Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng arachis pintoi

Nano bạc đã trở thành một trong những giải pháp hiệu quả trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các loại nấm gây hại. 98 trang · Trường Đại Học Mở TP.HCM · 2019.

• Tác giả: Lê Thị Bích Hằng
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Đánh Giá Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Việc Chống Lại Nấm Neoscytalidium sp. Gây Bệnh Đốm Nâu Trên Cây Thanh Long
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây thanh long
• 1.2. Bệnh đốm nâu trên cây thanh long
• 1.2.1. Tình trạng bệnh
• 1.2.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.2.3. Triệu chứng bệnh
• 1.2.4. Cách phòng bệnh
• 1.2.4.1. Biện pháp canh tác
• 1.2.4.2. Sử dụng giống sạch bệnh
• 1.2.4.3. Biện pháp sinh học
• 1.2.4.4. Biện pháp hóa học
• 1.3. Kỹ thuật định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR)
• 1.3.1. Định nghĩa PCR
• 1.3.2. Vùng ITS5 - ITS4 rDNA
• 1.4. Tổng quan về nano bạc (AgNPs)
• 1.4.1. Lợi ích của nano bạc
• 1.4.2. Tính chất chung của nano bạc
• 1.4.3. Khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm của nano bạc
• 1.4.4. Các phương pháp tổng hợp nano bạc
• 1.4.4.1. Phương pháp hóa học
• 1.4.4.2. Phương pháp vật lý
• 1.4.4.3. Phương pháp hóa lý
• 1.5. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh
• 1.6. Tổng quan về cỏ đậu phộng
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu
• 1.6.1.1. Trên thế giới
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Môi trường, hóa chất, thuốc nhuộm
• 2.4. Phương pháp thí nghiệm
• 2.4.1. Kiểm tra, tái phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp. Định danh sinh học phân tử
• 2.4.2. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (kế thừa qui trình tổng hợp nano bạc từ Viện Công nghệ Hóa học)
• 2.4.3. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (AgNPs)
• 2.4.4. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, ly tâm tạo dung dịch nano bạc đậm đặc 1/10 dung dịch nano bạc ban đầu (AgNPs dd - nano bạc đậm đặc)
• 2.4.5. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, bổ sung KMnO4 ((2Ag-1Mn)NPs)
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả kiểm tra chủng nấm Neoscytalidium sp. Kết quả định danh sinh học phân tử
• 3.2. Kết quả giải trình tự
• 3.3. Kết quả tổng hợp nano bạc
• 3.4. Kết quả định tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 3.5. Kết quả định lượng kháng nấm của 3 mẫu nano bạc qua từng ngày
• 3.5.1. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs dd qua 5 ngày
• 3.5.2. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs qua 5 ngày
• 3.5.3. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs qua 5 ngày
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc đã trở thành một trong những giải pháp hiệu quả trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các loại nấm gây hại. Đặc biệt, tác dụng của nano bạc trong việc chống lại nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long đang được nghiên cứu sâu rộng. Nghiên cứu cho thấy nano bạc không chỉ có khả năng kháng khuẩn mà còn kháng nấm, giúp bảo vệ cây trồng một cách an toàn và hiệu quả.

1.1. Lợi Ích Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp, bao gồm khả năng kháng vi sinh vật và tăng cường sức đề kháng cho cây trồng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc trong nông nghiệp có thể giúp giảm thiểu sự phát triển của nấm gây hại, từ đó nâng cao năng suất cây trồng.

1.2. Tính Chất Kháng Khuẩn Của Nano Bạc

Tính kháng khuẩn của nano bạc được xác định là do khả năng phá hủy màng tế bào của vi khuẩn và nấm. Điều này giúp chống nấm Neoscytalidium sp. hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho cây thanh long.

II. Vấn Đề Bệnh Đốm Nâu Trên Cây Thanh Long

Bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra đang trở thành mối đe dọa lớn đối với cây thanh long tại Việt Nam. Tình trạng bệnh ngày càng gia tăng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc tìm kiếm giải pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh là rất cần thiết.

2.1. Triệu Chứng Của Bệnh Đốm Nâu

Triệu chứng của bệnh đốm nâu bao gồm các vết tròn nhỏ trên thân và quả, dẫn đến thối mục. Những vết bệnh này có thể lan rộng nhanh chóng nếu không được kiểm soát kịp thời.

