiết kế dây chuyền phòng lab nuôi cấy mô công nghiệp, tối ưu hóa chi phí giá thành và hoạch định chiến lược sản xuất giống lan Hồ Điệp đạt chuẩn thương mại quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nên nhân giống lan Hồ Điệp từ chồi ngủ phát hoa thay vì sử dụng chồi đỉnh của cây mẹ? Lan Hồ Điệp là loài đơn thân sinh trưởng từ một đỉnh duy nhất, nếu cắt chồi đỉnh sẽ phá hủy hoàn toàn cây mẹ quý giá. Khai thác chồi ngủ trên trục phát hoa vừa tận dụng được nguồn mô phân sinh sung mãn, vừa giữ nguyên vẹn cây mẹ và duy trì chính xác 100% các đặc tính di truyền ưu việt của giống gốc.

Nồng độ chất khử trùng nào mang lại tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh cao nhất? Xử lý phát hoa bằng dung dịch Calcium hypochlorite Ca(OCl)2 nồng độ 10% trong thời gian 30 phút là nghiệm thức tối ưu nhất, mang lại tỷ lệ mẫu sống khỏe mạnh và sạch khuẩn đạt 86,1%. Nồng độ 8% khiến toàn bộ mẫu bị nhiễm nấm khuẩn, trong khi nồng độ 12% làm chết mô cấy do ngộ độc hóa chất.

Công thức hormone nào kích thích nhân chồi từ mắt ngủ phát hoa đạt hiệu suất cao nhất? Môi trường Knudson bổ sung 1 mg/l NAA kết hợp 7 mg/l BA mang lại kết quả vượt trội với trung bình 4,33 chồi dinh dưỡng trên một mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. Việc nâng nồng độ BA lên 10 mg/l sẽ gây ức chế sinh trưởng và khiến số chồi giảm mạnh xuống còn 2,33 chồi/mẫu.

Điều kiện tiên quyết nào giúp cảm ứng thành công thể chồi giả hạt PLB từ mô lá lan? Mẫu cấy bắt buộc phải là phiến lá non lấy từ cây con in vitro kích thước 5 x 5 mm, được cấy trên môi trường KD bổ sung 1 mg/l NAA, 5 mg/l BA và 10 mg/l Adenin, trải qua 2 tuần nuôi cấy trong tối trước khi đưa ra ánh sáng. Công thức này giúp tạo trung bình 13 PLB trên mỗi mẫu lá non.

Làm thế nào để bảo đảm cây con in vitro đạt tỷ lệ sống cao khi chuyển ra vườn ươm? Cây giống xuất vườn cần đạt chiều cao từ 3 đến 5 cm với bộ rễ khỏe dài 3 đến 5 cm và mang 2 đến 4 lá xanh. Sau khi rửa sạch môi trường agar, cây phải được trồng trên giá thể than củi vụn kết hợp dớn mềm và duy trì tưới phun sương định kỳ 5 đến 6 giờ/lần để đạt tỷ lệ sống trên 88%.

Kết luận

• Xác lập quy trình khử trùng phát hoa đạt tỷ lệ sống sạch khuẩn tối ưu 86,1% bằng dung dịch Ca(OCl)2 10% trong 30 phút.
• Xác định môi trường nhân chồi tốt nhất là KD bổ sung 1 mg/l NAA và 7 mg/l BA với năng suất đạt 4,33 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy.
• Cảm ứng thành công 13 thể PLB trên mỗi mẫu lá non in vitro trên môi trường KD chứa 1 mg/l NAA, 5 mg/l BA và 10 mg/l Adenin.
• Kích thích tạo rễ hoàn chỉnh và thuần dưỡng cây con ngoài vườn ươm trên giá thể than dớn, đạt tỷ lệ sống sót thực tế trên 88% sau 8 tuần.
• Luận văn đóng góp một quy trình công nghệ sinh học hoàn chỉnh, mở ra giải pháp chủ động sản xuất hàng loạt cây giống lan Hồ Điệp chất lượng cao, đồng đều di truyền và sạch bệnh.

