Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc họ Cà (Solanaceae), là một trong những loại cây rau gia vị có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, được canh tác và tiêu thụ rộng rãi tại Việt Nam cũng như trên phạm vi quốc tế. Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) năm 2013, ngành sản xuất ớt trên thế giới đạt sản lượng lớn; trong đó Việt Nam đứng thứ 7 thế giới về diện tích canh tác và thứ 5 về sản lượng, với các mặt hàng xuất khẩu chủ lực gồm ớt bột và ớt quả khô sang các thị trường Nhật Bản, Hồng Kông, Singapore, Nga, Tiệp Khắc, Hungary, Bulgaria. Với diện tích trồng ớt hàng năm xấp xỉ 26.000 ha, nhu cầu hạt giống ớt trong nước đạt khoảng 2,6 tấn/năm, tương đương giá trị 2 triệu USD. Tuy nhiên, phần lớn các giống ớt phục vụ sản xuất hiện nay là các giống lai F1 nhập khẩu từ nước ngoài (năm 2010 nhập 2,2 tấn trị giá gần 700.000 USD; năm 2011 nhập 6,5 tấn trị giá 2,5 triệu USD), dẫn đến sự phụ thuộc lớn về nguồn giống thương mại.

Bên cạnh đó, các hoạt động đốt nương làm rẫy, khai thác rừng và cháy rừng tại các vùng đồi núi miền Trung và Tây Nguyên trong những năm gần đây đang làm thu hẹp nghiêm trọng vùng phân bố tự nhiên của các giống ớt bản địa, đặc biệt là nguồn gen ớt Xiêm rừng. Tại Việt Nam, công tác nghiên cứu đa dạng nguồn gen cây ớt trước đây chủ yếu dựa trên các chỉ thị hình thái nông học. Phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế do chịu ảnh hưởng lớn từ điều kiện ngoại cảnh, hiện tượng đồng quy tính trạng và khó phân biệt ở các giai đoạn sinh trưởng sớm. Việc tư liệu hóa, đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử đối với các giống ớt bản địa là nhiệm vụ cấp thiết nhằm phục vụ công tác bảo tồn, lưu giữ nguồn gen và chọn tạo giống thích nghi.

Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số giống ớt thu thập tại Quảng Nam và Gia Lai bằng chỉ thị ITS và rbcL”. Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu được xác định cụ thể trong văn bản gồm:

  1. Mục đích của đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử nhằm xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài ớt bản địa, làm cơ sở khoa học phục vụ công tác phân loại, bảo tồn và định hướng chọn tạo giống.
  2. Yêu cầu của đề tài:
    • Thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và giải trình tự các vùng gen ITS và rbcL của 25 mẫu ớt nghiên cứu.
    • Đánh giá hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các mẫu ớt nghiên cứu.
  3. Nội dung nghiên cứu cụ thể:
    • Giải trình tự vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 và so sánh trình tự vùng gen ở 25 mẫu ớt thu thập.
    • Giải trình tự vùng gen rbcL và so sánh trình tự vùng gen ở 05 mẫu ớt đại diện.
  4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng nghiên cứu: 25 mẫu lá ớt thuộc 5 nhóm giống địa phương và bản địa gồm ớt Xiêm Nhỏ (05 mẫu: XN1–XN5), ớt Xiêm Trung Bình (05 mẫu: XTB1–XTB5), ớt Xiêm Lớn (05 mẫu: XL1–XL5), ớt A.Riêu (05 mẫu: AR1–AR5) thu thập tại tỉnh Quảng Nam và ớt Bay (05 mẫu: B1–B5) thu thập tại tỉnh Gia Lai.
    • Không gian thực hiện: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp.
    • Thời gian thực hiện: Từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 5 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về mặt lý thuyết, chi Capsicum có khoảng 20–30 loài và loài phụ, trong đó có 5 loài chính được thuần hóa và canh tác: Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Capsicum chinense, Capsicum baccatum, và Capsicum pubescens. Các loài ớt trồng có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 24, một số dạng hoang dại có 2n = 24 hoặc 2n = 26. Trong phân loại học thực vật phân tử, việc sử dụng các chỉ thị DNA khắc phục được nhược điểm của chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh (Isozyme). Các đoạn chỉ thị mã vạch DNA (DNA barcode) được ứng dụng phổ biến gồm các vùng gen lục lạp (rbcL, matK) và vùng phiên mã nội bộ của DNA ribosome nhân (ITS - Internal Transcribed Spacer).