2.2. Tác Nhân Gây Bệnh

Nấm Neoscytalidium dimidiatum là tác nhân chính gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Nấm này phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, làm tăng nguy cơ lây lan bệnh trong các vườn thanh long.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Nano Bạc Bằng Phương Pháp Sinh Học

Phương pháp tổng hợp nano bạc bằng sinh học sử dụng dịch chiết từ cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả. Phương pháp này không chỉ an toàn mà còn thân thiện với môi trường, giúp tạo ra nano bạc có khả năng kháng nấm tốt.

3.1. Quy Trình Tổng Hợp Nano Bạc

Quy trình tổng hợp nano bạc bao gồm việc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định. Phương pháp này giúp tạo ra các hạt nano bạc có kích thước nhỏ và đồng đều.

3.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp Sinh Học

Phương pháp sinh học giúp giảm thiểu các sản phẩm phụ độc hại, đồng thời tiết kiệm năng lượng so với các phương pháp hóa học truyền thống. Điều này làm cho nano bạc trong nông nghiệp trở thành lựa chọn tối ưu.

IV. Hiệu Quả Của Nano Bạc Trong Việc Chống Lại Nấm Neoscytalidium sp

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium sp. một cách hiệu quả. Kết quả thử nghiệm cho thấy nano bạc có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh trên cây thanh long.

4.1. Kết Quả Thử Nghiệm Kháng Nấm

Kết quả thử nghiệm cho thấy nano bạc có thể ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium sp. với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp. Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng nấm của nano bạc là rất cao.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nano Bạc

Việc ứng dụng nano bạc trong thực tiễn có thể giúp nông dân kiểm soát bệnh đốm nâu một cách hiệu quả, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm thanh long.

V. Kết Luận Về Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc là một giải pháp tiềm năng trong việc chống lại nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Việc áp dụng nano bạc không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

5.1. Tương Lai Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Tương lai của nano bạc trong nông nghiệp hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp mới cho việc kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt là trong bối cảnh biến đổi khí hậu và sự gia tăng của các loại nấm gây hại.

5.2. Khuyến Nghị Nghiên Cứu Thêm

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc và đánh giá hiệu quả lâu dài của nó trong việc bảo vệ cây trồng, nhằm đảm bảo an toàn cho sức khỏe con người và môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thanh long là loại cây ăn quả nhiệt đới thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), chi Hylocereus, có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao. Tại Việt Nam, vùng sản xuất thanh long tập trung chủ yếu ở ba tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Trong đó, Bình Thuận có diện tích lớn nhất cả nước với 26.026 ha (diện tích cho thu hoạch đạt 21.349 ha), sản lượng hàng năm vượt mức 550.000 tấn. Tuy nhiên, sự biến đổi thời tiết thất thường tại các vùng chuyên canh, điển hình như huyện Hàm Thuận Bắc (Bình Thuận), đã tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh đốm nâu bùng phát và lây lan nhanh chóng. Thống kê tại Hàm Thuận Bắc cho thấy có trên 74 ha thanh long nhiễm bệnh với tỷ lệ 5 - 10%, tập trung nghiêm trọng ở những vườn thoát nước kém và vệ sinh không triệt để.

Bệnh đốm nâu xuất hiện rải rác tại Bình Thuận từ năm 2008, sau đó lây lan mạnh vào mùa mưa năm 2012 với diện tích gần 1.000 ha (tỷ lệ nhiễm nặng trên 10% chiếm hơn 80%). Đến tháng 6/2013, diện tích nhiễm bệnh đã lên tới gần 3.000 ha, tỷ lệ gây hại từ 20 đến 50%. Tính đến tháng 7/2015, toàn tỉnh Bình Thuận ghi nhận 6.846 ha thanh long nhiễm bệnh, gây sụt giảm nghiêm trọng giá trị thương phẩm của quả và năng suất cây trồng. Tác nhân chính gây bệnh đốm nâu được xác định là vi nấm Neoscytalidium dimidiatum. Để kiểm soát mầm bệnh, nhà vườn chủ yếu sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học (như Nativo, RidomilGold, Cabrio Top). Việc lạm dụng thuốc hóa học bộc lộ nhiều nhược điểm: không triệt để ngăn chặn nguồn nấm, gây hiện tượng kháng thuốc, làm suy thoái hệ sinh thái nông nghiệp và để lại dư lượng độc hại đối với sức khỏe con người.

