Đặt vấn đề Hiện tại, ở Việt Nam ngành trồng trọt vẫn đang chiếm một tỷ trọng lớn trong nền kinh tế. Vì vậy, việc sản xuất và chọn giống cây trồng ngày cảng trở nên quan trọng trong chuỗi sản xuất nông nghiệp. Đề đáp ứng được nhu cầu ngày cảng cao về số lượng và cả chất lượng, năng suất giống cây trồng của thị trường thì công nghệ nuôi cay mô tế bào thực vật (kỹ thuật nuôi cấy in vitro) đã được ưa chuộng, tin cậy sử dụng trong các quy trình sản xuất, chọn lọc giống cây trồng. Hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) từ lầu luôn được ưa chuộng nhờ vào sự đa dạng về màu sắc và được sử dụng sử dụng đa dạng mục đích như hoa cắt cành, hoa chậu.
Hoa đồng tiền là một trong những loài hoa được trồng thương mại mang lại giá trị kinh tế cao cho ngành hoa Việt Nam. Hoa đồng tiền cũng mang ý nghĩa là cầu mong cho sự may man, tin tưởng và thịnh vượng đây cũng là một lý do mà hoa đồng tiền được ưa dùng trong các dịp quan trọng như lễ, tết. Chính vì vậy, nhu cầu hoa đồng tiền phục vụ cho thị trường rất lớn, thúc đây việc gia tăng sản xuất loài hoa này. Theo thống kê của Cục Trồng Trọt, trong vòng 10 năm (2005 — 2015) diện tích trồng hoa ở Việt Nam đã tăng hơn 2,3 lần, giá trị sản lượng tăng 7,2 lần (Nguyễn Thị Tần và ctv, 2018).
Diện tích gieo trồng lớn dé đáp ứng nhu cầu lớn của thị trường kéo theo nhu cầu về nguồn giống cũng tăng lên. Hiện nay, nguồn giống cây trồng được sản xuất số lượng lớn bằng kỹ thuật nhân giống in vitro đã gần như đáp ứng được yêu cầu về chọn lọc giống cây trồng của thị trường. Nguồn giống đồng đều, năng suất cao, hệ số nhân giống nhanh, cây giống luôn được giữ những đặc tính di truyền từ cây mẹ và được trẻ hóa thường xuyên, sạch bệnh, phát triển khỏe mạnh là những đặc điểm mà ngành công nghệ nuôi cay mô tế bào thực vật mang lại và định hướng phát triển. Nhung trong quá trình nuôi cấy in vitro giống hoa đồng tiền thường gặp phải những van đề tiêu cực trong quá trình thực hiện nuôi cấy, do tác động của nhiều yếu tố bình kín như dư thừa các chất điều hòa sinh trưởng, độ âm cao cũng như sự tích lũy khí ethylene (Hà Thị Mỹ Ngân và ctv, 2018).
Nhưng quá trình thực hiện kỹ thuật nuôi cấy in vitro cũng gặp không ít những khó khăn. Theo Ha Thị Mỹ Ngân và ctv (2019), đã nêu ra một số hiện tượng bắt thường hay gặp trong quá trình vi nhân giống thực vật như thủy tinh thể; hiện tượng vàng và rụng lá: sự nhiễm vi sinh vật; hoại tử chồi đỉnh, rễ và mẫu mô nuôi cay; hóa nâu mẫu, môi trường nuôi cấy v. Những van đề, hiện tượng nêu trên ảnh hưởng xấu đến kết quả và mục dich của quá trình nuôi cấy in vitro hướng đến. Bên cạnh đó, công nghệ nano cũng là một trong những phương pháp ứng dụng vào dé khắc phục các van dé bất thường trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Các hạt nano kim loại có tác động tích cực lên các tế bào thực vật được chứng minh thông qua tăng sự nảy mầm và phát triển thực vật; tăng cường hoạt động sinh lý dé cải thiện khả năng hấp thụ ánh sáng, tăng trọng lượng tươi và tăng trọng lượng khô, thúc day quá trình chuyền hóa năng lượng, thúc day stress chống oxy hóa, cải thiện quá trình quang hợp: hạn chế sự rụng các cơ quan sinh sản của thực vật; tăng sản lượng và năng suất cây trồng (Nair và ctv, 2010). Nano bạc (AgNPs) là một trong những vật liệu nano bac kim loại rất được ưa chuộng và phô biến trong nhiều lĩnh vực nói chung và trong nuôi cấy in vitro nói riêng. Bởi các công dụng mà nó có thê mang lại cho các nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực nuôi cay mô tế bao thực vật như khắc phục hiện tượng thủy tinh thể, vàng vả rụng lá trong quá trình nuôi (Kumar và ctv, 2009); tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trồng với ưu điểm tăng tiếp xúc, bám đính lên bề mặt tế bào, dẫn tới hiệu quả tác động cao (Dương Tấn Nhựt và ctv, 2015); có khả năng khử trùng bề mặt tốt mà không có tác động xấu lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy (Dương Tấn Nhựt và ctv, 2018); Có thé giúp loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm có hại cho mẫu như: vi khuẩn, nam v. trong vi nhân giống thực vật trên nhiều đối tượng (Spinoso-Castillo và ctv, 2017); AgNPs là một chất kháng khuẩn tốt.