Vùng ITS nhân (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có kích thước dưới 700 bp ở thực vật hạt kín, chứa vùng gen 5,8S rDNA bảo tồn xen kẽ hai vùng đệm không mã hóa ITS1 và ITS2 có tốc độ đột biến cao, di truyền theo cả dòng bố và mẹ, rất hữu hiệu trong xác định quan hệ phát sinh loài ở cấp độ loài và dưới loài. Vùng gen lục lạp rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit) mã hóa tiểu phần lớn của enzyme RuBisCO, có mức độ bảo tồn tiến hóa cao, đã được Liên minh Mã vạch Sự sống (CBOL) công nhận là một trong hai locus mã vạch chuẩn cho giới thực vật.

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực kết hợp phân tích tin sinh học:

  • Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng phương pháp CTAB theo quy trình của Doyle and Doyle (1987) có cải tiến. Mẫu lá tươi (0,3 g) được nghiền mịn trong nitơ lỏng (-80°C), ly giải trong 800 µl đệm CTAB (Tris-base 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%) bổ sung 60 µl SDS 10% ở 65°C trong 30 phút. Protein được tủa bằng 200 µl potassium acetate 5 M trên đá trong 45 phút, chiết 2 lần bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), tủa DNA bằng isopropanol lạnh, rửa tủa bằng ethanol 70% và hòa tan DNA trong đệm TE.
  • Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR thực hiện trên máy Mastercycler epgradient S với tổng thể tích 15 µl/phản ứng, sử dụng các hóa chất của hãng Sigma và Fermentas.
STT Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl)
1 Nước cất hai lần khử ion 9,0
2 Đệm phản ứng (Buffer Mg²⁺ 25 mM) 1,5
3 Hỗn hợp dNTPs 10 mM 0,3
4 Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,2
5 Mồi xuôi (Forward primer) 1,5
6 Mồi ngược (Reverse primer) 1,5
7 DNA khuôn (DNA template) 1,0
Tổng Tổng thể tích phản ứng 15,0

Cặp mồi khuếch đại vùng ITS:

  • Mồi xuôi ITS1: 5'-GGTTCAAGTCCCTCTATCCC-3'
  • Mồi ngược ITS8: 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3'

Cặp mồi khuếch đại vùng rbcL:

  • Mồi xuôi rbcL-F: 5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3'

  • Mồi ngược rbcL-R: 5'-CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC-3'

  • Điện di và tinh sạch: Sản phẩm PCR bổ sung 4 µl loading dye, điện di kiểm tra trên bản gel agarose 1% (pha trong đệm TAE 1X, nhuộm Ethidium Bromide) và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV). Đoạn DNA mục tiêu được cắt thôi gel và tinh sạch bằng kit thôi gel Qiagen (sử dụng cột QIAquick, đệm QG, đệm PE) và cột Sigma GenElute™ Agarose Spin column.

  • Giải trình tự và xử lý số liệu tin sinh học: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gửi giải trình tự nucleotide hai chiều tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Dữ liệu trình tự được đối chiếu tương đồng thông qua công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank. Gióng hàng trình tự bằng thuật toán ClustalW tích hợp trong phần mềm MEGA phiên bản 6.0. Phân tích khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền bằng phần mềm CLC Genomics Workbench (phiên bản 8.02). Cây quan hệ phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (ML) trên phần mềm MEGA v6.0.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ tiềm năng kinh tế lớn của cây ớt, thực trạng suy giảm nguồn gen ớt bản địa tại Quảng Nam và Gia Lai do phá rừng, sự phụ thuộc vào giống nhập khẩu và sự thiếu hụt các công trình đánh giá nguồn gen cây ớt bản địa ở cấp độ phân tử tại Việt Nam. Trên cơ sở đó, tác giả xác định mục tiêu tổng quát, 2 yêu cầu kỹ thuật và 2 nội dung nghiên cứu trọng tâm liên quan đến việc phân tích 2 vùng gen ITS và rbcL trên tập đoàn 25 mẫu ớt thu thập.

Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở dữ liệu lý luận và thực tiễn phong phú, bao gồm:

  • Phân loại và đặc tính sinh học chi Capsicum: Nguồn gốc xuất xứ từ châu Mỹ, phân bố canh tác toàn cầu và đặc điểm phân loại của 5 loài canh tác chính theo mô tả của Greenleaf (1986). Các loài phân biệt rõ qua màu cánh hoa, đài hoa, số hoa trên cuống và đốm màu tràng hoa. Cây ớt có bộ gen lưỡng bội 2n = 24 (cây trồng) hoặc 2n = 26 (hoang dại); sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 18–30°C; độ ẩm đất thích hợp 70–85%. Thành phần quả chứa chất cay capsaicin (C₁₈H₂₇NO₃, trong văn bản tác giả ghi công thức C₁₂H₇NO₃ chiếm 0,05–0,2%), hàm lượng vitamin C đạt 250 mg/100g tươi.
  • Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền thực vật: Phân tích ưu - nhược điểm của chỉ thị hình thái (dễ thực hiện nhưng dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường, hiện tượng đồng quy), chỉ thị hóa sinh Isozyme (hạn chế về số lượng locus), và các hệ thống chỉ thị phân tử DNA: RFLP, RAPD, SSR, cùng các trình tự mã vạch phân tử DNA lục lạp (rbcL, matK) và nhân (ITS rDNA).
  • Lịch sử nghiên cứu nguồn gen cây ớt: Tổng thuật các công trình nghiên cứu di truyền trên cây ớt từ năm 1995 đến 2017: bản đồ liên kết của Lefebvre (1995) với 85 chỉ thị RFLP và RAPD (chiều dài 820 cM); nghiên cứu quần thể lai của Livingstone (1999) dài 1.246 cM; nghiên cứu của Lee và cộng sự (2010) với 197 AFLP và 21 SSR bao phủ 325 cM; nghiên cứu định vị QTL kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum trên nhiễm sắc thể P5 của dòng C. chinense PBC932 (Ying và cộng sự, 2015); nghiên cứu của Makari (2009), Tilahun (2013) tại Ấn Độ; và các công trình trong nước của Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2010) trên 32 mẫu giống bằng RAPD, Trương Trọng Ngôn (2013) trên 16 giống ớt nhập nội bằng 7 mồi SSR (trung bình 5,15 alen/locus, PIC từ 0,63–0,85).

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày danh mục 25 mẫu lá ớt nghiên cứu (ký hiệu từ 1 đến 25: 5 mẫu ớt Xiêm Nhỏ XN1–XN5, 5 mẫu ớt Xiêm Trung Bình XTB1–XTB5, 5 mẫu ớt Xiêm Lớn XL1–XL5, 5 mẫu ớt A.Riêu AR1–AR5 và 5 mẫu ớt Bay B1–B5); hóa chất, thiết bị sinh học phân tử; địa điểm và khung thời gian thực nghiệm (10/2021–05/2022 tại Viện Di truyền Nông nghiệp). Mô tả chi tiết các bước trong quy trình tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến, thành phần phản ứng PCR (15 µl), thông số cặp mồi ITS1/ITS8 và rbcL-F/rbcL-R, kỹ thuật điện di gel agarose 1%, phương pháp thôi gel tinh sạch bằng cột spin và các công cụ tin sinh học (MEGA 6.0, CLC v8.02, BLAST).

Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được:

  • Kết quả tách chiết DNA và khuếch đại PCR: Điện di kiểm tra DNA tổng số cho thấy các băng sáng rõ, đồng đều, không bị thoái dưỡng. Khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 25 mẫu và rbcL-F/rbcL-R trên 05 mẫu đại diện đều cho một băng đặc hiệu duy nhất, kích thước tập trung trong khoảng 600–700 bp.
  • Phân tích trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2: Chiều dài đoạn giải mã của 25 mẫu dao động từ 582 đến 597 nucleotide. Mẫu ngắn nhất là XTB2 (582 nt), dài nhất gồm XN2, XN3, B3, B5 (597 nt). Tỷ lệ thành phần %GC trung bình đạt 61,4%, %AT trung bình đạt 38,6%. Mẫu XN5 có tỷ lệ %GC cao nhất (64,2%) và %AT thấp nhất (35,8%). Sự biến động nucleotide tập trung mạnh tại 20 nucleotide đầu và hơn 300 nucleotide cuối (tương ứng với hai vùng đệm không mã hóa ITS1 và ITS2), trong khi vùng gen 5,8S ở giữa có tính bảo tồn cao.
STT Ký hiệu mẫu Số nucleotide STT Ký hiệu mẫu Số nucleotide
1 XN1 (Xiêm Nhỏ) 588 14 XL4 (Xiêm Lớn) 587
2 XN2 (Xiêm Nhỏ) 597 15 XL5 (Xiêm Lớn) 594
3 XN3 (Xiêm Nhỏ) 597 16 B1 (Ớt Bay) 583
4 XN4 (Xiêm Nhỏ) 585 17 B2 (Ớt Bay) 596
5 XN5 (Xiêm Nhỏ) 595 18 B3 (Ớt Bay) 597
6 XTB1 (Xiêm Trung Bình) 586 19 B4 (Ớt Bay) 587
7 XTB2 (Xiêm Trung Bình) 582 20 B5 (Ớt Bay) 597
8 XTB3 (Xiêm Trung Bình) 595 21 AR1 (A.Riêu) 596
9 XTB4 (Xiêm Trung Bình) 593 22 AR2 (A.Riêu) 589
10 XTB5 (Xiêm Trung Bình) 596 23 AR3 (A.Riêu) 593
11 XL1 (Xiêm Lớn) 594 24 AR4 (A.Riêu) 583
12 XL2 (Xiêm Lớn) 594 25 AR5 (A.Riêu) 595
13 XL3 (Xiêm Lớn) 595
  • Hệ số tương đồng di truyền theo vùng ITS: Dao động từ 81,27% đến 98,99%; khoảng cách di truyền biến thiên từ 0,01 đến 0,19. Xét theo từng nhóm giống:
    • Giống ớt Xiêm Nhỏ (Quảng Nam): hệ số tương đồng dao động từ 83,58% đến 93,63% (đa dạng cao nhất trong các giống ớt Quảng Nam).
    • Giống ớt Xiêm Lớn (Quảng Nam): hệ số tương đồng dao động từ 90,91% đến 98,99%.
    • Giống ớt A.Riêu (Quảng Nam): hệ số tương đồng dao động từ 85,95% đến 92,31%.
    • Giống ớt Xiêm Trung Bình (Quảng Nam): hệ số tương đồng dao động từ 88,13% đến 92,62% (đa dạng thấp nhất).
    • Giống ớt Bay (Gia Lai): hệ số tương đồng dao động từ 86,01% đến 92,29%.
  • Cây quan hệ phát sinh chủng loại theo vùng ITS: Phân chia 25 mẫu thành 2 nhóm chính:
    • Nhóm I (07 mẫu): Toàn bộ 05 mẫu ớt A.Riêu Quảng Nam (AR1, AR2, AR3, AR4, AR5) và 02 mẫu ớt Bay Gia Lai (B1, B3).
    • Nhóm II (18 mẫu): Phân thành 2 nhóm phụ:
      • Nhóm phụ 2.1 (09 mẫu): Toàn bộ 05 mẫu ớt Xiêm Nhỏ (XN1–XN5), 02 mẫu ớt Xiêm Lớn (XL4, XL5), 01 mẫu ớt Xiêm Trung Bình (XTB5) và 01 mẫu ớt Bay (B2).
      • Nhóm phụ 2.2 (09 mẫu): 03 mẫu ớt Xiêm Lớn (XL1, XL2, XL3), 04 mẫu ớt Xiêm Trung Bình (XTB1–XTB4) và 02 mẫu ớt Bay (B4, B5).
    • Các mẫu ớt Bay thu thập tại Gia Lai phân bố rải rác trên cả Nhóm I và các nhóm phụ thuộc Nhóm II, cho thấy đây là giống có mức độ đa dạng di truyền lớn nhất.
  • Phân tích trình tự vùng gen rbcL: Thực hiện trên 05 mẫu đại diện (AR2, B2, XL2, XN2, XTB2). Chiều dài đoạn rbcL của 04 mẫu AR2, B2, XN2, XTB2 là 526 nucleotide; riêng mẫu XL2 dài 527 nucleotide do có đột biến thêm một nucleotide Cytosine (C) tại vị trí 77.
    • Vùng rbcL có tỷ lệ %GC thấp hơn %AT.
    • Về sai khác nucleotide: Chỉ riêng mẫu XL2 phát hiện các đột biến điểm (SNP) so với 4 mẫu còn lại tại các vị trí: vị trí 203 (C/G), 242 (C/G), 304 (C/T), 393 (T/G), 395 (C/G), 402 (T/C), 404 (C/G), 455 (T/A) và 456 (G/A).
    • Hệ số tương đồng di truyền vùng rbcL dao động từ 97,91% đến 100%; khoảng cách di truyền từ 0,00 đến 0,02. Ba mẫu XTB2, XN2 và B2 có mức độ tương đồng tuyệt đối 100% (khoảng cách di truyền bằng 0,00). Mẫu XL2 có hệ số tương đồng thấp nhất (97,91% so với AR2; 98,10% so với B2).
    • Cây phát sinh loài vùng rbcL phân tách 05 mẫu thành 2 nhánh: Nhánh 1 gồm 4 mẫu (AR2, XN2, XTB2, B2) và Nhánh 2 chỉ gồm duy nhất mẫu XL2.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp bộ dẫn liệu phân tử hoàn chỉnh về hai chỉ thị mã vạch DNA (ITS nhân và rbcL lục lạp) trên 25 mẫu ớt bản địa tại hai vùng sinh thái Quảng Nam và Gia Lai:

  1. Kết quả định lượng cụ thể:
    • Hoàn thiện quy trình tách chiết DNA chất lượng cao và khuếch đại thành công 25 phân đoạn ITS (582–597 bp) và 05 phân đoạn rbcL (526–527 bp).
    • Xác định được dải hệ số tương đồng di truyền của tập đoàn mẫu: vùng ITS dao động từ 81,27% đến 98,99% (khoảng cách 0,01–0,19); vùng rbcL đạt mức tương đồng cao từ 97,91% đến 100% (khoảng cách 0,00–0,02).
    • Phát hiện các đặc điểm nucleotide đặc trưng: vùng ITS giàu GC (trung bình 61,4%); vùng rbcL giàu AT. Phát hiện đột biến thêm nucleotide C tại vị trí 77 và 9 vị trí thay thế nucleotide đơn (SNP) trên đoạn gen rbcL của mẫu ớt Xiêm Lớn XL2.
  2. Đóng góp khoa học và ứng dụng:
    • Đây là công trình thực nghiệm phân tử có tính hệ thống trên nguồn gen ớt địa phương quý hiếm (ớt Xiêm rừng, ớt A.Riêu, ớt Bay), khắc phục sự thiếu hụt thông tin di truyền vốn trước đây chỉ dựa vào phân loại hình thái.
    • Chứng minh được vùng ITS1-5,8S-ITS2 có độ biến dị cao, phù hợp để phân loại và đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ dưới loài hoặc phân biệt các giống ớt địa phương; trong khi vùng gen lục lạp rbcL có tính bảo tồn cao, thích hợp xác định quan hệ họ hàng phân loại ở bậc cao hơn.
    • Xác định giống ớt Bay (Gia Lai) có tính đa dạng di truyền nội bộ cao nhất và phân bố rải rác trên cây phát sinh loài, từ đó đề xuất định hướng khai thác giống ớt Bay làm vật liệu bố mẹ khởi đầu trong các chương trình lai tạo và cải tiến giống ớt cay.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ rõ các hạn chế và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo dựa trên phạm vi thực tế:

  • Hạn chế: Số lượng mẫu khảo sát còn giới hạn (25 mẫu lá) và phạm vi địa lý mới chỉ tập trung tại hai tỉnh Quảng Nam và Gia Lai; việc phân tích đoạn gen rbcL mới chỉ tiến hành trên 05 mẫu đại diện cho 5 giống.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Tiếp tục điều tra, thu thập mở rộng thêm các mẫu giống ớt bản địa tại các vùng sinh thái và địa phương khác trên cả nước để nâng cao tính khách quan và quy mô của cơ sở dữ liệu.
    • Bổ sung và phối hợp thêm các chỉ thị mã vạch lục lạp khác có tốc độ tiến hóa nhanh hơn như vùng gen matK hoặc vùng đệm liên gen trnH-psbA nhằm tăng cường độ phân giải phân loại đối với các loài có quan hệ họ hàng gần.
    • Kết hợp đồng thời các chỉ thị phân tử đa locus khác như RAPD, SSR để đánh giá toàn diện tính đa hình và cấu trúc di truyền quần thể, phục vụ hiệu quả cho công tác nghiên cứu, chọn giống và giảng dạy.

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu:

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, cán bộ nghiên cứu và giảng viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật, Bảo vệ thực vật, Nông học và Quản lý tài nguyên sinh vật.
  • Các nội dung có giá trị ứng dụng cao:
    • Quy trình tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến xử lý triệt để các hợp chất thứ sinh trong mô lá cây họ Cà.
    • Bộ thông số phản ứng PCR, trình tự các cặp mồi chuyên biệt (ITS1/ITS8, rbcL-F/rbcL-R) và chu trình nhiệt chuẩn.
    • Phương pháp phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MEGA v6.0 và đo khoảng cách di truyền bằng CLC Genomics Workbench.
    • Dữ liệu trình tự và hệ số tương đồng di truyền của các giống ớt đặc sản bản địa (ớt A.Riêu Quảng Nam, ớt Bay Gia Lai, ớt Xiêm rừng), phục vụ đối chiếu cho các đề tài bảo tồn nguồn gen nông nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Chiều dài đoạn trình tự và thành phần nucleotide của vùng ITS1-5,8S-ITS2 ở 25 mẫu ớt biến động như thế nào?
Chiều dài vùng trình tự ITS1-5,8S-ITS2 ở 25 mẫu dao động từ 582 đến 597 nucleotide (ngắn nhất là mẫu XTB2 với 582 nt, dài nhất gồm các mẫu XN2, XN3, B3, B5 đạt 597 nt). Về thành phần nucleotide, tất cả các mẫu đều có hàm lượng (G+C) cao hơn (A+T); tỷ lệ %GC trung bình toàn bộ 25 mẫu là 61,4% và %AT trung bình là 38,6%. Mẫu XN5 có tỷ lệ %GC cao nhất đạt 64,2% (tương ứng %AT thấp nhất 35,8%). Sự sai khác trình tự xảy ra tập trung ở 20 nucleotide đầu và hơn 300 nucleotide cuối, tương ứng hai vùng đệm không mã hóa ITS1 và ITS2.

