Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ghóp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền gerbera jamesonii bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền Gerbera jamesonii bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

• Tác giả: Vi Thị Hà
• Người hướng dẫn: Ngô Xuân Bình, Khoa CNSH - CNTP, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên
• Trường học: Đại Học Nông Lâm, Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa đồng tiền
• 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
• 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa đồng tiền
• 2.2. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.2.1. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền ở Việt Nam
• 2.3. Phương pháp nhân giống cây hoa đồng tiền trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.3.1. Phương pháp nhân giống hoa đồng tiền trên thế giới
• 2.3.2. Phương pháp nhân giống hoa đồng tiền ở Việt Nam
• 2.4. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.4.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.4.1.1. Tính toàn năng
• 2.4.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
• 2.4.2. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào
• 2.4.2.1. Điều kiện vô trùng

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây hoa đồng tiền Gerbera Jamesonii

Cây hoa đồng tiền, có tên khoa học là Gerbera Jamesonii, là một trong những loài hoa được ưa chuộng nhất hiện nay. Với sự đa dạng về màu sắc như đỏ, cam, vàng, trắng, hồng phấn và tím, hoa đồng tiền không chỉ được sử dụng trong trang trí mà còn có giá trị kinh tế cao. Mỗi cây có thể cho từ 50 đến 60 bông hoa mỗi năm, và một hecta có thể trồng khoảng 60.000 cây. Tuy nhiên, việc sản xuất hoa đồng tiền tại Việt Nam vẫn còn hạn chế do chất lượng giống và điều kiện trồng trọt chưa được tối ưu. Nghiên cứu này nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền

Trên thế giới, hoa đồng tiền được sản xuất chủ yếu ở các nước như Hà Lan, Colombia và Trung Quốc. Tại Hà Lan, hoa đồng tiền chiếm khoảng 90% sản phẩm hoa từ nuôi cấy mô. Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc sản xuất hoa đồng tiền vẫn còn gặp nhiều khó khăn do thiếu giống tốt và kỹ thuật trồng chưa được chuẩn hóa. Việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào sẽ giúp cải thiện tình hình này, cung cấp giống hoa đồng tiền chất lượng cao và số lượng lớn cho thị trường.

II. Quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng nuôi cấy mô tế bào

Quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng nuôi cấy mô tế bào bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, việc chọn lựa mẫu cây khỏe mạnh là rất cần thiết. Mẫu cây thường được lấy từ đế hoa non, sau đó được khử trùng bằng dung dịch HgCl2. Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với các chất dinh dưỡng cần thiết như MS, BAP, NAA và sucrose. Sau khi nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, mô sẹo sẽ hình thành và phát triển thành chồi. Quá trình này cần được theo dõi chặt chẽ để đảm bảo tỷ lệ sống sót cao cho cây con.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống

Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đều ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo và chồi. Nhiệt độ lý tưởng cho quá trình nuôi cấy là 24 ± 2 độ C, với độ ẩm không khí cao và ánh sáng được điều chỉnh từ 12 đến 16 giờ mỗi ngày. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp tăng cường khả năng nhân giống và chất lượng cây con.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Về mặt khoa học, nghiên cứu giúp củng cố kiến thức về công nghệ sinh học thực vật, đồng thời cung cấp phương pháp nghiên cứu và phân tích số liệu cho sinh viên. Về mặt thực tiễn, quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền sẽ cung cấp giống với số lượng lớn và chất lượng đảm bảo, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất và thu nhập cho người trồng. Điều này không chỉ góp phần phát triển ngành hoa tại Việt Nam mà còn đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước và quốc tế.

3.1. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Việc áp dụng quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng nuôi cấy mô tế bào sẽ giúp cải thiện năng suất và chất lượng hoa. Điều này có thể tạo ra một bước đột phá trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực trồng hoa. Sự phát triển của công nghệ này sẽ mở ra cơ hội mới cho người nông dân, giúp họ tăng thu nhập và cải thiện đời sống.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii, còn được gọi là hoa mặt trời hay hoa phu lăng) là loài thực vật thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae), có nguồn gốc từ Nam Phi. Trong ngành sản xuất hoa thương phẩm, hoa đồng tiền giữ vị trí quan trọng nhờ màu sắc đa dạng (đỏ, cam, vàng, trắng, hồng phấn, tím), độ bền cành cao, phù hợp cho việc cắm hoa nghệ thuật lẫn trồng chậu trang trí. Về mặt hiệu quả kinh tế, cây hoa đồng tiền có khả năng cho thu hoạch quanh năm với năng suất trung bình từ 50 đến 60 bông/cây/năm. Với mật độ canh tác đạt khoảng 60.000 cây/ha và thị giá dao động từ 2.000 đến 3.000 đồng/bông, nguồn thu nhập trên một đơn vị diện tích đất canh tác hoa đồng tiền là tương đối khả quan.

