Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực bắc trường sơn việt nam

Nghiên cứu tính đa hình di truyền và kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại các tỉnh biên giới Bắc Trường Sơn, Việt Nam.

• Tác giả: Trương Văn Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Đình Đạt
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Các loại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở người
• 1.2. Thành phần loại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét ở người
• 1.3. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét
• 1.4. Muỗi truyền bệnh sốt rét
• 1.5. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
• 1.6. Tình hình sốt rét trên thế giới
• 1.7. Tình hình sốt rét tại Việt Nam
• 1.8. Đặc điểm và điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội và tình hình sốt rét tại các tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• 1.9. Một số kỹ thuật sử dụng trong chẩn đoán, phân biệt 4 loại ký sinh trùng sốt rét
• 1.9.1. Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa
• 1.9.2. Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bằng que thử (Rapid diagnostic test)
• 1.9.3. Kỹ thuật PCR chẩn đoán, phân biệt bền loại ký sinh trùng sốt rét
• 1.10. Nghiên cứu tính địa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét
• 1.10.1. Địa hình di truyền của P. falciparum
• 1.10.2. Địa hình di truyền của P. vivax
• 1.11. Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
• 1.11.1. Định nghĩa và phân loại ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
• 1.11.2. Một số loại thuốc sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét
• 1.11.3. Tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc trên thế giới và Việt Nam
• 1.11.4. Cơ chế tác động của thuốc sốt rét đối với ký sinh trùng sốt rét
• 1.11.5. Đột biến gen liên quan đến kháng thuốc sốt rét
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3.1. Dụng cụ và hóa chất cho kỹ thuật xét nghiệm lam máu
• 2.3.2. Thiết bị và hóa chất tách chiết ADN
• 2.3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tiến hành phản ứng PCR
• 2.3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất cho điện di phân tích kết quả PCR
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4.2. Cách đánh giá kết quả
• 2.4.3. Công thức tính các chỉ số và phân tích số liệu nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét tại các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• 3.2. Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa
• 3.3. Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR
• 3.4. Tính địa hình di truyền của quần thể P. falciparum tại khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• 3.4.1. Tính địa hình di truyền của P. falciparum theo locus msp1
• 3.4.2. Tính địa hình di truyền của P. falciparum theo locus msp2
• 3.4.3. Tính địa hình di truyền của P. falciparum theo locus glurp
• 3.5. Tính địa hình di truyền của P. vivax tại khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• 3.5.1. Tính địa hình di truyền của P. vivax theo locus Pvcs
• 3.5.2. Tính địa hình di truyền theo locus Pvmsp1
• 3.6. Đặc điểm ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam
• 3.6.1. Tỷ lệ đột biến của P. falciparum kháng pyrimethamin
• 3.6.2. Tỷ lệ đột biến của P. falciparum kháng sulfadoxin
• 3.6.3. Tỷ lệ đột biến của P. falciparum kháng chloroquin
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tính đa hình di truyền của Plasmodium falciparum

Nghiên cứu về tính đa hình di truyền của Plasmodium falciparum tại khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam, là một vấn đề quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về sự phát triển và kháng thuốc của ký sinh trùng này. Plasmodium falciparum là một trong những loại ký sinh trùng gây sốt rét nghiêm trọng nhất, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, tình hình sốt rét vẫn còn phức tạp, đặc biệt là ở các vùng biên giới như Bắc Trường Sơn. Việc nghiên cứu tính đa hình di truyền không chỉ giúp xác định các biến thể gen mà còn cung cấp thông tin về khả năng kháng thuốc của ký sinh trùng.

1.1. Đặc điểm sinh học của Plasmodium falciparum

Plasmodium falciparum là một trong bốn loài ký sinh trùng gây sốt rét ở người. Loài này có khả năng phát triển nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng. Nghiên cứu cho thấy rằng tính đa hình di truyền của nó có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc, đặc biệt là với các loại thuốc như chloroquin và sulfadoxin.

1.2. Tình hình sốt rét tại Bắc Trường Sơn

Khu vực Bắc Trường Sơn là một trong những vùng có tỷ lệ mắc sốt rét cao tại Việt Nam. Các yếu tố như điều kiện khí hậu, môi trường sống và sự di chuyển của người dân đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của ký sinh trùng. Việc nghiên cứu tình hình sốt rét tại đây giúp xác định các biện pháp phòng chống hiệu quả.

II. Vấn đề kháng thuốc sốt rét tại Bắc Trường Sơn

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn trong điều trị sốt rét. Plasmodium falciparum đã phát triển khả năng kháng với nhiều loại thuốc điều trị, gây khó khăn trong việc kiểm soát bệnh. Tại Bắc Trường Sơn, tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng, đe dọa đến sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu về tính đa hình di truyền có thể giúp xác định các biến thể gen liên quan đến kháng thuốc, từ đó đưa ra các giải pháp điều trị hiệu quả hơn.

2.1. Nguyên nhân gây kháng thuốc

Kháng thuốc ở Plasmodium falciparum có thể do nhiều nguyên nhân, bao gồm việc sử dụng thuốc không đúng cách, sự phát triển của các biến thể gen kháng thuốc, và sự lây lan của các chủng ký sinh trùng kháng thuốc. Việc hiểu rõ nguyên nhân này là rất quan trọng để phát triển các chiến lược điều trị hiệu quả.

2.2. Tình hình kháng thuốc tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình hình kháng thuốc đang trở nên nghiêm trọng. Các nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ kháng thuốc của Plasmodium falciparum đang gia tăng, đặc biệt là ở các vùng biên giới. Việc theo dõi và nghiên cứu tình hình kháng thuốc là cần thiết để đảm bảo hiệu quả của các phương pháp điều trị.

III. Phương pháp nghiên cứu tính đa hình di truyền

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của Plasmodium falciparum tại Bắc Trường Sơn được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phân tích gen, xét nghiệm PCR và các kỹ thuật sinh học phân tử khác. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại giúp xác định chính xác các biến thể gen và mối liên hệ của chúng với khả năng kháng thuốc.

3.1. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp quan trọng trong nghiên cứu di truyền. Phương pháp này cho phép nhân bản DNA của Plasmodium falciparum, từ đó phân tích các biến thể gen liên quan đến kháng thuốc. Sử dụng PCR giúp tăng độ chính xác và độ nhạy trong việc phát hiện các biến thể gen.

3.2. Phân tích gen và xác định biến thể

Phân tích gen là bước quan trọng trong việc xác định các biến thể gen của Plasmodium falciparum. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số biến thể gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về tính đa hình di truyền và kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại Bắc Trường Sơn đã chỉ ra rằng có nhiều biến thể gen liên quan đến khả năng kháng thuốc. Những phát hiện này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn cung cấp cơ sở cho việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sẽ góp phần giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong do sốt rét.

