Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng arachis pintoi

Chuyên khảo phân tích Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm neoscytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Lê Thị Bích Hằng
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Đánh Giá Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Việc Chống Lại Nấm Neoscytalidium sp. Gây Bệnh Đốm Nâu Trên Cây Thanh Long
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây thanh long
• 1.2. Bệnh đốm nâu trên cây thanh long
• 1.2.1. Tình trạng bệnh
• 1.2.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.2.3. Triệu chứng bệnh
• 1.2.4. Cách phòng bệnh
• 1.2.4.1. Biện pháp canh tác
• 1.2.4.2. Sử dụng giống sạch bệnh
• 1.2.4.3. Biện pháp sinh học
• 1.2.4.4. Biện pháp hóa học
• 1.3. Kỹ thuật định danh bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR)
• 1.3.1. Định nghĩa PCR
• 1.3.2. Vùng ITS5 - ITS4 rDNA
• 1.4. Tổng quan về nano bạc (AgNPs)
• 1.4.1. Lợi ích của nano bạc
• 1.4.2. Tính chất chung của nano bạc
• 1.4.3. Khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm của nano bạc
• 1.4.4. Các phương pháp tổng hợp nano bạc
• 1.4.4.1. Phương pháp hóa học
• 1.4.4.2. Phương pháp vật lý
• 1.4.4.3. Phương pháp hóa lý
• 1.5. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh
• 1.6. Tổng quan về cỏ đậu phộng
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu
• 1.6.1.1. Trên thế giới
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Môi trường, hóa chất, thuốc nhuộm
• 2.4. Phương pháp thí nghiệm
• 2.4.1. Kiểm tra, tái phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp. Định danh sinh học phân tử
• 2.4.2. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (kế thừa qui trình tổng hợp nano bạc từ Viện Công nghệ Hóa học)
• 2.4.3. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định (AgNPs)
• 2.4.4. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, ly tâm tạo dung dịch nano bạc đậm đặc 1/10 dung dịch nano bạc ban đầu (AgNPs dd - nano bạc đậm đặc)
• 2.4.5. Tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định, bổ sung KMnO4 ((2Ag-1Mn)NPs)
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả kiểm tra chủng nấm Neoscytalidium sp. Kết quả định danh sinh học phân tử
• 3.2. Kết quả giải trình tự
• 3.3. Kết quả tổng hợp nano bạc
• 3.4. Kết quả định tính bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 3.5. Kết quả định lượng kháng nấm của 3 mẫu nano bạc qua từng ngày
• 3.5.1. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs dd qua 5 ngày
• 3.5.2. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu AgNPs qua 5 ngày
• 3.5.3. Kết quả định lượng kháng nấm của mẫu (2Ag – 1Mn)NPs qua 5 ngày
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc đã trở thành một trong những giải pháp hiệu quả trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các loại nấm gây hại. Đặc biệt, tác dụng của nano bạc trong việc chống lại nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long đang được nghiên cứu sâu rộng. Nghiên cứu cho thấy nano bạc không chỉ có khả năng kháng khuẩn mà còn kháng nấm, giúp bảo vệ cây trồng một cách an toàn và hiệu quả.

1.1. Lợi Ích Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp, bao gồm khả năng kháng vi sinh vật và tăng cường sức đề kháng cho cây trồng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc trong nông nghiệp có thể giúp giảm thiểu sự phát triển của nấm gây hại, từ đó nâng cao năng suất cây trồng.

1.2. Tính Chất Kháng Khuẩn Của Nano Bạc

Tính kháng khuẩn của nano bạc được xác định là do khả năng phá hủy màng tế bào của vi khuẩn và nấm. Điều này giúp chống nấm Neoscytalidium sp. hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho cây thanh long.

II. Vấn Đề Bệnh Đốm Nâu Trên Cây Thanh Long

Bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra đang trở thành mối đe dọa lớn đối với cây thanh long tại Việt Nam. Tình trạng bệnh ngày càng gia tăng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc tìm kiếm giải pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh là rất cần thiết.

2.1. Triệu Chứng Của Bệnh Đốm Nâu

Triệu chứng của bệnh đốm nâu bao gồm các vết tròn nhỏ trên thân và quả, dẫn đến thối mục. Những vết bệnh này có thể lan rộng nhanh chóng nếu không được kiểm soát kịp thời.