Tại Việt Nam, giống hoa đồng tiền đơn đã được nhập nội từ những năm 1940. Tuy nhiên, giống hoa đơn có hoa nhỏ, ít tầng cánh và màu sắc đơn điệu. Từ thập niên 1990, các giống hoa đồng tiền kép với cánh hoa dày, đường kính lớn và màu sắc phong phú bắt đầu được nhập từ Hà Lan, Trung Quốc và Đài Loan. Mặc dù nhu cầu thị trường rất lớn, diện tích canh tác hoa đồng tiền tại các địa phương (như Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, Thành phố Hồ Chí Minh) vẫn còn hạn chế và chất lượng hoa chưa đồng đều. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ:

• Nguồn cây giống phụ thuộc nhiều vào việc nhập khẩu từ Hà Lan và Trung Quốc với giá thành cao, nguồn gốc không ổn định, làm đội chi phí sản xuất ban đầu;
• Cây hoa đồng tiền trồng ở điều kiện nhiệt đới ẩm tại Việt Nam rất dễ nhiễm nấm bệnh, đặc biệt là nấm Phytophthora. Tập quán canh tác cắt hoa sát mặt đất kết hợp với nguồn nước tưới ô nhiễm và vệ sinh đồng ruộng chưa triệt để khiến các giống hoa nhanh chóng bị thoái hóa.

Nhằm giải quyết bài toán cung ứng nguồn giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền với số lượng lớn, tác giả Vi Thị Hà đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.

Mục đích chung của nghiên cứu là hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho cây hoa đồng tiền. Cụ thể, đề tài đặt ra 2 mục tiêu thực nghiệm:

1. Xác định được hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (Kinetin và BAP) và nước dừa thích hợp đối với khả năng nhân nhanh chồi hoa đồng tiền.
2. Xác định được hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) và than hoạt tính thích hợp đối với khả năng ra rễ của chồi hoa đồng tiền.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các chồi hoa đồng tiền đang trong giai đoạn nhân nhanh, được lưu giữ và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào hai giai đoạn then chốt của quy trình in vitro: giai đoạn nhân nhanh chồi và giai đoạn kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Toàn bộ các thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, trong khung thời gian từ tháng 12 năm 2013 đến tháng 5 năm 2014.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở lý luận về tính toàn năng của tế bào thực vật (được Gottlieb Haberlandt khởi xướng từ đầu thế kỷ 20) và các quy luật phân hóa, phản phân hóa tế bào dưới sự điều tiết của các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật (phytohormone). Trong nuôi cấy mô in vitro, sự phát sinh hình thái cơ quan (tạo chồi hay tạo rễ) được kiểm soát chủ yếu thông qua tỷ lệ phối hợp giữa hai nhóm chất kích thích sinh trưởng:

• Nhóm Cytokinin: gồm 6-Benzylaminopurine (BAP) và 6-Furfurylaminopurine (Kinetin), giữ vai trò hoạt hóa chu trình phân chia tế bào, kích thích sự hình thành và phát triển của các chồi nách, hạn chế sự già hóa của mô;
• Nhóm Auxin: gồm $\alpha$-Naphthaleneacetic acid (NAA) và Indole-3-butyric acid (IBA), giữ vai trò kích thích kéo dài tế bào và kích thích phân hóa mô mạch tạo rễ phụ.

Về phương pháp thực nghiệm, đề tài triển khai trên hệ thống thiết bị chuyên dụng của phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, bao gồm: tủ cấy vô trùng cấp 1 (Airtech), nồi hấp khử trùng (ALP), tủ sấy (Memmert), máy đo pH (Hanna HI2210), cân điện tử (Ohaus - Vietlab), cùng hệ thống dàn đèn huỳnh quang.

Điều kiện phòng nuôi cấy được kiểm soát nghiêm ngặt:

• Thời gian chiếu sáng: 8 - 12 giờ/ngày;
• Cường độ ánh sáng: 2.000 lux;
• Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 2°C;
• Độ ẩm không khí: 60 - 70%.

Hệ thống môi trường và thiết kế thí nghiệm gồm 2 nội dung chính:

1. Thí nghiệm nhân nhanh chồi: Môi trường nền sử dụng là MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 mg/l myo-inositol, hiệu chỉnh pH ở mức 5,8. Thí nghiệm kiểm tra đơn yếu tố nồng độ Kinetin (0,0; 0,5; 1,0; 1,2; 1,5 mg/l); nồng độ BAP (0,0; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2 mg/l); và thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng bổ sung nước dừa (0%, 3%, 5%, 10%, 15%) kết hợp với nồng độ cytokinin tối ưu. Mẫu cấy là các chồi có đầy đủ thân và lá không bị dị dạng. Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy gồm: hệ số nhân chồi, số lá trung bình/chồi và đánh giá chất lượng chồi cảm quan (tốt: +++, khá: ++, kém: +).