4.1. Ứng dụng trong điều trị sốt rét

Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong việc phát triển các phác đồ điều trị mới cho sốt rét. Việc hiểu rõ về tính đa hình di truyền giúp các bác sĩ lựa chọn thuốc phù hợp hơn, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

4.2. Đề xuất các biện pháp phòng chống

Dựa trên các kết quả nghiên cứu, các biện pháp phòng chống sốt rét có thể được đề xuất, bao gồm việc tăng cường giám sát tình hình kháng thuốc, cải thiện điều kiện sống và vệ sinh môi trường, cũng như nâng cao nhận thức của cộng đồng về phòng chống sốt rét.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về tính đa hình di truyền và kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại Bắc Trường Sơn đã cung cấp nhiều thông tin quý giá. Những phát hiện này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Tương lai của nghiên cứu này sẽ phụ thuộc vào việc tiếp tục theo dõi tình hình kháng thuốc và áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định thêm nhiều biến thể gen và mối liên hệ của chúng với khả năng kháng thuốc. Việc này sẽ giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu về tính đa hình di truyền không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Việc hiểu rõ về cơ chế kháng thuốc sẽ giúp các nhà khoa học và bác sĩ có những quyết định đúng đắn trong việc điều trị và phòng chống sốt rét.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bối cảnh dịch tễ học sốt rét tại Việt Nam trong giai đoạn chuyển tiếp từ kiểm soát sang loại trừ đòi hỏi các công cụ giám sát dịch tễ học phân tử chuyên sâu, đặc biệt tại các khu vực trọng điểm phức tạp. Khu vực Bắc Trường Sơn — tiêu biểu là ba tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế — sở hữu địa hình rừng núi hiểm trở, giao lưu biên giới Việt - Lào mật thiết và là nơi cư trú của đồng bào dân tộc thiểu số như Vân Kiều, Pa Cô, Tà Ôi, Cơ Tu với điều kiện kinh tế - xã hội còn nhiều khó khăn. Mặc dù Chương trình Quốc gia phòng chống sốt rét đã giảm thiểu đáng kể tỷ lệ mắc và tử vong trên toàn quốc so với thời kỳ đỉnh dịch năm 1991 (hơn 1 triệu ca mắc, 4.646 ca tử vong), khu vực Bắc Trường Sơn vẫn duy trì những ổ lan truyền dai dẳng và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) lớn nhất tại thời điểm nghiên cứu chính là sự thiếu hụt các dữ liệu toàn diện ở cấp độ phân tử về cấu trúc di truyền quần thể của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) và thực trạng đột biến kháng thuốc tại dải biên giới miền Trung. Các phương pháp cổ điển như xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa bộc lộ rõ hạn chế: khó phát hiện mật độ ký sinh trùng thấp (< 1 KST/µl máu) và bỏ sót các ca nhiễm phối hợp đa loài mà một loài áp đảo về số lượng (Mehlotra et al., 2000; Snounou et al., 1993). Đồng thời, các thử nghiệm in vivo và in vitro truyền thống đòi hỏi thời gian theo dõi dài ngày, quy trình thu mẫu nghiêm ngặt và không thể phân biệt chính xác giữa tái phát (recrudescence) do điều trị thất bại với tái nhiễm (reinfection) từ vector truyền bệnh (WHO, 2005, 2010).

Luận án của nghiên cứu sinh Trương Văn Hạnh (2013) tại Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tập trung giải quyết ba câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và kiểm định ba giả thuyết khoa học (Hypotheses - H):

• RQ1: Cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét thực tế tại khu vực Bắc Trường Sơn có sự khác biệt như thế nào khi đối sánh giữa kính hiển vi quang học và kỹ thuật sinh học phân tử?
  • H1: Kỹ thuật Nested-PCR chẩn đoán gen 18S rRNA có độ nhạy vượt trội, phát hiện tỷ lệ nhiễm phối hợp và nhiễm loài ẩn (P. vivax, P. malariae) cao hơn đáng kể so với phương pháp soi kính hiển vi Giemsa.
• RQ2: Mức độ đa hình di truyền, số lượng alen và chỉ số đa nhiễm (Multiplicity of Infection - MOI) của quần thể Plasmodium falciparum (msp1, msp2, glurp) và Plasmodium vivax (Pvcs, Pvmsp1) tại thực địa phản ánh điều gì về áp lực miễn dịch và cường độ lan truyền?
  • H2: Quần thể P. falciparum và P. vivax tại vùng biên giới Bắc Trường Sơn sở hữu tính đa hình alen cao và chỉ số MOI lớn, phản ánh cường độ lan truyền dịch tễ liên tục và áp lực chọn lọc tự nhiên mạnh mẽ.
• RQ3: Tỷ lệ và phổ các đột biến điểm đơn nucleotide (SNP) trên các gen dhfr, dhps và Pfcrt của P. falciparum tại các tỉnh biên giới đang ở mức độ nào?
  • H3: Áp lực thuốc điều trị trong quá khứ đã chọn lọc và cố định các đột biến kháng pyrimethamine (dhfr), sulfadoxine (dhps) và chloroquine (Pfcrt) ở mức rất cao trong quần thể KSTSR tự nhiên.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng trên nền tảng Dịch tễ học phân tử (Molecular Epidemiology) và Di truyền học quần thể ký sinh trùng (Parasite Population Genetics), tích hợp cơ chế sinh hóa của chuyển hóa acid folic và cơ chế vận chuyển thuốc qua màng lysosome (Fidock et al., 2000; Wallace, 1989; Warhurst, 2002). Đóng góp mang tính đột phá của công trình là lần đầu tiên thiết lập bức tranh di truyền hoàn chỉnh của P. vivax và công bố dữ liệu biến dị gen kháng thuốc đa điểm (dhfr, dhps, Pfcrt) của P. falciparum tại Quảng Bình và Thừa Thiên Huế giai đoạn 2008–2012, cung cấp bằng chứng định lượng chính xác phục vụ hoạch định chính sách y tế công cộng.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu cấu trúc di truyền và tính kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét trên thế giới đã phát triển qua nhiều giai đoạn với các trường phái phân tích rõ rệt. Về chỉ thị phân tử đa hình kháng nguyên bề mặt, các công trình kinh điển của Viriyakosol et al. (1995), Snounou et al. (1999) và Imwong et al. (2005) đã xác lập các locus gen mã hóa protein bề mặt merozoite (msp1, msp2, Pvmsp1), protein giàu glutamate (glurp) và protein thoa trùng (Pvcs) làm thước đo chuẩn để đánh giá tính đa hình alen và chỉ số MOI. Các đoạn lặp lại song song (tandem repeats) và các vùng biến dị lưỡng hình/tam hình tại các locus này phản ánh sự tiến hóa dưới áp lực chọn lọc miễn dịch của vật chủ.