Trong 6 đến 12 tháng tới, các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp giống cần đẩy mạnh chuẩn hóa quy trình nuôi cấy lỏng thoáng khí và hoàn thiện chuỗi chuyển giao công nghệ ra vườn ươm. Hãy chủ động liên hệ và ứng dụng quy trình vi nhân giống tiên tiến này vào thực tiễn sản xuất nhằm tối đa hóa năng suất và nâng tầm thương hiệu hoa phong lan thương phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP.HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi: VI NHAÂN GIOÁNG LAN HOÀ ÑIEÄP (Phalaenopsis sp.) LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: MOÂI TRÖÔØNG – NOÂNG NGHIEÄP Giaûng vieân höôùng daãn : Th.S LÖÔNG THÒ MYÕ NGAÂN Sinh vieân thöïc hieän : NGUYEÃN THÒ THUÏC CHI Khoùa hoïc : 2001 – 2005 TP. HOÀ CHÍ MINH – THAÙNG 3/2006 LÔØI CAÛM ÔN  Thôøi gian 4 naêm ñaïi hoïc ñaõ keát thuùc, vôùi söï dìu daét cuûa caùc thaày coâ, nay baøi luaän vaên cuûa toâi ñaõ ñöôïc hoaøn thaønh. Toâi xin toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán Th. Löông Thò Myõ Ngaân ñaõ taän tình chæ baûo, giuùp ñôõ ñeå toâi coù theå hoaøn thaønh toát ñeà taøi naøy.

Beân caïnh ñoù, toâi xin göûi lôøi tri aân ñeán Th. Nguyeãn Thanh Mai, Vaên phoøng khoa Coâng Ngheä Sinh Hoïc vaø Ban giaùm hieäu,cuøng toaøn theå thaày coâ tröôøng Ñaïi Hoïc Môû Baùn Coâng TP. HCM ñaõ ñaøo taïo, boài döôõng cho toâi kieán thöùc vaø taïo moïi ñieàu kieän ñeå toâi coù theå thöïc hieän ñeà taøi naøy. Toâi xin chaân thaønh caûm ôn caùc anh, caùc baïn trong phoøng Nuoâi caáy moâ thöïc vaät, toaøn theå caùc baïn sinh vieân cuøng lôùp vaø caùc baïn sinh vieân soáng chung trong Löu Xaù ñaõ giuùp ñôõ vaø cuøng toâi chia seû nhöõng nieàm vui cuõng nhö noãi buoàn trong thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi.

Vaø cuoái cuøng, toâi xin kính daâng leân OÂng Noäi, Ba Maù, caùc Sr vaø nhöõng ngöôøi thaân yeâu nhöõng tình caûm thieâng lieâng nhaát, loøng bieát ôn vaø söï thaønh kính vì ñaõ luoân yeâu thöông, quan taâm, chaêm soùc vaø ñoàng haønh cuøng toâi trong cuoäc soáng. Saøi Goøn, ngaøy 10 thaùng 3 naêm 2006. Nguyeãn thò Thuïc Chi MUÏC LUÏC Trang Danh muïc baûng. i Danh muïc hình aûnh.

ii Chöõ vieát taét. iii Lôøi môû ñaàu. iv PHAÀN 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU. TOÅNG QUAN VEÀ CAÂY LAN HOÀ ÑIEÄP PHALAENOPSIS.

Giôùi thieäu sô löôïc veà caây lan Hoà Ñieäp Phalaenopsis sp. Nguoàn goác vaø phaân boá. Ñaëc ñieåm caáu taïo cuûa caây. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng.

KYÕ THUAÄT NHAÂN GIOÁNG PHALAENOPSIS. Nhaân gioáng truyeàn thoáng. Nhaân gioáng höõu tính baèng haït. Nhaân gioáng voâ tính baèng caùch taùch chieát.

Vi nhaân gioáng Phalaenopsis. Nhaân gioáng voâ tính söû duïng choài ñænh. Taùi sinh choài töø phaùt hoa Phalaenopsis. Taùi sinh PLB Phalaenopsis töø nhieàu nguoàn moâ.

Taïo moâ seïo. MOÄT SOÁ YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG TRONG NUOÂI CAÁY MOÂ LAN. Taùc duïng phoái hôïp cuûa auxin vaø cytokinin. Moät soá chaát ñieàu hoaø sinh tröôûng, dòch chieát quaû caây vaø than hoaït tính.