Trước thực trạng đó, hướng nghiên cứu sử dụng hạt nano bạc (AgNPs) nổi lên như một giải pháp thay thế tiềm năng nhờ hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm phổ rộng. Tuy nhiên, các phương pháp tổng hợp nano bạc truyền thống còn tồn tại hạn chế: phương pháp hóa học sử dụng các chất khử độc hại, tạo nhiều sản phẩm phụ gây ô nhiễm môi trường; phương pháp vật lý đòi hỏi thiết bị phức tạp và tiêu tốn nhiều năng lượng. Việc ứng dụng phương pháp hóa học xanh (Green synthesis/Biosynthesis) sử dụng dịch chiết thực vật làm tác nhân khử và chất ổn định giúp khắc phục triệt để các rào cản này. Cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) là loài thực vật họ Đậu (Fabaceae), sinh trưởng mạnh, dễ tìm kiếm, chứa hàm lượng dồi dào các hợp chất tự nhiên như polyphenol và flavonoid có khả năng khử ion $Ag^+$ thành $Ag^0$ và duy trì độ bền của hệ keo nano.

Đề tài đặt ra mục tiêu tạo sản phẩm nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh từ dịch chiết cỏ đậu phộng nhằm ức chế vi nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên thanh long, đóng góp cơ sở thực nghiệm cho biện pháp phòng trừ sinh học thân thiện với môi trường. Khóa luận triển khai 4 nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Kiểm tra, tái phân lập và định danh sinh học phân tử chủng nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long.
2. Tổng hợp hạt nano bạc kích thước nhỏ có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium sp. bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm chất khử và chất ổn định.
3. Đánh giá định tính khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp. của các mẫu nano bạc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
4. Đánh giá định lượng khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp. của các mẫu nano bạc thông qua việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên đĩa thạch.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm chủng vi nấm Neoscytalidium sp. (phân lập từ cành thanh long nhiễm bệnh) và các dạng dung dịch nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết cỏ đậu phộng. Phạm vi thời gian thực hiện kéo dài từ tháng 2/2019 đến tháng 5/2019. Không gian nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Trường Đại học Mở TP.HCM - Cơ sở 3, TP. Thủ Dầu Một, Bình Dương) và Phòng Dầu khí - Xúc tác (Viện Công nghệ Hóa học, Quận 1, TP.HCM); các phép phân tích TEM được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Nanocomposit (Trường Đại học Bách khoa TP.HCM); dịch vụ giải trình tự gen do Công ty TNHH TBR thực hiện.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên các cơ sở lý thuyết vi sinh vật học thực vật, sinh học phân tử và hóa học nano:

• Bệnh học thực vật và vi nấm Neoscytalidium dimidiatum: Nấm thuộc ngành Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botryosphaeriales, họ Botryosphaeriaceae, chi Neoscytalidium. Nấm gây hại trên cả cành và quả thanh long với triệu chứng ban đầu là các chấm nhỏ li ti hơi lõm màu trắng (sau 3 - 4 ngày), chuyển sang chấm màu cam có quầng vàng bao quanh (sau 10 - 20 ngày), sau đó phát triển thành các đốm nổi màu nâu sần sùi (sau 18 - 20 ngày).
• Định danh sinh học phân tử bằng mã vạch DNA: Khuếch đại vùng gen phiên mã nội bộ ribosome ITS rDNA (Internal Transcribed Spacer) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt ITS5 - ITS4. Vùng gen này có kích thước khoảng 700 nucleotide, bao gồm cả hai tiểu phần ITS1 và ITS2 xen giữa các đoạn gen mã hóa rRNA (18S, 5.8S và 28S), có mức độ đa hình và bảo tồn thích hợp để định danh chính xác nấm đến cấp độ loài.
• Bản chất và cơ chế kháng vi sinh vật của nano bạc: Hạt nano bạc có kích thước từ 1 đến 100 nm, diện tích bề mặt riêng lớn và mang hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (SPR). Cơ chế kháng vi sinh vật của ion $Ag^+$ và nano bạc bao gồm: phá vỡ tính toàn vẹn màng tế bào, liên kết với peptidoglycan, làm bất hoạt tiểu đơn vị ribosome và các enzyme chuỗi hô hấp tế bào, cản trở quá trình tổng hợp ATP, cũng như làm mất khả năng sao chép của DNA.
• Hóa học xanh tổng hợp vật liệu nano: Phản ứng khử ion bạc $Ag^+$ từ tiền chất muối bạc nitrate ($AgNO_3$) thông qua các hợp chất có nhóm chức mang tính khử (như polyphenol, flavonoid trong dịch chiết thực vật) qua quá trình chuyển đổi anthraquinone keto-enol dưới tác động của nhiệt độ và bức xạ ánh sáng, đồng thời các phân tử hữu cơ đóng vai trò bao bọc bề mặt hạt, chống lại sự kết tụ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế đồng bộ qua các giai đoạn:

Giai đoạn nghiên cứu	Phương pháp / Kỹ thuật thực tế	Hóa chất, thiết bị và công cụ xử lý
Vi sinh & hình thái	Tái phân lập, cấy đơn bào tử trên môi trường PDA; nhuộm tế bào bằng lactophenol; quan sát kính hiển vi quang học (vật kính 40X); đo kích thước bào tử bằng trắc vi thị kính; đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.	Môi trường PDA, dung dịch lactophenol, NaCl 0,85%, Tween 80 0,05%, kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu.
Sinh học phân tử	Giải trình tự DNA theo nguyên lý Sanger đối với đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi ITS5 - ITS4; đối chiếu dữ liệu trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST; dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Parsimony.	Dịch vụ giải trình tự Công ty TNHH TBR, cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI), phần mềm sinh học phân tử MEGA 7.
Tổng hợp nano bạc	Chiết xuất cỏ đậu phộng ở 70°C trong 120 phút (tỷ lệ 1:10 w/v); khử muối bạc dưới bức xạ đèn mô phỏng ánh sáng mặt trời ở 40°C trong 120 phút; ly tâm làm giàu nồng độ (5000 vòng/phút, 30 phút); biến tính bề mặt bằng $KMnO_4$.	Cỏ đậu phộng tươi, $AgNO_3$, $KMnO_4$, nước cất, máy khuấy từ, đèn chiếu sáng nhân tạo, máy ly tâm, máy đánh siêu âm.
Đặc trưng hóa lý	Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trong dải bước sóng thích hợp; quan sát vi cấu trúc, hình thái và kích thước hạt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.	Máy quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis Shimadzu UV-1800; kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 (Jeol USA).
Thử nghiệm sinh học	Thử nghiệm định tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (giếng đục 6 mm, nạp 70 µL dung dịch nano bạc, ủ 28°C trong 3 - 5 ngày); thử nghiệm định lượng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên đĩa thạch PDA pha các nồng độ nano bạc khác nhau, theo dõi 5 ngày.	Đĩa petri thạch PDA, que cấy tăm bông vô trùng, dụng cụ đục lỗ thạch 6 mm, tủ ấm vi sinh 28°C, phần mềm thống kê Statgraphics Plus.

Nguồn dữ liệu trong nghiên cứu gồm chủng nấm bệnh gốc cung cấp bởi PTN Công nghệ Vi sinh (Đại học Mở TP.HCM), sinh khối cỏ đậu phộng thu thập tại công viên khu dân cư Hiệp Thành III (Bình Dương), kết quả đo phổ phân tích từ máy UV-1800 và ảnh vi cấu trúc từ thiết bị TEM JEM 1400.

Nội dung chính theo từng phần

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến cây thanh long, tình hình gây hại của bệnh đốm nâu, cơ sở sinh học phân tử định danh nấm và tổng quan về công nghệ nano bạc:

• Phân tích nguồn gốc, đặc điểm thực vật học và giá trị thương phẩm của ba loài thanh long thương mại thuộc chi Hylocereus và một loài thuộc chi Selenicereus.
• Tổng hợp diễn biến dịch bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum trên thế giới (Malaysia, Israel, Trung Quốc) và tại các vựa thanh long trọng điểm của Việt Nam (Bình Thuận, Tiền Giang, Long An).
• Phân loại học nấm N. dimidiatum và cấu trúc vùng gen ITS rDNA; nêu rõ vùng ITS5 - ITS4 bao gồm đoạn 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 và 28S, có mức độ bảo tồn cao, đủ điểm biến dị để phân tách chính xác đến cấp loài.
• Đánh giá cơ chế diệt vi sinh vật của nano bạc, ưu nhược điểm của các phương pháp điều chế (vật lý, hóa học, hóa lý); phân tích triển vọng của phương pháp hóa học xanh dùng dịch chiết thực vật, đặc biệt là nguồn polyphenol và flavonoid từ cỏ đậu phộng (Arachis pintoi).
• Lược khảo các nghiên cứu kháng nấm thực vật bằng nano bạc: Lamsal và cs. (2011) ức chế nấm Colletotrichum ở nồng độ 100 ppm; Sang Woo Kim và cs. (2012) thử nghiệm trên 18 chủng nấm bệnh; Kaur và cs. (2012) dùng hạt nano Ag/Chitosan; các công bố trong nước của Lê Quang Luân và cs. (2014) trên Phytophthora capsici, Nguyễn Hoài Châu và cs. (2017) trên Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, Nguyễn Duy Hạng và cs. (2017) trên Puccinia spp.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, bố trí thí nghiệm và các tiêu chuẩn kiểm tra:

• Mô tả quy trình tái phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp. từ nguồn mẫu có sẵn, kỹ thuật tạo khuẩn lạc thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử trên đĩa thạch PDA, quan sát hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm giọt ép lactophenol.
• Quy trình định danh phân tử: gửi mẫu sinh khối nấm tinh sạch đến Công ty TNHH TBR để giải trình tự đoạn gen ITS5 - ITS4 bằng phương pháp Sanger; phân tích BLAST trên NCBI và dựng cây phát sinh loài Maximum Parsimony bằng phần mềm MEGA 7.
• Quy trình tổng hợp 3 hệ mẫu nano bạc bằng dịch chiết cỏ đậu phộng:
  • Mẫu AgNPs: 40 mL dung dịch $AgNO_3$ 2,5 mM phối trộn 10 mL dịch chiết cỏ đậu phộng, khuấy 300 vòng/phút trong 5 phút, ủ quang hóa dưới đèn mặt trời nhân tạo ở 40°C trong 120 phút.
  • Mẫu AgNPs dd (đậm đặc): 40 mL dung dịch $AgNO_3$ 1,75 mM phối trộn 10 mL dịch chiết cỏ đậu phộng, tổng hợp tương tự, sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ phần dịch nổi, thu hồi dịch cặn đáy có thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu, kết hợp đánh sóng siêu âm làm tan khối bám dính.
  • Mẫu (2Ag - 1Mn)NPs: 40 mL hỗn hợp muối gồm $AgNO_3$ 2,5 mM và $KMnO_4$ 1,75 mM (tỷ lệ thể tích 2 phần bạc : 1 phần mangan) phối trộn 10 mL dịch chiết cỏ đậu phộng, xử lý quang hóa ở 40°C trong 120 phút.
• Phương pháp khảo sát hóa lý hạt nano: đo phổ hấp thụ UV-Vis trên máy UV-1800 và chụp hiển vi điện tử truyền qua TEM trên thiết bị JEM 1400.
• Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro: phương pháp khuếch tán giếng thạch (bơm 70 µL mẫu nano vào giếng thạch 6 mm trên nền thạch chứa mật độ bào tử nấm $1 - 2 \times 10^6$ tế bào/mL, đối chứng bằng nước cất vô trùng, ủ 28°C trong 3 - 5 ngày) và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên đĩa thạch PDA qua 5 ngày theo dõi.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm, minh chứng qua hệ thống bảng và hình ảnh trích xuất:

• Đặc điểm hình thái chủng nấm: Nuôi cấy trên môi trường PDA cho thấy hệ sợi nấm dạng lông mịn, tản nấm ban đầu màu xám nâu, lan nhanh chiếm kín đĩa petri sau 3 ngày nuôi cấy. Từ ngày thứ 4 bắt đầu sinh sắc tố đen và đạt độ đồng nhất vào ngày thứ 5. Dưới kính hiển vi quang học (vật kính 40X), sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh và tự đứt đoạn tạo thành các bào tử đốt; bào tử có hình trứng, que ngắn hoặc hình tròn. Kích thước bào tử đo được có chiều dài từ 14 đến 24 µm và chiều rộng từ 8 đến 10 µm, phù hợp với các mô tả hình thái của Neoscytalidium dimidiatum.
• Kết quả giải trình tự và phân tích phả hệ phân tử: Trình tự vùng gen ITS5 - ITS4 sau khi giải bằng phương pháp Sanger cho các đỉnh tín hiệu (peaks) sắc nét, không có nhiễu nền. Đối chiếu BLAST trên GenBank (NCBI) xác định trình tự nấm tương đồng 99,67% với trình tự nấm Neoscytalidium dimidiatum mang mã số truy cập KU290343.1, độ bao phủ đạt 99,67% và giá trị $E\text{-value} = 0.0$. Cây phát sinh loài xây dựng bằng thuật toán Maximum Parsimony cho thấy chủng nấm nghiên cứu nằm cùng phân nhánh với loài N. dimidiatum với hệ số lặp lại bootstrap đạt 81%, tách biệt rõ rệt so với các chi ngoại nhóm như Neofusicoccum và họ Botryosphaeriaceae.
• Kết quả tổng hợp và đặc trưng hóa hạt nano bạc: Dung dịch phản ứng sau 120 phút chiếu sáng nhân tạo ở 40°C chuyển từ trong suốt/vàng nhạt sang màu nâu đỏ đặc trưng. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kết quả phân tích quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) xác nhận sự hình thành của các hạt nano bạc hình cầu phân tán đều trong môi trường; mẫu (2Ag - 1Mn)NPs thể hiện độ ổn định phân tán bề mặt tốt nhờ ion permanganate đóng vai trò bảo vệ hệ hạt.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