2.2. Tác Nhân Gây Bệnh

Nấm Neoscytalidium dimidiatum là tác nhân chính gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Nấm này phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, làm tăng nguy cơ lây lan bệnh trong các vườn thanh long.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Nano Bạc Bằng Phương Pháp Sinh Học

Phương pháp tổng hợp nano bạc bằng sinh học sử dụng dịch chiết từ cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả. Phương pháp này không chỉ an toàn mà còn thân thiện với môi trường, giúp tạo ra nano bạc có khả năng kháng nấm tốt.

3.1. Quy Trình Tổng Hợp Nano Bạc

Quy trình tổng hợp nano bạc bao gồm việc sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định. Phương pháp này giúp tạo ra các hạt nano bạc có kích thước nhỏ và đồng đều.

3.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp Sinh Học

Phương pháp sinh học giúp giảm thiểu các sản phẩm phụ độc hại, đồng thời tiết kiệm năng lượng so với các phương pháp hóa học truyền thống. Điều này làm cho nano bạc trong nông nghiệp trở thành lựa chọn tối ưu.

IV. Hiệu Quả Của Nano Bạc Trong Việc Chống Lại Nấm Neoscytalidium sp

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nano bạc có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium sp. một cách hiệu quả. Kết quả thử nghiệm cho thấy nano bạc có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh trên cây thanh long.

4.1. Kết Quả Thử Nghiệm Kháng Nấm

Kết quả thử nghiệm cho thấy nano bạc có thể ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium sp. với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp. Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng nấm của nano bạc là rất cao.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nano Bạc

Việc ứng dụng nano bạc trong thực tiễn có thể giúp nông dân kiểm soát bệnh đốm nâu một cách hiệu quả, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm thanh long.

V. Kết Luận Về Tác Dụng Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Nano bạc là một giải pháp tiềm năng trong việc chống lại nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Việc áp dụng nano bạc không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

5.1. Tương Lai Của Nano Bạc Trong Nông Nghiệp

Tương lai của nano bạc trong nông nghiệp hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp mới cho việc kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt là trong bối cảnh biến đổi khí hậu và sự gia tăng của các loại nấm gây hại.

5.2. Khuyến Nghị Nghiên Cứu Thêm

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc và đánh giá hiệu quả lâu dài của nó trong việc bảo vệ cây trồng, nhằm đảm bảo an toàn cho sức khỏe con người và môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, thanh long được sản xuất tập trung tại 3 tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích thanh long lớn nhất cả nước, với 26.026 ha, với diện tích cho thu hoạch là 21.349 ha và sản lượng thanh long hàng năm của Bình Thuận đạt trên 550.000 (Trần Thị Thu Hà và cs. Huyện Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận là nơi có thời tiết thay đổi thất thường, tạo điều kiện thuận lợi để bệnh đốm nâu phát triển. Toàn huyện hiện có trên 74 ha thanh long nhiễm đốm nâu (tỷ lệ bệnh là 5 - 10%).

Diện tích nhiễm bệnh ngày càng tăng cao qua các tuần, đặc biệt là những vườn năm trước đã bị nhiễm bệnh, vườn không thoát được nước và vệ sinh kém tạo điều kiện phát triển bệnh đốm nâu - một trong số bệnh nặng nhất (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2018). Neoscytalidium dimidiatum được xác định là tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh long (Võ Thị Thu Oanh và cs. Hiện tại các loại thuốc hóa học như Nativo, RidomilGold, Cabrio Top…được sử dụng nhiều nhưng chưa thật sự hiệu quả, còn khiến bệnh ngày càng lan rộng, giảm đa dạng hệ sinh thái nông nghiệp, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới dùng nano bạc trong y học, công nghiệp và đặc biệt là nông nghiệp để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên cây trồng.

Theo nghiên cứu của Ngoc và cs., 2018 đã nghiên cứu chế tạo nano bạc – chitosan ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Việc tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học gây độc hại và tạo ra nhiều sản phẩm phụ, gây ảnh hưởng lớn đến môi trường, trong khi tổng hợp nano bạc bằng phương pháp vật lý lại làm tiêu tốn năng lượng. Khi đó phương pháp hóa học xanh sử dụng các thực thể sinh học như vi sinh vật, chiết xuất thực vật hoặc sinh khối thực vật để sản xuất các hạt nano, giúp khắc khục những hạn chế của phương pháp hóa học và vật lý, thân thiện với môi trường (Ahmed và cs. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cỏ đậu phộng (Arachis pintoi) là loại cỏ dại dễ mọc, hơn nữa trong quá trình nghiên cứu đã tìm ra các hợp chất polyphenol, flavonoid… có khả năng làm tác nhân khử và ổn định trong quá trình tổng hợp nano SVTH: Lê Thị Bích Hằng 1 GVHD: ThS.

Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh bạc. Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm tác nhân khử và ổn định do cỏ đậu phộng là nguyên liệu dễ tìm thấy, tiết kiệm chi phí sản xuất, tận dụng nguồn tài nguyên sẵn có. Chính vì thế, việc tìm ra phương pháp sản xuất nano bạc thân thiện với môi trường, có khả năng ức chế vi nấm bệnh Neoscytalidium sp.

giúp kiểm soát tình trạng bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc tổng hợp bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng (Arachis pintoi)” nhằm hướng đến tạo ra sản phẩm nano bạc tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh nhằm kiểm soát được bệnh đốm nâu trên cây thanh long và góp phần đưa ra một phương pháp phòng trừ bệnh thân thiện với môi trường. Nội dung nghiên cứu: ⮚ Kiểm tra, tái phân lập và định danh sinh học phân tử nấm Neoscytalidium sp.

gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long. ⮚ Tổng hợp hợp nano bạc có kích thước nhỏ có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium sp. bằng phương pháp sinh học sử dụng dịch chiết cỏ đậu phộng làm chất khử và ổn định. ⮚ Định tính khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp.

gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. ⮚ Định lượng khả năng kháng vi nấm Neoscytalidium sp. gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long của nano bạc bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu đĩa thạch. SVTH: Lê Thị Bích Hằng 2 GVHD: ThS.

Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Lê Thị Bích Hằng 3 GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh 1.

Cây thanh long Hình 1.1: Cây thanh long Thanh long là một loài cây của họ xương rồng, thuộc chi Hylocereus, có nguồn gốc từ Mexico, Trung và Nam Mỹ. Cây thanh long cũng được trồng ở các nước Đông Nam Á cũng như Việt Nam và Malaysia (Zainoldin, 2009). Có ba loài thanh long thuộc chi Hylocereus và một loài thuộc chi Selenicereus. Các giống Hylocereus guatemalensis, Hylocereus polyrhizus và Hylocereus undatus cũng như các giống lai của ba loài này được trồng thương mại trên toàn thế giới.

Hylocereus undatus quả có thịt trắng với vỏ hồng, Hylocereus polyrhizus quả có thịt đỏ vỏ hồng trong khi Selenicereus megalanthus quả có thịt trắng vỏ vàng (Zainoldin, 2009). Quả thanh long giàu vitamin, nhiều chất xơ có khả năng hỗ trợ tiêu hóa, ngăn ngừa ung thư đại tràng và tiểu đường, trung hòa các chất độc hại như kim loại nặng và giúp giảm mức cholesterol và huyết áp cao. Thanh long cũng giàu phytoalbumins - chất có đặc tính chống oxy hóa cao, giúp ngăn ngừa sự hình thành các gốc tự do gây ung thư. Ở Đài Loan, bệnh nhân tiểu đường sử dụng trái cây như một loại thực phẩm thay thế cho gạo và như một nguồn chất xơ.

Bên cạnh đó có giống thanh long đỏ có chứa lycopene - một chất chống oxy hóa tự nhiên được biết đến để chống ung thư, bệnh tim và hạ huyết áp (Zainoldin, 2009). SVTH: Lê Thị Bích Hằng 4 GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh 2.

Bệnh đốm nâu trên cây thanh long Hình 1.2: Bệnh đốm nâu trên cành và quả thanh long 2. Tình trạng bệnh Trong các năm 2008 - 2009, bệnh đốm nâu xuất hiện và lây lan nhanh chóng ở hầu hết thanh long đỏ ruột vàng tại Malaysia, mùa hè năm 2009 tại Israel bệnh đốm nâu trên thanh long cũng được báo cáo đầu tiên gây ra bởi N. dimidiatum (Ezra và cs. Trong năm 2011, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây Ăn Quả miền Nam đã xác định một số mẫu bệnh đốm nâu trên cành thanh long do Chi cục Bảo Vệ Thực Vật Bình Thuận gửi đến.