Vì những lý do trên đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc và một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii)” nhằm xác định ảnh hưởng của nano bạc và các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo sẹo cây hoa đồng tiền, từ đó xác định ảnh hưởng của nano bạc lên các quá trình tiêu cực xảy ra trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Mục tiêu của đề tài Xác định sự ảnh hưởng của nano bạc đên sự cảm ứng mô sẹo, hình thành mô sẹo phôi hóa và xác định được môi trường nuôi cây có bô sung nông độ chât điêu hòa sinh trưởng thích hợp dé phát triển mô sẹo phôi hóa từ mẫu lá non hoa đồng tiền in vitro. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Khảo sat tác động của nano bạc đến sự cảm ứng tạo mô sẹo. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP va NAA đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa.
Nội dung 3: Khảo sát tác động của nano bạc đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Tổng quan phương pháp nuôi cấy mô, tế bao thực vật 2. Khái niệm Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng dé chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tach rời khác nhau của thực vat.
Kỹ thuật nuôi cay mô dùng cho ca 2 mục đích nhân giống va cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các san pham hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguôồn gen quý v. Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn được gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cay mô dé nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micro propagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro, nuôi cây mô thay đổi cho nhau dé chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture).
Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật Nam 1838, hai nhà khoa hoc Matthias Jacob Schleiden (nhà thực vật hoc) và Theodor Schwann (nhà động vật học) đã chính thức xây dựng học thuyết tế bảo, học thuyết khang định rằng: mỗi cơ thé động thực vật đều bao gồm những thé tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bao. Kỹ thuật nuôi cay tế bảo nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là có tính toàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa của tế bảo. Tính toàn năng của tế bào Theo Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rang mỗi tế bao bất kỳ của một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thê sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành cá thé hoàn chỉnh. Do là tính toàn năng của tê bảo. Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào Sự phân hóa tế bảo là sự chuyển các tế bao phôi sinh thành các tế bao mô chuyển hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Sự phản phân hóa là khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mat khả năng biến đổi của mình.
Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hop, chúng lại có thé trở lại dạng tế bào phôi sinh, phân chia mạnh mẽ. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thé, có một số gen được hoạt hóa dé cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bi đình chỉ hoạt động. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 2.
Thành phần môi trường dinh dưỡng Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô, bao gồm: Các loại muối khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô bao gồm các loại nguyên tố khoáng được chia ra làm 2 loại dựa theo hàm lượng sử dụng. Đó là các nguyên tố khoáng đa lượng với nồng độ trên 30 ppm trong thành phần dinh dưỡng như N, P, K, S, Mg, Ca; với nồng độ sử dụng trong môi trường đinh dưỡng dưới 30 ppm như các nguyên tố Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni được goi la nguyên tổ vi lượng. Các thành phần khác là nguồn carbon (thường dùng saccharose 2 — 3 %, trong một số trường hợp đặc biệt có thé dùng glucose, maltose, galactose v.,), nhóm chất tự nhiên (nước dừa, dịch chiết nam men, dịch chiết khoai tây, dịch chiết chuối v.,), chất làm đông môi trường (agar v.,), chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, polyamine, jasmonic acid). Trong môi trường nuôi cay mô tế bao thực vat, thành phan quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy đó là chất điều hòa sinh trưởng.1 Auxin Auxin được gọi là hormone sinh trưởng được tổng hợp chính từ chồi ngọn, có tác dụng kích thích mạnh lên sự giãn của tế bảo, làm cho tế bào phình to lên chủ yếu theo hướng ngang của tế bảo, sự giãn của các tế bào gây nên sự tăng trưởng của cơ quan và toàn thân, có tác dụng điều chỉnh tính hướng quang, hướng địa, hướng thủy, hiện tượng ưu thế ngọn, sự rụng của lá, hoa, Một số chất thuộc nhóm auxin thường dùng: IAA (auxin tự nhiên), IBA, NAA, 2,4-D.1 Cytokinin Cytokinin được tông hợp từ hệ rễ và có mặt trong các ARN vận chuyên.