AÛnh höôûng cuûa pH. 19 PHAÀN 2: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP. Ñịa ñieåm vaø thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi. Ñoái töôïng nghieân cöùu.

Moâi tröôøng nuoâi caáy. Ñieàu kieän nuoâi caáy. Duïng cuï,ï trang thieát bò vaø hoaù chaát. Phöông phaùp.

Thí nghieäm 1: Khöû truøng maãu caáy. Muïc ñích thí nghieäm. Phöông phaùp thí nghieäm. Chæ tieâu theo doõi.

Thí nghieäm 2: Taïo choài töø choài nguû phaùt hoa. Muïc ñích thí nghieäm. Phöông phaùp thí nghieäm. Thí nghieäm 3: Taïo PLB (Protocom – Like Body) töø laù cuûa choài coù nguoàn goác töø phaùt hoa.

Muïc ñích thí nghieäm. Phöông phaùp thí nghieäm. Thí nghieäm 4: Taïo PLB vaø cuïm choài töø choài ngoïn cuûa choài in-vitro coù nguoàn goác töø phaùt hoa. Muïc ñích thí nghieäm.

Phöông phaùp thí nghieäm. Thí nghieäm 5: Taïo choài töø PLB. Muïc ñích thí nghieäm. Phöông phaùp thí nghieäm.

Thí nghieäm 6: Khaûo saùt söï hình thaønh reã cuûa choài lan.1 Muïc ñích thí nghieäm .2 Phöông phaùp thí nghieäm .7 Thí nghieäm 7: Khaûo saùt söï phaùt trieån cuûa caây lan con in-vitro ngoaøi vöôøn öôm. Muïc ñích thí nghieäm. Phöông phaùp thí nghieäm. Xöû lyù soá lieäu.

32 PHAÀN 3: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN. Thí nghieäm 1: Khöû truøng maãu caáy. Thí nghieäm 2: Taïo choài töø choài nguû phaùt hoa. Thí nghieäm 3: Taïo PLB (Protocorm-Like Body) töø laù cuûa choài coù nguoàn goác töø phaùt hoa.

Thí nghieäm 4: Taïo PLB vaø cuïm choài töø choài ngoïn cuûa choài Hoà Ñieäp in-vitro. Thí nghieäm 5: Taïo choài töø PLB. Thí nghieäm 6: Khaûo saùt söï hình thaønh reã cuûa choài lan con. Thí nghieäm 7: Khaûo saùt söï phaùt trieån cuûa caây lan con in-vitro ngoaøi vöôøn öôm.

50 PHAÀN 4: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ. 52 PHAÀN 5: TAØI LIEÄU THAM KHAÛO. 53 PHUÏ LUÏC Khoùa luaän toát nghieäp Danh muïc baûng DANH MUÏC BAÛNG  Baûng 1: Kí hieäu nghieäm thöùc khöû truøng maãu caáy Baûng 2: Moâi tröôøng khaûo saùt söï taïo choài dinh döôõng töø choài nguû phaùt hoa Baûng 3: Moâi tröôøng khaûo saùt söï hình thaønh PLB töø laù cuûa choài in-vitro Baûng 4: Moâi tröôøng khaûo saùt söï hình thaønh PLB vaø cuïm choài töø choài ngoïn cuûa choài in-vitro coù nguoàn goác töø phaùt hoa Baûng 5: Moâi tröôøng khaûo saùt söï hình thaønh choài töø PLB Baûng 6: Moâi tröôøng khaûo saùt söï hình thaønh reã cuûa choài con Baûng 7: Tæ leä phaàn traêm choài soáng khoûe maïnh vaø khoâng bò nhieãm ôû caùc noàng ñoä Ca(OCl)2 vaø thôøi gian khöû truøng khaùc nhau Baûng 8: AÛnh höôûng cuûa söï phoái hôïp caùc chaát ÑHSTTV leân khaû naêng hình thaønh choài töø choài nguû phaùt hoa sau 4 tuaàn nuoâi caáy Baûng 9: AÛnh höôûng cuûa söï phoái hôïp caùc chaát ÑHSTTV leân söï hình thaønh PLB töø laù cuûa choài in-vitro coù nguoàn goác töø phaùt hoa sau 10 tuaàn nuoâi caáy Baûng 10: AÛnh höôûng cuûa söï phoái hôïp caùc chaát ÑHSTTV leân söï hình thaønh PLB vaø cuïm choài töø choài ngoïn cuûa choài in-vitro coù nguoàn goác töø phaùt hoa sau 10 tuaàn nuoâi caáy Baûng 11: AÛnh höôûng cuûa söï phoái hôïp caùc chaát ÑHSTTV leân söï hình thaønh choài töø protocorm-like body (PLB) sau 10 tuaàn nuoâi caáy Baûng 12: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät leân söï hình thaønh reã ôû caùc choài sau 10 tuaàn nuoâi caáy Nguyeãn Thò Thuïc Chi i Khoùa luaän toát nghieäp Danh muïc baûng DANH MUÏC HÌ NH AÛNH  Hình 1. Hoa (a) vaø Caùnh moâi (b) cuûa Phalaenopsis sp.