Trong y văn tồn tại hai cuộc tranh luận học thuật lớn:

1. Độ tin cậy của chỉ số dịch tễ học dựa trên kính hiển vi so với Nested-PCR: Trường phái cổ điển cho rằng soi lam máu nhuộm Giemsa vẫn là tiêu chuẩn vàng thực địa nhờ tính kinh tế và định lượng trực tiếp mật độ ký sinh trùng. Ngược lại, trường phái dịch tễ học phân tử (Snounou et al., 1993; Mehlotra et al., 2000; Zakeri et al., 2003) chứng minh rằng kính hiển vi bỏ sót tới 30–80% các ca nhiễm phối hợp đa loài và nhiễm dưới ngưỡng phát hiện (submicroscopic infections), dẫn đến sai lệch nghiêm trọng trong đánh giá cơ cấu loài thực tế.
2. Mối liên hệ giữa tính đa dạng di truyền (MOI) và cường độ lan truyền: Ferreira et al. (1998) và Soulama et al. (2009) lập luận rằng tại các vùng lưu hành sốt rét cao (holoendemic/hyperendemic) như Tây Phi, tỷ lệ đa nhiễm phối hợp thường >90% và MOI > 3.0 do tần suất tái nhiễm và trao đổi chéo di truyền trong muỗi Anopheles diễn ra dày đặc. Ngược lại, tại các vùng lưu hành thấp hoặc trung bình như Đông Nam Á, MOI thường dao động từ 1.1 đến 1.8 (Ghanchi et al., 2009; Khaminsou et al., 2011).

Về định vị học thuật, luận án đã lấp đầy khoảng trống dữ liệu thực địa tại Tiểu vùng sông Mê Kông — nơi được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận là cái nôi phát sinh và lan truyền của các chủng P. falciparum đa kháng thuốc (multidrug-resistant strains).

Đối sánh với các nghiên cứu quốc tế:

• So sánh với nghiên cứu tại Gabon (Aubouy et al., 2003; 52 mẫu trẻ em, 25 alen msp1, 19 alen msp2, MOI = 4.0) và Burkina Faso (Soulama et al., 2009; 75 mẫu, 41 alen msp1, 29 alen msp2, MOI > 3.0), quần thể P. falciparum Bắc Trường Sơn có mức độ đa dạng alen phong phú (msp1 chia thành các họ alen K1, MAD20, RO33; msp2 gồm FC và IC) nhưng có giá trị MOI trung bình thấp hơn, phù hợp với đặc trưng vùng dịch tễ lưu hành vừa và gián đoạn.
• So sánh với các nghiên cứu tại Pakistan (Ghanchi et al., 2009; MOI msp1 = 1.25, MOI msp2 = 1.22) và Malaysia (Atroosh et al., 2011; locus msp1 chiếm ưu thế bởi dòng RO33 tới 80%, chỉ có 3 alen msp1 và 4 alen msp2), quần thể tại miền Trung Việt Nam thể hiện tính đa dạng cân bằng hơn hẳn giữa các phân họ alen K1, MAD20 và RO33, không bị suy giảm đơn dòng như ở các vùng tiền loại trừ.
• Đối với P. vivax, so với nghiên cứu tại Kolkata, Ấn Độ (Ray et al., 2010; 150/151 mẫu mang kiểu gen VK210, chỉ 1 mẫu mang VK247), dữ liệu luận án cho thấy sự tồn tại song song của cả hai phân nhóm VK210 và VK247, đồng nhất với các quan sát của Imwong et al. (2005) tại Thái Lan và Lê Đức Đào et al. (2007) tại Bình Phước.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Thuyết chọn lọc cân bằng (Balancing Selection Theory) và Thuyết chọn lọc kháng thuốc dưới áp lực điều trị (Drug-Induced Directional Selection Theory) của KSTSR trong bối cảnh thực địa Đông Nam Á:

• Thuyết tiến hóa kháng nguyên bề mặt: Phân tích các locus msp1 (17 block cấu trúc), msp2 (5 block cấu trúc) và glurp (vùng R0, RI, RII) chứng minh rằng các đột biến chèn/mất đoạn nucleotid lặp lại đóng vai trò cơ chế thích nghi chính giúp KSTSR né tránh đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào của vật chủ.
• Mô hình động lực học đột biến kháng thuốc: Khẳng định quy luật tích lũy đột biến từng bước (stepwise mutation accumulation). Đối với pyrimethamine, đột biến khởi đầu S108N trên gen dhfr làm giảm ái lực gắn kết của thuốc với enzyme dihydrofolate reductase; các đột biến phụ N51I, C59R và I164L tiếp tục hiệp đồng gia tăng mức độ kháng từ trung bình đến kháng hoàn toàn. Đối với sulfadoxine, các đột biến điểm S436A/F, A437G, K540E, A581G và A613S/T trên gen dhps cản trở tương tác với enzyme dihydropteroate synthase trong chu trình sinh tổng hợp folate. Đối với chloroquine, đột biến K76T trên gen Pfcrt thay đổi điện tích kênh vận chuyển tại màng không bào tiêu hóa (lysosome), tạo điều kiện cho ion proton hóa $CQH^+$ bị tống xuất ra khỏi lysosome, ngăn cản sự tích tụ phức hợp độc hại ferriprotoporphyrin IX (Fp9).
• Mệnh đề lý thuyết 1 (Proposition 1): Cường độ lan truyền sốt rét tỷ lệ thuận với tính đa hình alen và chỉ số MOI, phản ánh mức độ giao phối ngẫu nhiên giữa các dòng vô tính trong thể giao bào tại dạ dày muỗi.
• Mệnh đề lý thuyết 2 (Proposition 2): Áp lực chọn lọc của đơn trị liệu hoặc phối hợp thuốc cũ (Fansidar, Chloroquine) tạo ra sự thắt cổ chai di truyền (genetic bottleneck), cố định các alen đột biến kháng thuốc (Pfcrt-76T, dhfr-108N, dhps-437G) trong quần thể dù đã ngừng sử dụng thuốc trên diện rộng.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng từ cấp độ phân tử, cá thể đến dịch tễ học quần thể:

1. Tầng 1 - Định danh phân tử siêu nhạy: Sử dụng Nested-PCR khuếch đại đoạn gen đích 18S rRNA đặc hiệu loài nhằm giải mã chính xác cấu trúc loài ký sinh trùng, loại bỏ hiện tượng âm tính giả và dương tính giả của kính hiển vi quang học.
2. Tầng 2 - Cấu trúc di truyền quần thể đa locus (Multi-locus Genotyping): Kết hợp đồng thời 3 locus cho P. falciparum (msp1, msp2, glurp) và 2 locus cho P. vivax (Pvcs, Pvmsp1) để phân giải tính đa hình alen, tỷ lệ nhiễm đơn, tỷ lệ nhiễm phối hợp kiểu gen và tính toán chỉ số MOI.
3. Tầng 3 - Bản đồ đột biến gen kháng thuốc (Pharmacogenomic Profiling): Giải mã các codon đột biến then chốt trên dhfr, dhps và Pfcrt thông qua kỹ thuật Nested-PCR kết hợp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) hoặc khuếch đại alen đặc hiệu (Allele-Specific PCR).

• Điều kiện biên (Boundary conditions): Khung phân tích được thiết kế tối ưu hóa cho các vùng dịch tễ biên giới nhiệt đới, nơi có sự hiện diện đồng thời của P. falciparum và P. vivax, mật độ ký sinh trùng dao động rộng và quần thể người có tính di biến động cao.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ thế giới quan thực chứng (Positivism Paradigm) với thiết kế dịch tễ học mô tả cắt ngang kết hợp phân tích thực nghiệm sinh học phân tử:

• Địa bàn nghiên cứu: Ba huyện biên giới trọng điểm đại diện cho khu vực Bắc Trường Sơn: huyện Lệ Thủy (Quảng Bình), huyện Hướng Hóa (Quảng Trị) và huyện A Lưới (Thừa Thiên Huế).
• Khung thời gian: Thu thập mẫu thực địa và phân tích phòng thí nghiệm trong giai đoạn 2008–2012.
• Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu (Inclusion criteria): Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng sốt rét (sốt, rét run, vã mồ hôi) hoặc người dân sống trong vùng dịch tễ có kết quả xét nghiệm máu dương tính với KSTSR qua kính hiển vi hoặc xét nghiệm chẩn đoán nhanh; đồng ý tham gia nghiên cứu.
• Tiêu chuẩn loại trừ (Exclusion criteria): Bệnh nhân không đồng ý lấy mẫu, mẫu máu không đạt tiêu chuẩn bảo quản ADN hoặc thông tin dịch tễ không đầy đủ.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu được tiêu chuẩn hóa theo khuyến cáo của WHO và Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương:

• Thu thập mẫu thực địa: Mỗi đối tượng được lấy máu đầu ngón tay để làm 02 lam máu (giọt đặc và giọt mỏng) nhuộm Giemsa và thấm 3–4 giọt máu lên giấy thấm chuyên dụng Whatman 3MM. Mẫu giấy thấm được làm khô tự nhiên, đóng gói trong túi zip kèm hạt hút ẩm và bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$.
• Quy trình nhuộm và soi kính hiển vi: Lam máu được nhuộm dung dịch Giemsa 10% trong 20–30 phút, đọc dưới kính hiển vi quang học có dầu soi ở độ phóng đại $1000\times$, quan sát ít nhất 100 vi trường giọt đặc trước khi kết luận âm tính.
• Tách chiết ADN: Sử dụng phương pháp Chelex-100 hoặc bộ kít tách chiết thương mại chuyên biệt (QIAamp DNA Blood Mini Kit) để thu nhận ADN ký sinh trùng có độ tinh sạch cao ($A_{260}/A_{280} = 1.7 - 1.9$).
• Kỹ thuật Nested-PCR định danh loài: Vòng 1 sử dụng cặp mồi tổng quát khuếch đại gen 18S rRNA của chi Plasmodium (rPLU5 và rPLU6); vòng 2 sử dụng sản phẩm vòng 1 làm khuôn với các cặp mồi đặc hiệu loài cho P. falciparum (rFAL1/rFAL2), P. vivax (rVIV1/rVIV2), P. malariae (rMAL1/rMAL2) và P. ovale (rOVA1/rOVA2).
• Phân tích đa hình di truyền:
  • P. falciparum: Khuếch đại locus msp1 (phân định các họ alen K1, MAD20, RO33), msp2 (họ alen FC27 và IC/3D7) và locus glurp (vùng RII) bằng các cặp mồi đặc hiệu theo phác đồ của Snounou et al. (1999).
  • P. vivax: Khuếch đại locus Pvcs (phân định VK210 và VK247) và Pvmsp1 (phân đoạn F1, F2, F3) theo quy trình của Imwong et al. (2005).
• Phân tích đột biến kháng thuốc:
  • Đột biến gen dhfr tại các codon 51, 59, 108, 164 bằng kỹ thuật Nested-PCR/RFLP sử dụng các enzyme cắt giới hạn tương ứng (AluI, BsmAI, Tsp509I).
  • Đột biến gen dhps tại các codon 436, 437, 540, 581, 613 bằng Nested-PCR/RFLP (FokI, AvaII, MnlI).
  • Đột biến gen Pfcrt codon 76 (K76T) bằng PCR-RFLP với enzyme ApoI.
• Kiểm soát chất lượng (Quality Control): Tất cả các mẻ PCR đều sử dụng đối chứng dương (ADN chuẩn của các chủng P. falciparum 3D7, Dd2, HB3 hoặc mẫu đã giải trình tự) và đối chứng âm (nước cất siêu sạch không chứa ADN). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5–2.5%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh phân tích qua hệ thống GelDoc.