• Định danh chủng nấm gây bệnh: Chủng nấm gây bệnh đốm nâu thanh long được xác định chính xác là Neoscytalidium dimidiatum dựa trên sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái vi học (bào tử đốt kích thước $14 - 24 \times 8 - 10$ µm) và phân tích trình tự phân tử vùng ITS5 - ITS4 rDNA (độ tương đồng 99,67%, mã số tham chiếu NCBI KU290343.1, bootstrap 81%).
• Chế tạo thành công 3 hệ dung dịch nano bạc xanh: Tổng hợp thành công hệ keo nano bạc hoàn toàn bằng phương pháp sinh học không sử dụng hóa chất độc hại, dựa trên nguồn dịch chiết cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) tỷ lệ chiết 1:10 (w/v) ở 70°C. Ba dạng chế phẩm được tạo ra gồm AgNPs (tổng hợp trực tiếp từ $AgNO_3$ 2,5 mM), AgNPs dd (cô đặc 10 lần qua ly tâm 5000 vòng/phút) và (2Ag - 1Mn)NPs (bổ sung $KMnO_4$ 1,75 mM theo tỷ lệ 2:1 thể tích nhằm tăng cường độ bền phân tán).
• Khả năng ức chế vi nấm: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch chứng minh cả 3 mẫu nano bạc đều hình thành vòng kháng nấm rõ rệt so với giếng đối chứng nước cất vô trùng (không có vòng ức chế). Dữ liệu động học ức chế nấm qua 5 ngày theo dõi MIC trên đĩa thạch được ghi nhận chi tiết, xác định khả năng kìm hãm sự nảy mầm và phát triển sợi nấm của từng công thức chế phẩm.

Tác giả đề xuất giải pháp kỹ thuật sử dụng nano bạc tổng hợp sinh học từ dịch chiết thực vật thay thế dần các dòng thuốc trừ nấm hóa học gốc đồng hoặc hỗn hợp Azoxystrobin + Difenoconazole hiện hành. Đóng góp nổi bật của khóa luận là đã chứng minh tiềm năng tận dụng cỏ đậu phộng—loài cây mọc hoang dại, sinh khối lớn, chi phí thu gom thấp—làm tác nhân khử và chất ổn định hiệu quả để tạo nano kim loại, mở ra hướng ứng dụng công nghệ nano xanh trong quản lý dịch hại nông nghiệp bền vững.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ trên phạm vi và nội dung trình bày trong văn bản khóa luận, nghiên cứu có các giới hạn thực tế sau:

• Toàn bộ các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm Neoscytalidium sp. mới dừng lại ở quy mô in vitro trong phòng thí nghiệm (trên môi trường thạch đĩa petri PDA), chưa tiến hành thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh ex vivo trên cành thanh long cắt rời hoặc in vivo trên cây thanh long ngoài vườn thực địa.
• Chưa khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh thực tế (nhiệt độ ngoài trời, bức xạ ánh sáng mặt trời tự nhiên, độ ẩm cao trong mùa mưa) đến độ bền hóa lý và thời gian lưu giữ hoạt tính kháng nấm của các chế phẩm keo nano bạc sau khi phun lên bề mặt bẹ cành thanh long.
• Khóa luận chưa tiến hành đánh giá độc tính sinh thái của chế phẩm nano bạc tổng hợp đối với hệ vi sinh vật đất có ích và khả năng hấp thu, tồn dư của hạt nano trên quả thanh long ở giai đoạn thu hoạch.

