Nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase và sóng siêu âm

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ thực phẩm nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase có sự hỗ trợ, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Thị Diễm Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS.TS Phan Đình Tuấn
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống
• Đề tài: Nghiên Cứu Thủy Phân Collagen Từ Da Cá Tra Bằng Enzyme Neutrase Và Sóng Siêu Âm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
• MỤC LỤC
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Các phương pháp thuỷ phân protein
• 1.2. Sóng siêu âm (SSA)
• 1.3. Một số các nghiên cứu thuỷ phân collagen đã công bố
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tính chất hoá lý của collagen nguyên liệu và hoạt tính enzym
• 3.2. Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến DH của quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase
• 3.3. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase sau khi xử lý mẫu bằng sóng siêu âm
• 3.4. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase trước khi xử lý mẫu bằng sóng siêu âm
• 3.5. Thuỷ phân collagen bằng enzym theo hai hướng khác nhau
• 3.6. Nghiên cứu tính chất của sản phẩm collagen hydrolysate
• 3.7. Tính năng công nghệ của collagen hydrolysate
• 3.8. Xây dựng quy trình công nghệ tạo sản phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase với sự hỗ trợ của sóng siêu âm. Collagen là một protein quan trọng trong cơ thể động vật, chiếm tỷ lệ lớn trong các mô liên kết. Da cá tra là nguồn nguyên liệu phong phú, có hàm lượng protein cao, trong đó collagen chiếm khoảng 53%. Việc thu nhận collagen từ da cá tra không chỉ tận dụng phế phẩm mà còn gia tăng giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp chế biến thủy sản. Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân collagen nhằm thu nhận collagen hydrolysate (CH) có ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng enzyme neutrase để thủy phân collagen từ da cá tra. Các thông số như tỷ lệ cơ chất/nước, tỷ lệ enzyme/protein, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân được khảo sát để tìm ra điều kiện tối ưu. Kết quả cho thấy tỷ lệ cơ chất/nước 1:4, tỷ lệ enzyme/protein 39,45 U/g, nhiệt độ 50°C, pH 7,0 và thời gian thủy phân 3 giờ cho mức độ thủy phân tối ưu đạt 11,02%. Khi kết hợp với sóng siêu âm, hiệu quả thủy phân tăng lên 35,39% với trọng lượng phân tử peptide nhỏ nhất đạt 10 kDa. Điều này cho thấy công nghệ enzyme kết hợp với sóng siêu âm có thể cải thiện đáng kể hiệu suất thủy phân protein.

III. Tính chất và ứng dụng của collagen hydrolysate

Sản phẩm collagen hydrolysate thu được từ da cá tra có nhiều tính chất ưu việt như khả năng tạo bọt, tạo nhũ và độ hòa tan cao hơn so với collagen nguyên liệu. Những tính chất này làm cho collagen hydrolysate trở thành nguyên liệu tiềm năng cho các sản phẩm thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Việc nghiên cứu ứng dụng collagen trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc tận dụng các phế phẩm từ ngành chế biến thủy sản.

IV. Kết luận

Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase kết hợp với sóng siêu âm là một phương pháp hiệu quả để tạo ra collagen hydrolysate có giá trị cao. Các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân đã được xác định, mở ra hướng đi mới cho việc khai thác collagen từ nguồn nguyên liệu phong phú này. Collagen hydrolysate không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm, góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho sản phẩm từ da cá tra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Da cá Tra là một phụ phẩm phong phú của ngành công nghiệp cá da trơn, đặc biệt tại các tỉnh Tây Nam Bộ, với hàm lượng protein chiếm khoảng 67% chất khô, trong đó collagen chiếm tới 53%. Việc tận dụng nguồn nguyên liệu này để thu nhận collagen hydrolysate (CH) không chỉ góp phần nâng cao giá trị kinh tế mà còn bảo vệ môi trường vùng đồng bằng sông Cửu Long. Collagen hydrolysate là sản phẩm thuỷ phân collagen có trọng lượng phân tử thấp, được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm nhờ khả năng chống lão hóa, cải thiện sức khỏe xương khớp và làn da.

Mục tiêu nghiên cứu là tìm ra phương pháp và điều kiện tối ưu để thu nhận CH từ da cá Tra bằng enzym Neutrase kết hợp với sóng siêu âm nhằm nâng cao hiệu quả thuỷ phân, tạo ra các peptide có trọng lượng phân tử khoảng 10 kDa phù hợp cho ứng dụng thực phẩm và mỹ phẩm. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh trong năm 2012, tập trung khảo sát các thông số ảnh hưởng đến mức độ thuỷ phân (Degree of Hydrolysis - DH) và tính năng công nghệ của sản phẩm.