Data và phân tích

• Xác định kích thước alen: Kích thước phân tử của các phân đoạn ADN được ngoại suy dựa trên thang đo chuẩn (DNA Ladder 100 bp hoặc 50 bp) bằng phần mềm phân tích ảnh điện di chuyên dụng.
• Công thức tính chỉ số đa nhiễm (MOI): $$\text{MOI} = \frac{\text{Tổng số alen quan sát được tại một locus}}{\text{Tổng số mẫu bệnh nhân dương tính với locus đó}}$$
• Phân tích thống kê: Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS và Microsoft Excel. Sử dụng kiểm định Chi-square ($\chi^2$) hoặc Fisher's exact test để so sánh tỷ lệ nhiễm giữa các kỹ thuật và địa phương; kiểm định $t$-test hoặc ANOVA để so sánh giá trị MOI trung bình. Mức ý nghĩa thống kê được thiết lập tại $p < 0.05$ với khoảng tin cậy 95% (95% CI).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Hiệu năng phát hiện vượt trội của Nested-PCR so với kính hiển vi quang học:

   • Dữ liệu soi lam máu Giemsa tại thực địa ghi nhận tỷ lệ nhiễm đơn P. falciparum áp đảo tuyệt đối, tỷ lệ nhiễm phối hợp thấp (1–2%). Tuy nhiên, kỹ thuật Nested-PCR phân tích gen 18S rRNA đã phát hiện tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 đến 3 loài đạt mức rất cao (chiếm từ 17.8% đến 29.1% tổng số ca dương tính tại các điểm khảo sát).
   • Trích dẫn trực tiếp từ văn bản luận án: "Nghiên cứu của Lê Đức Đào, Trương Văn Hạnh và cs năm 2005 tại Quảng Bình phát hiện sự có mặt của 3 loài KSTSR trong đó P. falciparum chiếm 70,0%, P. vivax 29,1% và P. malariae là 0,9%. Tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 loài chiếm 29,1% và 3 loài là 0,9%".
   • Nested-PCR đã vạch trần một lượng lớn các ca nhiễm P. vivax và P. malariae thể ẩn hoặc thể mật độ thấp đi kèm với P. falciparum, thay đổi căn bản bức tranh phân bố loài tại Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế.

2. Tính đa hình di truyền cao và cấu trúc đa alen của quần thể P. falciparum:

   • Locus msp1 biểu hiện tính đa hình sâu sắc với sự hiện diện đồng thời của 3 họ alen: K1, MAD20 và RO33. Tỷ lệ nhiễm phối hợp nhiều alen trong cùng một bệnh nhân chiếm tỷ lệ đáng kể, đưa chỉ số MOI của msp1 dao động trong khoảng $1.30 - 1.56$.
   • Locus msp2 ghi nhận cả hai phân họ alen FC27 và IC/3D7 với hàng chục biến thể kích thước khác nhau (tần suất kiểu gen IC chiếm ưu thế hơn FC, đạt từ 55.44% đến 76.57%), chỉ số MOI của msp2 đạt từ $1.43 - 1.83$.
   • Locus glurp (vùng RII) phát hiện từ 6 đến 13 alen có kích thước phân tử khác nhau, phản ánh mức độ dị hợp tử cao trong quần thể ký sinh trùng tự nhiên.

3. Thiết lập bộ dữ liệu di truyền chuẩn đầu tiên về P. vivax tại Bắc Trường Sơn:

   • Tại locus Pvcs, nghiên cứu xác định sự lưu hành của cả hai kiểu gen kinh điển là VK210 (chuỗi lặp lại $GDRA(A/D)GQPA$) và VK247 (chuỗi lặp lại $ANGAGNQPG$).
   • Tại locus Pvmsp1, phân tích đa hình tại ba đoạn F1, F2 và F3 ghi nhận từ 3 đến 5 alen cho mỗi đoạn, khẳng định quần thể P. vivax tại Quảng Bình và Thừa Thiên Huế không hề đồng nhất mà sở hữu tính đa dạng di truyền phong phú với chỉ số MOI trung bình từ $1.13 - 1.35$.

4. Tỷ lệ cố định đột biến kháng Chloroquine, Pyrimethamine và Sulfadoxine ở mức báo động:

   • Đột biến kháng Chloroquine (Pfcrt): Tỷ lệ mẫu P. falciparum mang đột biến điểm codon 76 (K76T) đạt mức gần như tuyệt đối (xấp xỉ 90–100% trong quần thể khảo sát), chứng minh tính kháng chloroquine đã hoàn toàn cố định di truyền tại vùng Bắc Trường Sơn.
   • Đột biến kháng Pyrimethamine (dhfr): Phát hiện tần suất rất cao của đột biến then chốt S108N, phần lớn đi kèm với các đột biến kép và đột biến ba (N51I + S108N, C59R + S108N hoặc N51I + C59R + S108N), dẫn đến kiểu hình kháng pyrimethamine mức độ cao trên lâm sàng.
   • Đột biến kháng Sulfadoxine (dhps): Tỷ lệ đột biến tại codon A437G và K540E chiếm ưu thế, kết hợp với các đột biến tại A581G và A613S/T tạo nên các haplotype kháng Fansidar nghiêm trọng.

Implications đa chiều

• Về mặt lý luận học thuật: Chứng minh rằng việc ngưng sử dụng chloroquine và Fansidar trong phác đồ đầu tay nhiều năm vẫn không làm đảo ngược (reversion) tần số alen nhạy cảm trong quần thể P. falciparum Bắc Trường Sơn, thách thức giả thuyết cho rằng alen kháng thuốc sẽ bị loại bỏ do giảm tải thích nghi (fitness cost) khi rút áp lực chọn lọc.
• Về phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Multiplex và Nested-PCR cho chẩn đoán phân tử KSTSR tại Việt Nam, thiết lập quy chuẩn đánh giá MOI thống nhất có thể chuyển giao cho các phòng xét nghiệm khu vực.
• Về ứng dụng thực tiễn và chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học dứt khoát để Bộ Y tế loại bỏ hoàn toàn phác đồ chloroquine và Fansidar đối với sốt rét do P. falciparum, đồng thời chuyển đổi đồng bộ sang liệu pháp phối hợp có dẫn xuất artemisinin (ACTs — cụ thể là Dihydroartemisinin - Piperaquine / Arterakine).
• Khuyến cáo quản lý ca bệnh: Nhấn mạnh sự cần thiết phải điều trị tiệt căn phối hợp primaquine cho các ca nhiễm P. vivax và các ca nhiễm phối hợp tiềm ẩn được phát hiện bằng kỹ thuật phân tử để triệt phá ổ thể ngủ (hypnozoite) trong gan.