Các hướng phát triển tiếp theo được gợi mở từ giới hạn nghiên cứu bao gồm: mở rộng khảo nghiệm hoạt tính kháng nấm trên mô thực vật sống ngoài đồng ruộng; tối ưu hóa quy trình bảo quản chế phẩm nano bạc để nâng cao hạn sử dụng; nghiên cứu bổ sung các chất bám dính tự nhiên giúp tăng khả năng bám dính của hạt nano trên biểu bì cành thanh long khi gặp mưa.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật và Khoa học Vật liệu.

Các nội dung có giá trị tham chiếu thực nghiệm cao bao gồm:

• Quy trình phân lập, nuôi cấy thuần và kỹ thuật định danh nấm Neoscytalidium dimidiatum bằng cặp mồi phân tử ITS5 - ITS4 kết hợp phân tích cây phát sinh loài trên MEGA 7.
• Thông số công nghệ chi tiết trong quy trình chiết xuất cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) và quy trình tổng hợp nano bạc bằng phương pháp quang hóa (tỷ lệ phối trộn tiền chất, nhiệt độ phản ứng 40°C, thời gian chiếu sáng nhân tạo 120 phút).
• Quy trình thử nghiệm vi sinh đánh giá hoạt tính kháng nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường đĩa thạch.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh long trong khóa luận được định danh là loài nấm nào và mức độ tương đồng di truyền đạt bao nhiêu?
Chủng nấm nghiên cứu được xác định là loài Neoscytalidium dimidiatum dựa trên kết quả giải trình tự đoạn gen ITS5 - ITS4 rDNA, cho độ tương đồng 99,67% (giá trị $E\text{-value} = 0.0$, độ bao phủ 99,67%) so với trình tự chuẩn mang mã số truy cập KU290343.1 trên ngân hàng gen NCBI, với độ tin cậy ủng hộ bootstrap trên cây phả hệ đạt 81%.

2. Điều kiện kỹ thuật để tổng hợp dung dịch nano bạc AgNPs từ dịch chiết cỏ đậu phộng là gì?
Dịch chiết cỏ đậu phộng được chuẩn bị bằng cách xay nhuyễn với nước cất theo tỷ lệ khối lượng 1:10, đun ở 70°C trong 120 phút rồi ly tâm lấy dịch trong. Quá trình tổng hợp hạt nano bạc diễn ra bằng cách phối trộn 40 mL dung dịch $AgNO_3$ 2,5 mM với 10 mL dịch chiết, khuấy 300 vòng/phút trong 5 phút, sau đó duy trì ở nhiệt độ 40°C dưới nguồn chiếu sáng của đèn mặt trời nhân tạo trong thời gian 120 phút.

3. Nghiên cứu đã chế tạo những mẫu nano bạc nào để thử nghiệm hoạt tính kháng nấm?
Tác giả đã điều chế 3 mẫu nano bạc: (1) AgNPs (dung dịch nano bạc tổng hợp trực tiếp với nồng độ tiền chất $AgNO_3$ 2,5 mM); (2) AgNPs dd (dung dịch nano bạc tổng hợp từ $AgNO_3$ 1,75 mM, sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút để thu dịch đậm đặc ở đáy bằng 1/10 thể tích ban đầu); (3) (2Ag - 1Mn)NPs (dung dịch nano bạc tổng hợp có bổ sung muối $KMnO_4$ 1,75 mM theo tỷ lệ thể tích 2 phần $AgNO_3$ : 1 phần $KMnO_4$).

4. Mục đích của việc đưa muối $KMnO_4$ vào quá trình điều chế mẫu (2Ag - 1Mn)NPs là gì?
Theo nội dung khóa luận, việc bổ sung dung dịch $KMnO_4$ vào hỗn hợp phản ứng đóng vai trò như một chất giữ độ bền và hỗ trợ phân tán đều các hạt nano trên bề mặt dung dịch, ngăn chặn sự kết tụ của các hạt nano bạc sau khi hình thành.