2. Điểm khác biệt di truyền nổi bật của mẫu ớt Xiêm Lớn XL2 so với các mẫu còn lại trên vùng gen lục lạp rbcL là gì?
Trong khi 04 mẫu đại diện còn lại (AR2, B2, XN2, XTB2) đều có chiều dài đoạn rbcL là 526 nucleotide, mẫu XL2 có chiều dài 527 nucleotide do mang một đột biến thêm nucleotide Cytosine (C) tại vị trí 77. Ngoài ra, mẫu XL2 còn xuất hiện các đột biến thay thế nucleotide đơn (SNP) tại các vị trí 203 (C thay vì G), 242 (C thay vì G), 304 (C thay vì T), 393 (T thay vì G), 395 (C thay vì G), 402 (T thay vì C), 404 (C thay vì G), 455 (T thay vì A) và 456 (G thay vì A). Sự sai khác này khiến hệ số tương đồng của mẫu XL2 với các mẫu khác giảm xuống mức 97,91%–98,10%.

3. Cây phát sinh loài xây dựng từ trình tự ITS1-5,8S-ITS2 phân chia 25 mẫu ớt thành những nhóm nào?
Cây phát sinh loài phân chia 25 mẫu thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm 07 mẫu (toàn bộ 05 mẫu ớt A.Riêu Quảng Nam AR1–AR5 và 02 mẫu ớt Bay Gia Lai B1, B3); Nhóm II gồm 18 mẫu được tách thành 2 nhóm phụ: Nhóm phụ 2.1 gồm 09 mẫu (toàn bộ 05 mẫu ớt Xiêm Nhỏ XN1–XN5, 02 mẫu Xiêm Lớn XL4, XL5, 01 mẫu Xiêm Trung Bình XTB5 và 01 mẫu ớt Bay B2); Nhóm phụ 2.2 gồm 09 mẫu (03 mẫu Xiêm Lớn XL1, XL2, XL3, 04 mẫu Xiêm Trung Bình XTB1–XTB4 và 02 mẫu ớt Bay B4, B5).

4. Thành phần một phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn gen ITS và rbcL được bố trí với liều lượng ra sao?
Một phản ứng PCR có tổng thể tích 15 µl, bao gồm: 9,0 µl nước cất hai lần khử ion; 1,5 µl đệm Buffer Mg²⁺ 25 mM; 0,3 µl dNTPs 10 mM; 0,2 µl enzyme Taq DNA Polymerase (nồng độ 5 U/µl); 1,5 µl mồi xuôi; 1,5 µl mồi ngược và 1,0 µl dung dịch DNA khuôn.

5. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền đưa ra gợi ý gì cho công tác chọn tạo giống ớt?
Kết quả phân tích phân tử cho thấy 05 mẫu ớt Bay thu thập tại tỉnh Gia Lai phân bố rải rác trên cả Nhóm I và hai nhóm phụ thuộc Nhóm II của cây quan hệ phát sinh loài. Điều này chứng minh nguồn gen ớt Bay Gia Lai có tính đa dạng di truyền cao nhất trong tập đoàn mẫu khảo sát, do đó có tiềm năng lớn để lựa chọn làm nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ các chương trình lai tạo, phát triển giống ớt mới có năng suất và khả năng thích nghi cao.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Khánh Duyên đã nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền của 25 mẫu ớt thu thập tại Quảng Nam và Gia Lai bằng hai chỉ thị phân tử ITS và rbcL. Kết quả giải trình tự và phân tích tin sinh học cho thấy các mẫu ớt có sự sai khác di truyền rõ rệt trên vùng ITS (độ tương đồng 81,27%–98,99%) và bảo tồn cao trên vùng rbcL (độ tương đồng 97,91%–100,00%). Trong đó, giống ớt Bay Gia Lai thể hiện mức độ đa dạng cao nhất, phân bố đa dạng trên các nhánh cây phát sinh loài. Đây là công trình thực nghiệm phân tử có độ tin cậy cao, tạo tiền đề khoa học cho công tác phân loại, bảo tồn nguồn gen ớt bản địa và tuyển chọn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống cây trồng.