2. Thí nghiệm tạo rễ in vitro: Môi trường nền là khoáng 1/2 MS bổ sung 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar, 100 mg/l myo-inositol, pH 5,8. Thí nghiệm kiểm tra đơn yếu tố nồng độ NAA (0,0; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25 mg/l); nồng độ IBA (0,0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l); và hàm lượng than hoạt tính (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 g/l). Mẫu cấy là các chồi khỏe mạnh có từ 3 đến 5 lá thu nhận từ giai đoạn nhân nhanh. Chỉ tiêu theo dõi sau 25 ngày nuôi cấy gồm: số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình rễ (cm) và màu sắc rễ.

Các thí nghiệm đều được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại; mỗi lần nhắc lại gồm 4 bình nuôi cấy, mỗi bình cấy 6 chồi (tương đương 72 chồi/công thức). Số liệu thu thập được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình theo tiêu chuẩn sai khác có ý nghĩa tối thiểu (LSD) ở mức xác suất tin cậy 95% ($P < 0,05$) bằng phần mềm chuyên dụng IRRISTAT 4.0 và xử lý dữ liệu thô trên Microsoft Excel 2007.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quát vị trí kinh tế, vẻ đẹp và giá trị thương phẩm của cây hoa đồng tiền. Nêu rõ thực trạng sản xuất hoa đồng tiền tại Việt Nam: diện tích còn manh mún, chất lượng chưa cao, phụ thuộc lớn vào việc nhập khẩu giống từ nước ngoài, trong khi cây trồng dễ nhiễm nấm Phytophthora dẫn đến thoái hóa giống nhanh chóng. Từ đó, tác giả xác định mục đích nghiên cứu nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, đồng thời cụ thể hóa bằng 2 mục tiêu thực nghiệm về nhân nhanh chồi và kích thích ra rễ.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Phần này hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Nguồn gốc và phân loại thực vật học: Giới thiệu chi Gerbera có khoảng 40 loài; phân loại hình thái hoa thành 3 nhóm gồm hoa đơn, hoa kép và hoa đơn nhị kép, trong đó nhóm hoa kép có giá trị kinh tế và thị hiếu cao nhất;
• Đặc điểm sinh vật học: Phân tích cấu trúc thân ngầm, rễ chùm, cấu tạo cụm hoa dạng đầu gồm hoa hình lưỡi ở vòng ngoài nở trước và hoa hình ống ở tâm nở sau;
• Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và tại Việt Nam: Điểm qua thành tựu công nghệ nuôi cấy mô tại Hà Lan (chiếm 90% sản lượng hoa từ in vitro năm 1984, công ty Florist) và Trung Quốc;
• Lịch sử nghiên cứu vi nhân giống hoa đồng tiền: Tổng hợp các công bố của Pierik và Segers (1973), Huang (2001), Jerzy và Lubomski (1991), Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc (2003), Hoàng Thị Phương Nga và cộng sự (2003), Ngô Đăng Vịnh và cộng sự (2003);
• Cơ sở lý thuyết nuôi cấy mô: Phân tích tính toàn năng tế bào, cơ chế phân hóa – phản phân hóa, 5 giai đoạn vi nhân giống (chuẩn bị mẫu vô trùng, tái sinh mẫu, nhân nhanh chồi, tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh, đưa cây ra vườn ươm), cùng vai trò của môi trường dinh dưỡng MS, nguồn carbon, vitamin và các phytohormone (Auxin, Cytokinin).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết địa điểm, thời gian và đối tượng chồi đồng tiền in vitro tại Viện Khoa học Sự sống (Đại học Nông Lâm Thái Nguyên). Liệt kê bảng hóa chất thành phần pha chế môi trường MS hiệu chỉnh, các dụng cụ, thiết bị đo lường và các điều kiện vi khí hậu trong phòng nuôi cấy. Trình bày công thức bố trí 6 thí nghiệm thực nghiệm (TN1 đến TN6), các công thức toán học tính toán hệ số nhân chồi, số lá trung bình, chiều dài rễ trung bình, số rễ trung bình, cùng phương pháp phân tích thống kê sinh học trên IRRISTAT 4.0 và Excel 2007.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này công bố và biện giải chi tiết các dữ liệu thực nghiệm thu được qua 6 thí nghiệm:

• Ảnh hưởng của Kinetin (TN1): Nồng độ 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt cực đại 3,06 lần; khi tăng lên 1,2 - 1,5 mg/l, hệ số nhân có xu hướng suy giảm; số lá trung bình dao động từ 2,93 đến 3,43 lá và không có sai khác mang ý nghĩa thống kê so với đối chứng;
• Ảnh hưởng của BAP (TN2): Nồng độ 0,8 mg/l đạt hệ số nhân chồi cao nhất (3,78 lần), chồi mập mạp, lá xanh thẫm; nồng độ 1,2 mg/l làm giảm chất lượng chồi (chồi còi cọc, lá xanh nhạt);
• Ảnh hưởng phối hợp giữa BAP và nước dừa (TN3): Việc bổ sung thêm nước dừa từ 3% đến 15% vào môi trường chứa 0,8 mg/l BAP không tạo ra sai khác có ý nghĩa thống kê về hệ số nhân chồi so với đối chứng không bổ sung nước dừa ($LSD_{0,05} = 0,2$);
• Ảnh hưởng của NAA đối với khả năng ra rễ (TN4): Nồng độ 0,25 mg/l NAA cho số rễ trung bình/cây cao nhất (3,65 rễ), rễ có màu trắng và xuất hiện nhiều lông hút; chiều dài rễ đạt 1,80 cm, thích hợp cho việc chuyển giao ra ngôi mà không lo gãy rễ;
• Ảnh hưởng của IBA đối với khả năng ra rễ (TN5): Nồng độ 0,9 mg/l IBA cho số rễ trung bình cao nhất (3,99 rễ/cây, rễ màu trắng); nồng độ IBA không tác động rõ rệt đến chiều dài trung bình của rễ ($LSD_{0,05} = 0,96$);
• Ảnh hưởng của than hoạt tính (TN6): Nồng độ 1,5 g/l than hoạt tính kích thích mạnh nhất cả về chiều dài rễ (3,31 cm) lẫn số rễ trung bình (2,93 rễ/cây).

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận chính thức xác định công thức môi trường tối ưu cho 2 giai đoạn: nhân nhanh chồi (MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 100 mg/l myo-inositol + 0,8 mg/l BAP, pH 5,8) và ra rễ (bổ sung 0,25 mg/l NAA). Đồng thời, tác giả nêu các kiến nghị tiếp tục nghiên cứu tổ hợp đa chất điều hòa, khảo sát giá thể vườn ươm và mở rộng thử nghiệm ở quy mô công nghiệp.

Kết quả và đóng góp

1. Dữ liệu thực nghiệm giai đoạn nhân nhanh chồi (theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy)

Dữ liệu thực nghiệm của các thí nghiệm khảo sát chất kích thích sinh trưởng và chất bổ sung trong giai đoạn nhân nhanh chồi được tổng hợp trong bảng sau:

Thí nghiệm	Công thức / Yếu tố khảo sát	Hệ số nhân chồi (lần)	Số lá TB/chồi (lá)	Cảm quan chất lượng chồi
TN1: Kinetin	CT1 (Đối chứng: 0,0 mg/l)	1,00	3,43	Khá (++)
	CT2 (Kinetin 0,5 mg/l)	2,99*	3,01	Tốt (+++)
	CT3 (Kinetin 1,0 mg/l)	3,06*	3,02	Tốt (+++)
	CT4 (Kinetin 1,2 mg/l)	2,79*	2,93	Khá (++)
	CT5 (Kinetin 1,5 mg/l)	2,88*	2,99	Khá (++)
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,3$	$LSD_{0,05} = 0,51$ (ns)
TN2: BAP	CT1 (Đối chứng: 0,0 mg/l)	1,00	3,43	Khá (++)
	CT2 (BAP 0,5 mg/l)	3,49*	4,02*	Tốt (+++)
	CT3 (BAP 0,8 mg/l)	3,78*	2,83	Tốt (+++)
	CT4 (BAP 1,0 mg/l)	3,40*	3,00	Khá (++)
	CT5 (BAP 1,2 mg/l)	3,42*	2,96	Kém (+)
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,3$	$LSD_{0,05} = 0,32$
TN3: Phối hợp BAP 0,8 mg/l + Nước dừa (ND)	CT1 (Đối chứng: 0% ND)	3,78	2,95	Tốt (+++)
	CT2 (ND 3%)	3,53 (ns)	3,14*	Tốt (+++)
	CT3 (ND 5%)	3,53 (ns)	3,04 (ns)	Khá (++)
	CT4 (ND 10%)	3,36 (ns)	3,09 (ns)	Khá (++)
	CT5 (ND 15%)	3,38 (ns)	3,08 (ns)	Kém (+)
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,2$ (ns)	$LSD_{0,05} = 0,18$

(Ghi chú: * thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ở mức $P < 0,05$; ns: sai khác không có ý nghĩa thống kê).