Tháng 7 năm 2011 tại Quảng Đông, Trung Quốc bệnh đốm nâu cũng được phát hiện và báo cáo đầu tiên là do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra (Lan và cs. Theo nghiên cứu của Mohd và cs., 2013, tại Malaysia, bệnh đốm nâu trên cây thanh long do vi nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Tại Việt Nam, bệnh đốm nâu xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình Thuận với diện tích và tỉ lệ nhiễm rất ít. Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh với diện tích gần 1.000 ha, tỉ lệ nhiễm nặng từ 10 % trở lên chiếm trên 80 % và bệnh đã có mặt ở khắp 3 vùng trồng thanh long tập trung của Việt Nam là Bình Thuận, Tiền Giang và Long An.

Theo báo cáo của ngành nông nghiệp các địa phương, tháng 6/2013 diện tích nhiễm bệnh đốm nâu đã lên đến gần 3.000 ha, tỉ lệ gây hại từ 20 đến 50 % (Nguyễn Hữu Cầu, 2013). Tính đến tháng 7/2015, toàn tỉnh có 6.846 ha SVTH: Lê Thị Bích Hằng 5 GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh thanh long nhiễm bệnh đốm nâu, tăng 2.309 ha so với tháng 6/2015 và tăng 5.668 ha so với cùng kỳ năm 2014 (Theo chi cục BVTV tinh Bình Thuận báo Dân Việt 2015).

Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh long là do nấm N. dimidiatum gây ra (Mohd và cs. Đặc điểm phân loại của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Crous - Slippers, 2006) thuộc: Ngành: Ascomyta Lớp: Dothideomycetes Bộ: Botryosphaeriales Họ: Botryosphaeriaceae Chi: Neoscytalidium Loài: Neoscytalidium dimidiatum Theo mô tả của Mohd và cs., (2013) đại thể nấm có đặc điểm như sau: lông hoặc lông mịn, tản nấm có màu xám và hình thành sắc tố đen trên PDA. Neoscytalidium dimidiatum phát triển rất nhanh và xâm chiếm các đĩa trong vòng 3 ngày.

Tốc độ tăng trưởng là 3 cm/ngày trên môi trường PDA. Bào tử hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn, có màu trong suốt, khi trưởng thành có màu nâu và hình thành hai vách ngăn với kích thước 10,99 ± 0,35 × 5,02 ± 0,44 µm. Đối với sợi nấm, các sợi nấm phân nhánh, hình thành vách ngăn và tự tách ra thành bào tử đốt. Bào tử đốt hình thành rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy, có màu nâu nhạt đến nâu sẫm, có 0 - 1 vách ngăn.

Triệu chứng bệnh Qua nghiên cứu của Mohd và cs. 2008 và 2009 của thanh long ở Malaysia, bệnh xuất với vết trũng tròn nhỏ trên bề mặt cả thân và quả, tạo ra những vết màu cam và dẫn đến thối mục thân. Theo mô tả của Lan và cs., 2012, bệnh xuất hiện nhiều đốm nhỏ trên cành. Tại Việt Nam, theo mô tả của Viện Cây Ăn Quả Miền Nam, triệu chứng bệnh trên cành khi mới xuất hiện, vết bệnh là những chấm li ti (như vết kim châm) nhỏ hơi lõm vào bề mặt bẹ hoặc trái và chuyển sang màu trắng sau khoảng 3 SVTH: Lê Thị Bích Hằng 6 GVHD: ThS.

Nguyễn Văn Minh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. Nguyễn Phụng Anh - 4 ngày. Về sau vết bệnh xuất hiện những chấm nhỏ màu cam ở vị trí trung tâm được bao bọc bởi vòng tròn màu vàng sau 10 đến 20 ngày và dần dần vết bệnh nổi lên thành đốm tròn màu nâu sau 18 đến 20 ngày. Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, các vết bệnh phát triển lan rộng ra, liên kết nhau thành từng mảng lớn làm sần sùi bề mặt cành.

Trên quả, bệnh tấn công và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của quả, đặc biệt ở giai đoạn sau trổ hoa và giai đoạn chuẩn bị chín. Triệu chứng bệnh gây hại trên quả cũng tương tự như trên cành. Theo Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2016 từ năm 2014, bệnh đốm nâu trên cây thanh long phát triển mạnh và gây thiệt hại lớn cho người trồng trong cả nước, nhất là tại Bình Thuận, Tiền Giang và Long An. Tại Bình Thuận, đỉnh điểm có gần 50 % diện tích thanh long bị nhiễm bệnh.

Trong đó thanh long là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao ở nhiều tỉnh thành, bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra làm giảm giá trị thương phẩm của trái thanh long nghiêm trọng (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2014) 2.