5. Hoạt tính kháng vi nấm Neoscytalidium sp. của các mẫu nano bạc được kiểm tra bằng những phương pháp thực nghiệm nào?
Hoạt tính kháng nấm được kiểm tra qua 2 phương pháp: đánh giá định tính khả năng kháng nấm thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch (giếng đục đường kính 6 mm trên đĩa thạch chứa mật độ bào tử $1 - 2 \times 10^6$ tế bào/mL, nạp 70 µL mẫu) và đánh giá định lượng bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên đĩa thạch pha loãng nano bạc kết hợp theo dõi liên tục trong 5 ngày.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Thị Bích Hằng đã xác định chính xác tác nhân gây bệnh đốm nâu thanh long là vi nấm Neoscytalidium dimidiatum thông qua kết hợp đặc điểm hình thái và giải trình tự gen ITS rDNA. Đề tài xây dựng thành công quy trình công nghệ xanh tổng hợp hạt nano bạc từ dịch chiết cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) với ba biến thể công thức chế phẩm ổn định. Các thử nghiệm vi sinh in vitro khẳng định hoạt tính ức chế rõ rệt của hệ hạt nano bạc đối với sự phát triển của nấm bệnh, cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị cho xu hướng phát triển chế phẩm nano sinh học bảo vệ thực vật bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, thanh long được sản xuất tập trung tại 3 tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích thanh long lớn nhất cả nước, với 26.026 ha, với diện tích cho thu hoạch là 21.349 ha và sản lượng thanh long hàng năm của Bình Thuận đạt trên 550.000 (Trần Thị Thu Hà và cs. Huyện Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận là nơi có thời tiết thay đổi thất thường, tạo điều kiện thuận lợi để bệnh đốm nâu phát triển. Toàn huyện hiện có trên 74 ha thanh long nhiễm đốm nâu (tỷ lệ bệnh là 5 - 10%).

Diện tích nhiễm bệnh ngày càng tăng cao qua các tuần, đặc biệt là những vườn năm trước đã bị nhiễm bệnh, vườn không thoát được nước và vệ sinh kém tạo điều kiện phát triển bệnh đốm nâu - một trong số bệnh nặng nhất (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2018). Neoscytalidium dimidiatum được xác định là tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh long (Võ Thị Thu Oanh và cs. Hiện tại các loại thuốc hóa học như Nativo, RidomilGold, Cabrio Top…được sử dụng nhiều nhưng chưa thật sự hiệu quả, còn khiến bệnh ngày càng lan rộng, giảm đa dạng hệ sinh thái nông nghiệp, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới dùng nano bạc trong y học, công nghiệp và đặc biệt là nông nghiệp để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên cây trồng.

Theo nghiên cứu của Ngoc và cs., 2018 đã nghiên cứu chế tạo nano bạc – chitosan ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Việc tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học gây độc hại và tạo ra nhiều sản phẩm phụ, gây ảnh hưởng lớn đến môi trường, trong khi tổng hợp nano bạc bằng phương pháp vật lý lại làm tiêu tốn năng lượng. Khi đó phương pháp hóa học xanh sử dụng các thực thể sinh học như vi sinh vật, chiết xuất thực vật hoặc sinh khối thực vật để sản xuất các hạt nano, giúp khắc khục những hạn chế của phương pháp hóa học và vật lý, thân thiện với môi trường (Ahmed và cs. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) là loại cỏ dại dễ mọc, hơn nữa trong quá trình nghiên cứu đã tìm ra các hợp chất polyphenol, flavonoid… có khả năng làm tác nhân khử và ổn định trong quá trình tổng hợp nano SVTH: Lê Thị Bích Hằng 1 GVHD: ThS.

Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh bạc. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định do cỏ đậu phộng là nguyên liệu dễ tìm thấy, tiết kiệm chi phí sản xuất, tận dụng nguồn tài nguyên sẵn có. Chính vì thế, việc tìm ra phương pháp sản xuất nano bạc thân thiện với môi trường, có khả năng ức chế vi nấm bệnh Neoscytalidium sp.

giúp kiểm soát tình trạng bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng (Arachis pintoi)” nhằm hướng đến tạo ra sản phẩm nano bạc tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh nhằm kiểm soát được bệnh đốm nâu trên cây thanh long và góp phần đưa ra một phương pháp phòng trừ bệnh thân thiện với môi trường. Nội dung nghiên cứu: ⮚ Kiểm tra, tái phân lập và định danh sinh học phân tử nấm Neoscytalidium sp.

gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. ⮚ Tổng hợp hợp nano bạc có kích thước nhỏ có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium sp.