2. Dữ liệu thực nghiệm giai đoạn tạo rễ in vitro (theo dõi sau 25 ngày nuôi cấy)

Dữ liệu thực nghiệm của các thí nghiệm khảo sát tác nhân tạo rễ và phụ gia than hoạt tính được tổng hợp trong bảng sau:

Thí nghiệm	Công thức / Yếu tố khảo sát	Chiều dài TB rễ (cm)	Số rễ TB/cây (rễ)	Màu sắc rễ
TN4: NAA	CT1 (Đối chứng: 0,0 mg/l)	1,44	1,19	Nâu nhạt
	CT2 (NAA 0,10 mg/l)	2,25*	2,68*	Trắng
	CT3 (NAA 0,15 mg/l)	2,15*	3,11*	Trắng
	CT4 (NAA 0,20 mg/l)	1,81*	3,44*	Trắng
	CT5 (NAA 0,25 mg/l)	1,80*	3,65*	Trắng, nhiều lông hút
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,14$	$LSD_{0,05} = 0,22$
TN5: IBA	CT1 (Đối chứng: 0,0 mg/l)	1,44	1,25	Nâu
	CT2 (IBA 0,3 mg/l)	1,48 (ns)	2,86*	Trắng
	CT3 (IBA 0,5 mg/l)	1,51 (ns)	3,21*	Trắng
	CT4 (IBA 0,7 mg/l)	1,53 (ns)	3,38*	Trắng
	CT5 (IBA 0,9 mg/l)	1,55 (ns)	3,99*	Trắng
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,96$ (ns)	$LSD_{0,05} = 0,31$
TN6: Than hoạt tính (THT)	CT1 (Đối chứng: 0,0 g/l)	1,62	1,25	Nâu nhạt
	CT2 (THT 0,5 g/l)	3,00*	2,22*	Trắng
	CT3 (THT 1,0 g/l)	2,98*	2,50*	Trắng
	CT4 (THT 1,5 g/l)	3,31*	2,93*	Trắng
	CT5 (THT 2,0 g/l)	2,91*	2,57*	Trắng
	Giá trị sai khác thống kê	$LSD_{0,05} = 0,29$	$LSD_{0,05} = 0,16$

3. Đóng góp khoa học và giải pháp kỹ thuật đề xuất

• Đề tài đã chuẩn hóa được nồng độ BAP thích hợp nhất ở mức 0,8 mg/l trên nền môi trường MS cơ bản, giúp nâng hệ số nhân chồi lên 3,78 lần sau 30 ngày, cao hơn rõ rệt so với Kinetin (chỉ đạt 3,06 lần ở mức 1,0 mg/l). Kết quả này tương đồng với các công bố của Nguyễn Văn Hồng (2009) về hiệu lực của BAP trên chồi hoa đồng tiền.
• Bác bỏ sự cần thiết của việc bổ sung nước dừa trong giai đoạn nhân nhanh khi đã có nồng độ BAP tối ưu, giúp đơn giản hóa thành phần môi trường và tiết kiệm chi phí hóa chất trong quy trình vi nhân giống.
• Xác định môi trường tạo rễ tối ưu là nền khoáng 1/2 MS bổ sung 0,25 mg/l NAA (đạt 3,65 rễ/cây, rễ trắng khỏe, nhiều lông hút, độ dài vừa phải 1,80 cm giúp hạn chế dập gãy khi chuyển ra vườn ươm); hoặc bổ sung 0,9 mg/l IBA (đạt 3,99 rễ/cây) hoặc 1,5 g/l than hoạt tính (đạt 2,93 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 3,31 cm). Kết quả tạo rễ với NAA phù hợp với các kết luận trước đó của Hoàng Thị Phương Nga và cộng sự (2003).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

Khóa luận chỉ giới hạn trong phạm vi thời gian thực hiện ngắn (từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014) và nguồn lực phòng thí nghiệm, do đó:

• Đề tài mới chỉ tiến hành thực nghiệm trên hai phân đoạn in vitro là nhân nhanh chồi và kích thích ra rễ từ nguồn mẫu chồi có sẵn; chưa thực hiện trọn vẹn quy trình từ khâu khử trùng mô khởi đầu (vào mẫu từ đế hoa hay lá non);
• Chưa thực hiện giai đoạn chuyển cây in vitro ra đất (ra ngôi), chưa thử nghiệm các công thức giá thể và chế độ chăm sóc cây con ở giai đoạn vườn ươm thích nghi.

Hướng nghiên cứu tiếp (theo đề nghị của tác giả)

1. Tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nhân nhanh cây hoa đồng tiền bằng các tổ hợp phối hợp giữa các chất kích thích sinh trưởng khác nhau và các chất bổ sung hữu cơ (dịch chiết nấm men, pepton...) nhằm nâng cao hơn nữa số lượng và chất lượng chồi.
2. Mở rộng nghiên cứu tạo rễ và thực hiện giai đoạn đưa cây con hoa đồng tiền ra trồng ngoài vườn ươm; đánh giá các loại giá thể vườn ươm (mùn cưa, trấu hun, than bùn, đất vi sinh) và tỷ lệ sống sót của cây tự dưỡng.
3. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ở quy mô công nghiệp nhằm phục vụ sản xuất cây giống hoa đồng tiền số lượng lớn cung ứng cho các vùng sản xuất hoa hàng hóa.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Nông học, Trồng trọt và Hoa - Cây cảnh đang thực hiện các đề tài liên quan đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro plant tissue culture);
• Các đơn vị sản xuất, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thương mại muốn tìm kiếm thông số nồng độ hóa chất cụ thể để tối ưu hóa quy trình nhân giống vô tính cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii);
• Phần đáng tham khảo nhất trong tài liệu là bảng công thức chi tiết pha chế môi trường dinh dưỡng MS hiệu chỉnh (tại Phụ lục 3), các số liệu thống kê chi tiết về ANOVA (tại Phụ lục 2) và các ngưỡng nồng độ so sánh giữa Cytokinin (BAP vs. Kinetin) cũng như Auxin (NAA vs. IBA) trong điều kiện nuôi cấy tại miền Bắc Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi hoa đồng tiền được tác giả kết luận là gì?
Môi trường nhân nhanh tối ưu là môi trường MS cơ bản bổ sung 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 100 mg/l myo-inositol + 0,8 mg/l BAP ở pH 5,8. Ở môi trường này, hệ số nhân chồi đạt cao nhất là 3,78 lần sau 30 ngày nuôi cấy, chồi mập và lá xanh thẫm.

2. Việc bổ sung nước dừa vào môi trường nhân nhanh có làm tăng hệ số nhân chồi không?
Không. Dữ liệu thực nghiệm tại Thí nghiệm 3 cho thấy việc bổ sung nước dừa ở các nồng độ 3%, 5%, 10% và 15% vào môi trường chứa 0,8 mg/l BAP không tạo ra sự sai khác mang ý nghĩa thống kê về hệ số nhân chồi so với công thức đối chứng không bổ sung nước dừa ($LSD_{0,05} = 0,2$). Hệ số nhân dao động từ 3,36 đến 3,53 lần, thấp hơn mức 3,78 lần của công thức đối chứng.

3. Giữa hai loại cytokinin là BAP và Kinetin, chất nào cho hiệu quả nhân chồi cao hơn?
BAP cho hiệu quả nhân chồi cao hơn Kinetin. Nồng độ BAP tối ưu (0,8 mg/l) giúp đạt hệ số nhân chồi 3,78 lần, trong khi nồng độ Kinetin tối ưu (1,0 mg/l) chỉ đạt hệ số nhân 3,06 lần.

4. Tại sao nồng độ NAA 0,25 mg/l được lựa chọn là tối ưu cho việc tạo rễ dù chiều dài rễ ngắn hơn nồng độ 0,10 mg/l?
Mặc dù nồng độ NAA 0,10 mg/l cho chiều dài rễ cao nhất (2,25 cm), nồng độ NAA 0,25 mg/l lại cho số lượng rễ trung bình cao nhất (3,65 rễ/cây so với 2,68 rễ/cây ở mức 0,10 mg/l). Đồng thời, rễ ở nồng độ 0,25 mg/l có màu trắng, xuất hiện nhiều lông hút và chiều dài vừa phải (1,80 cm), giúp rễ cây không bị dập gãy khi thao tác chuyển ra vườn ươm.

5. Than hoạt tính có tác động như thế nào đến khả năng tạo rễ của chồi hoa đồng tiền in vitro?
Than hoạt tính kích thích tốt khả năng phát sinh và vươn dài của rễ. Ở nồng độ tối ưu là 1,5 g/l than hoạt tính, chồi đạt chiều dài rễ cao nhất là 3,31 cm và số rễ trung bình đạt 2,93 rễ/cây (so với đối chứng không bổ sung than hoạt tính chỉ đạt 1,62 cm chiều dài và 1,25 rễ/cây).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vi Thị Hà đã giải quyết trọn vẹn hai mục tiêu thực nghiệm về xác định môi trường nhân nhanh chồi và môi trường ra rễ in vitro cho cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii). Các kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng môi trường MS bổ sung 0,8 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 3,78 lần, và môi trường 1/2 MS bổ sung 0,25 mg/l NAA tạo điều kiện tối ưu để rễ phát triển hoàn chỉnh với 3,65 rễ/cây. Nghiên cứu cung cấp hệ thống dẫn liệu thực nghiệm có giá trị khoa học và độ tin cậy thống kê cao, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng để hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoa đồng tiền phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jamesonii (còn gọi là hoa mặt trời hay hoa phu lăng) [1]. Hoa đồng tiền rất phong phú, đa dạng với nhiều màu sắc khác nhau như: đỏ, cam, vàng, trắng, hồng phấn, tím,… Trên một bông hoa có thể có một màu đơn hoặc nhiều màu xen kẽ. Hoa đồng tiền là hoa lý tưởng để làm bó hoa, lẵng hoa và cắm nghệ thuật.