Caùc loaïi hoa lan Hoà Ñieäp. Hoa Phalaenopsis sp. Thí nghieäm khöû truøng maãu phaùt hoa lan Hoà Ñieäp Phalaenopsis. Thí nghieäm taïo choài töø choài nguû phaùt hoa treân moâi tröôøng KD coù boå sung NAA, BA.

Thí nghieäm taïo PLB töø laù cuûa choài in-vitro treân moâi tröôøng KD coù boå sung NAA, BA. Thí nghieäm taïo PLB vaø cuïm choài töø choài ngoïn in-vitro. Thí nghieäm taïo cuïm choài töø PLB sau 10 tuaàn nuoâi caáy treân moâi tröôøng KD coù boå sung NAA, BA. Thí nghieäm taïo cuïm choài töø PLB sau 10 tuaàn nuoâi caáy treân moâi tröôøng KD coù boå sung NAA, BA, Adenin.

Thí nghieäm taïo cuïm choài töø PLB sau 10 tuaàn nuoâi caáy treân moâi tröôøng KD coù boå sung BA, IBA. Thí nghieäm ra reã sau 10 tuaàn nuoâi caáy treân moâi tröôøng KD coù boå sung NAA, BA, Adenin. Caây lan con Phalaenopsis in-vitro ngoaøi vöôøn öôm. Quy trình nhaân gioáng lan Hoà Ñieäp Phalaenopsis.

Nguyeãn Thò Thuïc Chi ii Khoùa luaän toát nghieäp Danh muïc baûng CHÖÕ VIEÁT TAÉT  BA : 6 – benzylaminopurine NAA : α - naphthaleneacetic acid IBA : Indol – 3 butyric acid PLB : Protocorm – Like Body KD : Knudson MS : Murashige vaø Skoog (1962) ÑHSTTV : Ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät Nguyeãn Thò Thuïc Chi iii Khoùa luaän toát nghieäp Lôøi môû ñaàu LÔØI MÔÛ ÑAÀU  Trong theá giôùi caùc loaøi hoa, hoa phong lan laø moät trong nhöõng loaøi hoa ñeïp kyø laï nhaát. Hoa lan bieåu töôïng cho caùi thieän, caùi ñeïp tinh khieát vaø thanh cao cuûa con ngöôøi. Trong ñoù hoa lan Hoà Ñieäp cuõng ñöôïc xem laø loaøi phong lan coù veû ñeïp kyø dieäu, thanh nhaõ vaø quí phaùi. Hoà ñieäp khoâng chæ coù hoa ñeïp, maøu saéc phong phuù maø coøn raát laâu taøn, thôøi gian hoa töôi treân caây keùo daøi 3 - 4 thaùng , trung bình treân moãi phaùt hoa coù töø 7 -15 hoa.

Ñoù laø tính chaát hôn haún cuûa phong lan Hoà Ñieäp so vôùi caùc loaïi phong lan khaùc, giuùp cho Hoà Ñieäp coù giaù trò kinh teá cao ôû trong nöôùc cuõng nhö ôû nöôùc ngoaøi. Ñaëc bieät lan Hoà Ñieäp laïi sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát ôû ñieàu kieän khí haäu Vieät Nam. Khaû naêng sinh caây con cuûa lan Hoà Ñieäp laø raát thaáp vì ñaây laø loaøi lan ñôn thaân (caây taêng tröôûng theo chieàu cao), thöôøng nhaân gioáng loaøi lan naøy baèng phöông phaùp gieo haït trong nuoâi caáy in-vitro. Tuy nhieân, caây moïc leân töø nhöõng haït naøy thöôøng khoâng ñoàng nhaát veà tính traïng, caây lôùn khoâng ñeàu vaø laâu troå hoa.