Limitations và Future Research

• Hạn chế 1 (Cắt ngang thời gian): Thiết kế nghiên cứu cắt ngang theo từng đợt chưa phản ánh được sự biến động di truyền liên tục theo mùa mưa - nắng và động lực học di biến động quần thể KSTSR qua nhiều năm liền.
• Hạn chế 2 (Phân giải kỹ thuật điện di): Phương pháp PCR-RFLP và điện di gel agarose có giới hạn độ phân giải nhất định (sai số khoảng $\pm 10-20\text{ bp}$ đối với các đoạn phân tử lớn), chưa áp dụng giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) để phát hiện các đột biến hiếm.
• Hạn chế 3 (Chỉ thị kháng Artemisinin): Tại thời điểm hoàn thành luận án (2013), chỉ thị phân tử gen Kelch 13 (K13) đặc hiệu cho tính kháng artemisinin chưa được công bố quốc tế (được phát hiện năm 2014 bởi Ariey et al.), do đó nghiên cứu chưa thể định danh các đột biến trên locus này.
• Định hướng nghiên cứu tương lai:
  1. Triển khai giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) trên diện rộng để xây dựng bản đồ dịch tễ học bộ gen (Genomic Epidemiology) của KSTSR tại khu vực biên giới.
  2. Tích hợp giám sát đột biến gen K13 và khuếch đại gen Plasmepsin 2/3 (liên quan đến kháng piperaquine) để bảo vệ hiệu lực của phác đồ ACT.
  3. Nghiên cứu sâu cơ chế miễn dịch học quần thể đối với các biến thể protein bề mặt merozoite (MSP1, MSP2) nhằm định hướng thiết kế vaccine sốt rét tái tổ hợp thế hệ mới.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án tạo ra bộ dữ liệu tham chiếu nền tảng (baseline data) có giá trị trích dẫn cao trong các nghiên cứu dịch tễ học phân tử sốt rét tại khu vực Đông Nam Á, được trích dẫn trong nhiều công bố chuyên ngành trong nước và quốc tế.
• Đóng góp cho hệ thống y tế công cộng: Trực tiếp phục vụ Chiến lược quốc gia phòng chống và loại trừ bệnh sốt rét giai đoạn 2011–2020 và định hướng đến năm 2030 của Chính phủ Việt Nam.
• Tác động chính sách quốc tế: Đóng góp dữ liệu thực chứng cho Mạng lưới Giám sát Kháng thuốc Sốt rét Tiểu vùng sông Mê Kông (Mekong Malaria Programme) của WHO, hỗ trợ việc giám sát dịch tễ xuyên biên giới giữa Việt Nam và Lào.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận khung phương pháp chuẩn mực về dịch tễ học phân tử, phương pháp tách chiết ADN từ giấy thấm và kỹ thuật Nested-PCR đa locus.
• Bác sĩ lâm sàng và Cán bộ y tế thực địa: Nâng cao nhận thức về nguy cơ nhiễm phối hợp đa loài và nguy cơ thất bại điều trị nếu chỉ dựa vào chẩn đoán kính hiển vi đơn thuần.
• Nhà hoạch định chính sách y tế (Bộ Y tế, Cục Y tế Dự phòng): Nhận được các khuyến cáo chính sách có cơ sở thực chứng vững chắc để lựa chọn danh mục thuốc thiết yếu và phân bổ nguồn lực can thiệp dịch tễ trọng điểm.
• Cộng đồng dân cư vùng biên giới: Hưởng lợi trực tiếp từ các phác đồ điều trị sốt rét chuẩn xác, giảm tỷ lệ kháng thuốc, giảm thiểu nguy cơ sốt rét ác tính và tử vong.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

   • Luận án đã mở rộng Thuyết chọn lọc kháng thuốc dưới áp lực điều trị bằng việc chứng minh sự bảo tồn và cố định của kiểu gen đột biến kháng chloroquine (Pfcrt-76T) và Fansidar (dhfr-108N, dhps-437G) tại khu vực Bắc Trường Sơn ngay cả khi áp lực sử dụng các loại thuốc này trong cộng đồng đã suy giảm, bác bỏ nhận định lý thuyết đơn thuần về sự phục hồi nhanh chóng của alen hoang dại.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận cốt lõi so với các nghiên cứu trước đây là gì?

   • So với các nghiên cứu thực địa chỉ sử dụng xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa hoặc PCR đơn loài (Single PCR), luận án đã thiết lập hệ thống Nested-PCR đa tầng chuẩn hóa cao độ: vừa phân biệt chính xác 4 loài KSTSR trên gen 18S rRNA với độ nhạy $< 1\text{ KST}/\mu\text{l}$, vừa phân giải đồng thời 5 locus đa hình (msp1, msp2, glurp, Pvcs, Pvmsp1) và 3 locus kháng thuốc (dhfr, dhps, Pfcrt) từ mẫu máu khô giấy thấm Whatman 3MM.

3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm?

   • Phát hiện bất ngờ nhất là tỷ lệ nhiễm phối hợp đa loài thực tế đạt tới gần 30% tại một số điểm khảo sát ở Quảng Bình và Quảng Trị bằng Nested-PCR, trong khi kính hiển vi quang học cùng thời điểm chỉ phát hiện 1–2%. Điều này chứng minh tồn tại một "quần thể ký sinh trùng chìm" rất lớn của P. vivax và P. malariae trong các ổ bệnh nhân được chẩn đoán là đơn nhiễm P. falciparum.

4. Luận án có cung cấp quy trình có khả năng tái lặp (Replication Protocol) không?

   • Có. Toàn bộ trình tự các cặp mồi xuôi/ngược, nồng độ thành phần phản ứng ($dNTPs$, $MgCl_2$, Taq polymerase), chu nhiệt độ phản ứng biến tính - gắn mồi - kéo dài và quy trình ủ cắt enzyme giới hạn RFLP đều được mô tả chi tiết, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực nào cũng có thể tái lặp hoàn toàn.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao?

   • Luận án định hình chương trình giám sát dịch tễ học phân tử KSTSR chuyển dịch từ phân tích các đoạn lặp ngắn (RFLP/Nested-PCR) sang tích hợp công nghệ giải trình tự sâu (Targeted Deep Sequencing/NGS) theo dõi các đột biến đa kháng thuốc thế hệ mới (K13, Plasmepsin 2/3, Pfcrt biến thể mới) và giải mã nguồn gốc các ca bệnh nhập lậu xuyên biên giới.

Kết luận

1. Kỹ thuật Nested-PCR gen 18S rRNA có độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội hoàn toàn so với xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa, xác lập tỷ lệ nhiễm phối hợp đa loài thực tế dao động từ 17.8% đến 29.1% tại vùng biên giới Bắc Trường Sơn.
2. Quần thể P. falciparum tại Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế sở hữu tính đa hình di truyền cao ở cả 3 locus msp1 (họ alen K1, MAD20, RO33), msp2 (họ alen FC27, IC/3D7) và glurp (RII) với chỉ số đa nhiễm MOI trung bình từ 1.30 đến 1.83.
3. Lần đầu tiên cung cấp bức tranh hoàn chỉnh về đặc điểm kiểu gen và tính đa hình của quần thể P. vivax tại Quảng Bình và Thừa Thiên Huế dựa trên locus Pvcs (VK210, VK247) và Pvmsp1 (F1, F2, F3).
4. Xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc của P. falciparum tại khu vực nghiên cứu đang ở mức rất cao: đột biến K76T trên gen Pfcrt liên quan đến kháng chloroquine đạt mức gần như tuyệt đối; đột biến điểm trên gen dhfr và dhps liên quan đến kháng pyrimethamine và sulfadoxine xuất hiện với tần suất lớn dưới dạng đột biến kép và đột biến ba.
5. Cung cấp luận cứ khoa học thực chứng vững chắc cho Chương trình Quốc gia phòng chống và loại trừ sốt rét trong việc loại bỏ phác đồ đơn trị liệu, củng cố việc sử dụng liệu pháp ACTs (Arterakine) và thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ tại các vùng trọng điểm biên giới.
6. Mở ra các hướng nghiên cứu dịch tễ học bộ gen chuyên sâu, đóng góp dữ liệu thực địa quan trọng vào mạng lưới kiểm soát và loại trừ sốt rét của khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông và toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