Ngoài ra, đồng tiền có thể được trồng vào chậu để chơi cả chậu hoa trong suốt một thời gian dài, đặt trong phòng làm việc, phòng khách rất phù hợp. Trong sản xuất, cây hoa đồng tiền là loài hoa có giá trị kinh tế cao: Hoa đồng tiền có thể trồng một lần và cho thu quanh năm, mỗi cây cho khoảng từ 50 - 60 bông/năm [1], 1 ha hoa đồng tiền có thể trồng khoảng 60.000 cây [3]; giá một bông hoa đông tiền trên thị trường khoảng từ 2000 - 3000 đồng/bông. Tuy giá trị trên đầu bông hoa đồng tiền không cao như hoa lily, hoa phăng, hoa layon. nhưng nếu xét về mặt hiệu quả kinh tế thu được trên một đơn vị diện tích lại khá cao.

Hoa đồng tiền ở nước ta được nhập nội từ những năm 1940 và đến nay đã phát triển ra nhiều tỉnh thành trong cả nước. Tuy nhiên, diện tích trồng hoa đồng tiền trong cả nước còn thấp, chất lượng hoa của một số vùng còn yếu, chủ yếu được trồng ở một số địa phương có điều kiện như: Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, Thành Phố Hồ Chí Minh,…Nguyên nhân của hạn chế về diện tích và chất lượng hoa là [3]: + Thiếu giống tốt và thường xuyên phải nhập nội chủ yếu từ Hà Lan và Trung Quốc với giá thành cao và không rõ nguồn gốc, thiếu chủ động. Do vây, chi phí sản xuất của người trồng hoa bị nâng cao, từ đó giá thành sản xuất cũng lên cao. + Hoa đồng tiền thường nhiễm bệnh nhất là nấm phytophthora trong điều kiện trồng trọt ở vùng nhiệt đới nước ta.

Với nguồn nước ô nhiễm, vệ n 2 sinh đồng ruộng kém, cành hoa bị cắt sát đất dễ mẫn cảm với bệnh nên các giống đồng tiền bị thoái hóa rất nhanh. Do vậy, công tác nghiên cứu chọn tạo, nhập nội,tuyển chọn giống hoa đồng tiền thích nghi với điều kiện khí hậu nước ta có ý nghĩa rất quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất, tăng thu nhập cho người dân. Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần vào công tác nhân giống cũng như hoàn thiện quy trình kỹ thuật thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng và hiệu quả sản xuất hoa đồng tiền, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ghóp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện được quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

Mục tiêu của đề tài - Xác định được hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (Kinetine và BAP), và nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi hoa đồng tiền. - Xác định được hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi hoa đồng tiền. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống cây hoa đồng tiền nhằm cung cấp giống với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về cây hoa đồng tiền 2.

Nguồn gốc và phân loại Cây hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jameanii có nguồn gốc từ Nam Phi. Theo hệ thống học thực vật mới nhất, cây hoa đồng tiền được phân loại như sau: Giới : Plantae Nghành : Magnoliopsida Lớp : Magnoliopsida (lớp 2 lá mầm) Bộ : Asteraceae (hoa cúc) Phân họ : Mutisioideae Chi : Gerbera Chi đồng tiền Gerbera có khoảng 40 loài. Các giống trồng hiện nay là con lai giữa G. viridifilia Schult Bip và G.

jamesonii với các giống lai tự nhiên ở Nam Phi. Năm 1889, đồng tiền được Hoorker miêu tả lần đầu tiên trong tạp chí tư vấn Curtis dưới tên gọi Cúc Transrace hay Cúc barbetan. Theo Hà Tiểu Đệ và Cs (2000)[15], cây hoa đồng tiền là cây thân thảo, rễ chùm, cao 50 - 60cm. Thân có lông, lá đứng, hình dạng lá thay đổi theo sự sinh trưởng từ dạng trứng đến dạng trứng dài, lá dài từ 15 - 25cm, rộng 5 - 8cm hình xẻ thùy rộng và sâu, mặt dưới lá có lớp lông nhung.

Hoa đồng tiền có dạng cụm, hoa đầu lớn, cụm hoa dạng đầu, bề ngoài là một bông hoa, trên thực tế là một tập hợp nhiều bông hoa nhỏ riêng biệt. Phía ngoài hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc xếp thành một hoặc vài vòng. Do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên tâm hoa rất được chú ý trong chọn tạo giống mới. Hoa đồng tiền nở theo thứ tự ngoài vào trong, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình tia nở sau theo từng vòng một.

Hoa đồng tiền có khoảng 40 loài thuộc loại hoa lưu niên ra hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao, được coi là loại hoa đẹp trong thế giới hoa. Dựa vào hình thái hoa, người ta chia thành 3 nhóm: Hoa kép, hoa đơn, hoa đơn nhị kép [4]. n 4 Nhóm 1: Đồng tiền đơn: hoa chỉ có 1 hoặc 2 tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo thành vòng tròn. Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình là trắng, đỏ, tím, hồng.