Nhaân gioáng voâ tính in-vitro laø phöông phaùp duy nhaát hieän nay coù khaû naêng khaéc phuïc ñöôïc nhöõng nhöôïc ñieåm treân. Hieän nay, thò tröôøng tieâu thuï hoa trong nöôùc ngaøy moät taêng, trong ñoù hoa lan Hoà Ñieäp cuõng goùp phaàn ñaùng keå. Hoà Ñieäp khoâng chæ ñaùp öùng nhu caàu tieâu thuï trong nöôùc, maø coøn coù theå xuaát khaåu döôùi daïng caét caønh nhôø nhöõng ñaëc tính quyù nhö ñeïp vaø laâu taøn, daãn ñeán soá löôïng gioáng khoâng ñuû cung caáp cho caùc nhaø troàng lan. Ñeå ñaùp öùng nhu caàu naøy, phöông phaùp nhaân gioáng in-vitro ñaõ ñöôïc öùng duïng vaøo quaù trình nhaân gioáng caây hoa lan Hoà Ñieäp.

Vì phöông phaùp Nguyeãn Thò Thuïc Chi iv Khoùa luaän toát nghieäp Lôøi môû ñaàu naøy taïo ra soá löôïng caây con lôùn, nhanh, vaø ñaûm baûo ñöôïc tính traïng ñoàng nhaát, ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu xuaát khaåu. Do ñoù, chuùng toâi tieán haønh caùc thí nghieäm “vi nhaân gioáng lan Hoà Ñieäp” taïi phoøng Nuoâi caáy moâ tröôøng Ñaïi Hoïc Môû Baùn Coâng TP HCM vôùi muïc ñích tìm ra ñöôïc moâi tröôøng vaø ñieàu kieän toái öu ñeå nhaân nhanh caùc gioáng lan Hoà Ñieäp, phuïc vuï muïc ñích nuoâi troàng hoa lan cuûa caùc nhaø vöôøn ñeå ñaùp öùng nhu caàu thò tröôøng. Nguyeãn Thò Thuïc Chi v Khoùa luaän toát nghieäp Toång quan taøi lieäu PHAÀN 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1. TOÅNG QUAN VEÀ CAÂY LAN HOÀ ÑIEÄP PHALAENOPSIS 1.

Giôùi thieäu sô löôïc veà caây lan Hoà Ñieäp Phalaenopsis sp Vò trí phaân loaïi Giôùi : Plantae Thöïc vaät Ngaønh : Magnoliophyta Ngoïc Lan Lôùp : Liliopsida Haønh Phaân lôùp : Liliidae Haønh Boä : Orchidales Lan Hoï : Orchidaceae Lan Lan Hoà Ñieäp ñöôïc tìm thaáy vaøo naêm 1750, ñaàu tieân ñöôïc oâng Rumphius xaùc ñònh döôùi teân laø Angraecum album. Maõi ñeán naêm 1753, Linne ñoåi laïi laø Epidendrum amabile [11]. Vaøo naêm 1825, nhaø Thöïc vaät hoïc ngöôøi Haø Lan Blume phaùt hieän moät loaøi lan Hoà Ñieäp coù hoa gioáng caùnh böôùm. Töø ñoù Lan Hoà Ñieäp coøn ñöôïc goïi laø Phalaenopsis.

Teân Phalaenopsis xuaát phaùt töø tieáng Hy Laïp: “phalaina” (con böôùm ñeâm) vaø “opsis” (troâng gioáng nhö), nghóa laø moät loaøi hoa coù hình daùng nhö böôm böôùm [8]. Naêm 1887, loaøi Hoà Ñieäp lai ñaàu tieân ñöôïc J. Veitch ñaêng kyù vôùi teân P. harriettiae, töø vieäc keát hôïp giöõa P.