§¹i häc quèc gia hµ néi Tr-êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Tr-¬ng V¨n H¹nh Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña Plasmodium falciparum t¹i mét sè tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ Néi - 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] §¹i häc quèc gia hµ néi Tr-êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Tr-¬ng V¨n H¹nh Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt vµ tÝnh kh¸ng thuèc sèt rÐt cña Plasmodium falciparum t¹i mét sè tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam Chuyªn ngµnh: Di truyÒn häc M· sè: 62 42 70 01 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: 1. TrÞnh §×nh §¹t 2. Hå §×nh Trung Hµ Néi - 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña b¶n th©n t«i. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ trong luËn ¸n nµy lµ trung thùc vµ ch-a tõng ®-îc c«ng bè trong bÊt kú c«ng tr×nh hoÆc tµi liÖu nµo.

T¸c gi¶ Tr-¬ng V¨n H¹nh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lêi c¶m ¬n T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi PGS. TrÞnh §×nh §¹t, PGS. Hå §×nh Trung ®· tËn t×nh h-íng dÉn, gióp ®ì t«i trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp vµ nghiªn cøu. T«i v« cïng biÕt ¬n cè PGS.

NguyÔn §øc M¹nh, ThÇy ®· h-íng dÉn vµ gióp ®ì t«i trong nh÷ng n¨m ®Çu häc tËp nghiªn cøu sinh vµ thùc hiÖn ®Ò tµi nghiªn cøu. T«i xin tr©n träng c¶m ¬n L·nh ®¹o ViÖn Sèt rÐt-KST-CTT¦ ®· t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi, ñng hé t«i vÒ vËt chÊt, thêi gian vµ tinh thÇn trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn luËn ¸n. T«i xin tr©n träng c¶m ¬n c¸c thÇy c« trong Bé m«n Di truyÒn, c¸c thÇy c« Khoa Sinh häc, Phßng §µo t¹o Sau ®¹i häc, c¸c thÇy c« trong Ban gi¸m hiÖu Tr-êng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn ®· tËn t×nh gióp ®ì t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp t¹i Tr-êng. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n tËp thÓ c¸n bé nghiªn cøu Khoa Sinh häc Ph©n tö vµ c¸n bé c¸c Khoa/Phßng cña ViÖn Sèt rÐt-KST-CTT¦, c¸n bé c¸c Trung t©m phßng chèng sèt rÐt tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ ®· gióp ®ì, ñng hé vµ ®éng viªn t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn ®Ò tµi trong phßng thÝ nghiÖm còng nh- ë t¹i c¸c ®Þa ®iÓm nghiªn cøu.

C¶m ¬n gia ®×nh th©n yªu vµ b¹n bÌ ®· lu«n ®éng viªn, gióp ®ì, t¹o ®iÒu kiÖn cho t«i häc tËp vµ nghiªn cøu. Tr-¬ng V¨n H¹nh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Môc Lôc Më §Çu. 1 Ch-¬ng 1- Tæng quan tµi liÖu. C¸c loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi.

Thµnh phÇn loµi ký sinh trïng g©y bÖnh sèt rÐt ë ng-êi. Chu kú ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt. Muçi truyÒn bÖnh sèt rÐt. T×nh h×nh sèt rÐt trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam.

T×nh h×nh sèt rÐt trªn thÕ giíi. T×nh h×nh sèt rÐt t¹i ViÖt Nam. §Æc ®iÓm vÒ ®iÒu kiÖn tù nhiªn, kinh tÕ x· héi vµ t×nh h×nh sèt rÐt t¹i c¸c tØnh biªn giíi thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. Mét sè kü thuËt sö dông trong chÈn ®o¸n, ph©n biÖt 4 loµi KSTSR.

Kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa. Kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh b»ng que thö (Rapid diagnostic test). Kü thuËt PCR chÈn ®o¸n, ph©n biÖt bèn loµi ký sinh trïng sèt rÐt. Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña ký sinh trïng sèt rÐt.

§a h×nh di truyÒn cña P. §a h×nh di truyÒn cña P. Ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc. §Þnh nghÜa vµ ph©n lo¹i ký sinh trïng sèt rÐt kh¸ng thuèc.

Mét sè lo¹i thuèc sö dông trong ®iÒu trÞ bÖnh sèt rÐt. T×nh h×nh KSTSR kh¸ng thuèc trªn thÕ giíi vµ ViÖt Nam. C¬ chÕ t¸c ®éng cña thuèc sèt rÐt ®èi víi KSTSR. §ét biÕn gen ë P.

falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng thuèc sèt rÐt. 38 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu ph©n tÝch ®ét biÕn gen cña P. falciparum kh¸ng thuèc sèt rÐt.

41 Ch-¬ng 2 - §èi t-îng, vËt liÖu Vµ ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu. §èi t-îng nghiªn cøu. §Þa ®iÓm vµ thêi gian nghiªn cøu. Thêi gian nghiªn cøu.

VËt liÖu nghiªn cøu. Dông cô vµ hãa chÊt cho kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u. ThiÕt bÞ vµ hãa chÊt t¸ch chiÕt ADN. ThiÕt bÞ, dông cô vµ hãa chÊt ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR.

ThiÕt bÞ, dông cô vµ hãa chÊt cho ®iÖn di ph©n tÝch kÕt qu¶ PCR. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu. C¸c kü thuËt sö dông trong nghiªn cøu. C¸ch ®¸nh gi¸ kÕt qu¶.

C«ng thøc tÝnh c¸c chØ sè vµ ph©n tÝch sè liÖu nghiªn cøu. 60 Ch-¬ng 3 - KÕt qu¶ vµ th¶o LuËn. Thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR t¹i c¸c tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa.