Nhóm 2: Hoa đồng tiền kép: cánh hoa to gồm hơn 2 tầng, bông to, đường kính có thể đạt tới 12 - 15cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính, cuống dài 40 - 60cm. Màu sắc đa dạng như trắng, đỏ, vàng, hồng, gạch cua. Nhóm 3: Hoa đồng tiền đơn nhị kép: bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm màu này không đẹp bằng hoa kép. Như vậy, trong 3 nhóm hoa trên, hoa đồng tiền kép là nhóm hoa có giá trị cao, được ưa chuộng hơn cả và cũng là đối tượng lý tưởng của nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Đặc điểm thực vật học của cây hoa đồng tiền Cây hoa đồng tiền thuộc loại cây thân thảo họ cúc. - Thân, lá: thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa phát triển từ thân. Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 - 45o, hình dáng lá thay đổi theo giống và sự sinh trưởng của cây, từ hình trứng thuôn đến hình thuôn dài. Lá dài từ 15 - 25cm, rộng 5 - 8cm, có hình lông chim, sẻ thùy nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung [4].

- Rễ: rễ đồng tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống, ăn ngang và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra [4]. - Hoa: đồng tiền do hai loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là loại hoa tự đơn hình đầu. Hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc ở phía ngoài xếp thành vòng hoặc vài vòng nhỏ, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa, rất được chú trọng. Trong quá trình hoa nở hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự ngoài vào theo từng vòng một [4].

- Quả: Quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, 1g hạt có khoảng 280 - 300 hạt [4]. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và ở Việt Nam 2. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới Năm 1697 Relomen phái hiện thấy ở vùng phía Nam châu Phi (Delasnia) và ông đã đưa về vườn thực vật nước Anh. Irwin Luynch là người đầu tiên tiến hành lai tạo các giống đồng tiền với nhau [4].

Sau đó người Pháp và người Hà Lan cũng tiến hành lai tạo và dần dần hai nước này đã trở thành trung tâm tạo giống đồng tiền thế giới. Từ năm 1980, mỗi năm thế giới đã tạo ra được trên 80 chủng loại giống khác nhau, hoa có đường kính 8cm trở lên và tạo ra những giống lai cánh hoa kép. Hiện nay, các giống hoa đồng tiền to đang được trồng rộng rãi trong sản xuất, phần lớn các giống hoa đồng tiền mới là do các nhà tạo giống Hà Lan tạo ra. Hoa đồng tiền là một trong mười loại hoa quan trọng nhất thế giới (sau hoa Hồng, Cúc, Lan, Cẩm chướng, layon).

Các nước có sản lượng hoa lớn là: Hà Lan, Colombia, Pháp, Trung Quốc… Ở các nước này hầu hết đồng tiền được trồng trong nhà có mái che có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, tưới nước, bón phân bằng chế độ tự động hoặc bán tự động. Do đó, năng suất, chất lượng hoa đồng tiền của các nước này rất cao: đạt 4,8 triệu bông hoa/ha/năm. Theo Hà Tiểu Đệ, (2000)[15], diện tích trồng hoa của Hà Lan là 8.017 ha, đạt giá trị sản lượng 3. Hầu hết các giống hoa đồng tiền tại Hà Lan là những giống hoa lai, hoa to, được những nhà chọn tạo giống của Hà Lan lai tạo ra, trong đó công ty Florist của Hà Lan là một cơ sở quan trọng về nghiên cứu, buôn bán và sản xuất hoa đồng tiền của thế giới.

Ở Hà Lan, hoa đồng tiền được trồng chủ yếu là sản phẩm của nuôi cấy mô, đây cũng chính là loại hoa quan trọng nhất chiếm khoảng 90% tổng sản phẩm hoa từ nuôi cấy mô năm 1984. Tại Trung Quốc, ngay từ những năm 1920,hoa đồng tiền cắt cành đã được sản xuất ở Mai Long, Thượng Hải song phát triển rất kém do giống bị thoái hóa trầm trọng. Từ năm 1987 đến nay, nhờ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô nên đã khắc phục được tình trạng thoái hóa giống, qua đó diện tích trồng hoa đồng tiền ngày một mở rộng và phát triển. Cơ sở trồng hoa đầu tiên ở Thượng Hải có 35 ha, Giang Tô có 6 ha, sau n 6 đó Viện nghiên cứu khoa học rau quả và nông trường Liên Vân lần đầu tiên thử nghiệm trên quy mô lớn.Tình hình sản xuất hoa đồng tiền ở Việt Nam Hoa đồng tiền là 1 trong 10 loại hoa quan trọng nhất trên thế giới, sau hồng, cúc, lan.