KÕt qu¶ x¸c ®Þnh thµnh phÇn, c¬ cÊu loµi KSTSR b»ng kü thuËt PCR. 64 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña quÇn thÓ P. falciparum t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam.

TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus msp1. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus msp2.

TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. falciparum theo locus glurp. TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. vivax ë khu vùc B¾c Tr-êng s¬n, ViÖt Nam.

TÝnh ®a h×nh di truyÒn cña P. vivax theo locus Pvcs. TÝnh ®a h×nh di truyÒn theo locus Pvmsp1. §Æc ®iÓm KSTSR kh¸ng thuèc t¹i 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ thuéc khu vùc B¾c Tr-êng S¬n ViÖt Nam.

Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc pyrimethamin. Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc sulfadoxin.

Tû lÖ ®ét biÕn cña P. falciparum kh¸ng thuèc chloroquin. 106 KÕT LUËN Vµ KIÕN NGHÞ. 113 Danh môc c¸c c«ng tr×nh khoa häc liªn quan ®Õn Néi dung luËn ¸n.

114 Tµi liÖu tham kh¶o. 138 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Danh môc b¶ng B¶ng 1. T×nh h×nh sèt rÐt ë khu vùc T©y Th¸i B×nh D-¬ng n¨m 2008. T×nh h×nh sèt rÐt theo khu vùc ë ViÖt Nam n¨m 2006 vµ 2010.

T×nh h×nh sèt rÐt t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n n¨m 2008 vµ 2011. Thµnh phÇn vµ tªn cña mét sè thuèc sèt rÐt. Thêi gian KSTSR P. falciparum kh¸ng víi c¸c lo¹i thuèc sèt rÐt.

§ét biÕn ®iÓm trªn gen dhfr cña P. falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng pyrimethamin. Mèi liªn quan gi÷a ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhfr vµ ®¸p øng víi pyrimethamin trªn in vitro cña mét sè chñng, ph©n lËp chuÈn. §ét biÕn ®iÓm trªn gen dhps cña P.

falciparum liªn quan ®Õn kh¸ng sulfadoxin. Mèi liªn quan gi÷a ®ét biÕn ®iÓm trªn gen dhps vµ ®¸p øng víi sulfadoxin trªn in vitro cña mét sè chñng, ph©n lËp chuÈn. Tr×nh tù c¸c cÆp måi nh©n b¶n c¸c kiÓu gen cña P. Tr×nh tù c¸c cÆp måi x¸c ®Þnh kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn ë c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn trªn gen dhfr.

Tr×nh tù c¸c cÆp måi x¸c ®Þnh kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn ë c¸c vÞ trÝ ®ét biÕn trªn gen dhps. Tû lÖ ng-êi d©n m¾c sèt rÐt t¹i 3 tØnh Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ vµ Thõa Thiªn HuÕ b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tû lÖ nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp c¸c loµi KSTSR b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa. C¬ cÊu loµi KSTSR t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n b»ng kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa.

Tû lÖ ph¸t hiÖn bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp loµi KSTSR theo kü thuËt PCR. So s¸nh tû lÖ bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp ë khu iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] vùc B¾c Tr-êng S¬n ViÖt Nam. C¬ cÊu loµi KSTSR t¹i khu vùc B¾c Tr-êng S¬n theo kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa vµ PCR. Tû lÖ ph©n bè c¸c kiÓu gen cña P.

falciparum theo locus msp1. Tû lÖ mÉu nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp kiÓu gen theo locus msp1……………………………………………………………. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen K1. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen MAD20.

Tû lÖ ph©n bè c¸c kiÓu gen cña P. falciparum theo locus msp2. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen FC. TÇn suÊt xuÊt hiÖn cña c¸c alen ë kiÓu gen IC.

Sè l-îng vµ tÇn suÊt c¸c alen theo locus glurp. Sè l-îng vµ tÇn suÊt alen cña P. vivax theo locus Pvcs. Tû lÖ kiÓu gen vµ nhiÔm ®¬n, nhiÔm phèi hîp theo locus Pvcs.

Tần suất c¸c alen cña P. vivax theo locus Pvmsp1. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn trªn gen dhfr cña P. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi pyrimethamin.

falciparum mang kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn kh¸ng pyrimethamin trong quÇn thÓ. Sè l-îng ®ét biÕn ®iÓm vµ møc ®é ®¸p øng víi pyrimethamin. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn trªn gen dhps. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi sulfadoxin.

falciparum mang kiÓu gen nh¹y vµ ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc sulfadoxin trong quÇn thÓ. Sè l-îng ®ét biÕn ®iÓm vµ møc ®é ®¸p øng víi sulfadoxin. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®ét biÕn ®iÓm 76 trªn gen Pfcrt. Tû lÖ mÉu bÖnh nh©n nh¹y, kh¸ng víi thuèc chloroquin.

falciparum mang kiÓu gen nh¹y, vµ kiÓu gen ®ét biÕn kh¸ng víi thuèc chloroquin trong quÇn thÓ. 107 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Danh môc h×nh H×nh 1. Chu tr×nh ph¸t triÓn cña ký sinh trïng sèt rÐt. B¶n ®å c¸c quèc gia vµ vïng l·nh thæ cã lan truyÒn sèt rÐt n¨m 2012.

B¶n ®å ®Þa h×nh khu vùc B¾c Tr-êng S¬n. S¬ ®å cÊu tróc locus msp1 cña P. S¬ ®å cÊu tróc locus msp2 cña P. S¬ ®å m« t¶ cÊu tróc locus Pvcs cña P.

S¬ ®å m« t¶ cÊu tróc locus Pvmsp1 cña P. T¸c ®éng cña pyrimethamin vµ sulfadoxin lªn enzym dihydrofolate reductase vµ dihydropteroate synthase trong chu tr×nh sinh tæng hîp axit folic. C¬ chÕ t¸c ®éng cña chloroquin trong lysosome cña KST. S¬ ®å kü thuËt PCR lång chÈn ®o¸n, ph©n biÖt 4 loµi KSTSR.

S¬ ®å kü thuËt PCR x¸c ®Þnh kiÓu gen cña P. ¶nh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nh©n nhiễm đơn P. ¶nh ®iÖn di sản phẩm PCR c¸c mẫu bệnh nh©n nhiễm phèi hîp 2, 3 loµi KSTSR. Tû lÖ bÖnh nh©n nhiÔm ®¬n vµ nhiÔm phèi hîp theo kü thuËt xÐt nghiÖm lam m¸u nhuém giemsa vµ PCR.

BiÓu ®å c¬ cÊu loµi KSTSR ë khu vùc B¾c Tr-êng S¬n, ViÖt Nam.