Việc ứng dụng sóng siêu âm hỗ trợ enzym trong thuỷ phân collagen là hướng đi mới, giúp tăng DH lên 14,92%, cao hơn 35,39% so với chỉ enzym đơn thuần, đồng thời giảm trọng lượng phân tử peptide thu được từ 19 kDa xuống còn 10 kDa. Kết quả này mở ra tiềm năng phát triển sản phẩm CH chất lượng cao, an toàn và có tính ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và tính chất collagen: Collagen là protein cấu trúc dạng sợi, gồm ba chuỗi polypeptide xoắn lại thành triple helix, có trọng lượng phân tử khoảng 300 kDa. Collagen cá Tra chứa nhiều glycine, proline và hydroxyproline, các acid amin đặc trưng giúp duy trì cấu trúc và tính bền nhiệt của collagen.

• Phương pháp thuỷ phân enzym: Sử dụng enzym Neutrase, một endoprotease trung tính từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, có hoạt tính xúc tác cắt đứt liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptide, tạo ra các peptide có trọng lượng phân tử thấp. Neutrase hoạt động tối ưu ở pH 5,5-7,0 và nhiệt độ 45-55°C, với mức độ thuỷ phân DH tối đa khoảng 10-15%.

• Ứng dụng sóng siêu âm (SSA): Sóng siêu âm tần số thấp (16-100 kHz) với cường độ cao tạo ra hiện tượng xâm thực khí, bong bóng khí nổ vỡ, làm tăng nhiệt độ và áp suất cục bộ, giúp phá vỡ cấu trúc collagen, tăng khả năng tiếp xúc enzym với cơ chất, từ đó nâng cao hiệu quả thuỷ phân.

• Khái niệm Degree of Hydrolysis (DH): Là tỷ lệ phần trăm liên kết peptide bị cắt trong quá trình thuỷ phân, phản ánh mức độ phân giải protein thành peptide và acid amin.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là da cá Tra thu nhận từ Công ty Cổ phần Việt An, An Giang. Enzym Neutrase thương mại của Sigma, các hóa chất phân tích chuẩn và thiết bị siêu âm VC-500 (150W/20ml mẫu).

• Phương pháp thu nhận collagen: Da cá được xử lý loại bỏ tạp chất, tẩy màu, sau đó trích ly collagen bằng acid acetic 0,75M trong 24 giờ ở 5°C, kết tủa bằng NaCl 0,9M, ly tâm và thẩm tích để thu collagen nguyên liệu.

• Khảo sát các thông số thuỷ phân: Thực hiện các thí nghiệm thay đổi tỷ lệ cơ chất/nước (1:4 tối ưu), tỷ lệ enzym/protein (39,45 U/g), nhiệt độ (50°C), pH (7,0) và thời gian thuỷ phân (3 giờ) để xác định điều kiện tối ưu cho enzym Neutrase.

• Xử lý sóng siêu âm: Áp dụng sóng siêu âm với cường độ 30% công suất máy (150W/20ml) trong 6 phút, khảo sát ảnh hưởng trước và sau khi xử lý mẫu bằng sóng siêu âm kết hợp enzym Neutrase.

• Phân tích sản phẩm: Xác định mức độ thuỷ phân DH bằng phương pháp chuẩn độ, phân tích trọng lượng phân tử peptide bằng điện di SDS-PAGE, đánh giá tính năng công nghệ như khả năng hoà tan, tạo bọt và nhũ hoá.

• Timeline nghiên cứu: Quá trình thu nhận collagen và khảo sát điều kiện thuỷ phân kéo dài khoảng 3 tháng, xử lý sóng siêu âm và phân tích sản phẩm thực hiện trong 2 tháng tiếp theo.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện thuỷ phân collagen bằng Neutrase tối ưu: Tỷ lệ cơ chất/nước 1:4, tỷ lệ enzym/protein 39,45 U/g, nhiệt độ 50°C, pH 7,0, thời gian 3 giờ cho mức độ thuỷ phân DH đạt 11,02%. Trọng lượng phân tử peptide thu được nhỏ nhất là 19 kDa.

2. Ảnh hưởng của sóng siêu âm kết hợp enzym: Khi xử lý mẫu bằng sóng siêu âm 6 phút trước khi thuỷ phân enzym, DH tăng lên 14,92%, tăng 35,39% so với chỉ enzym. Trọng lượng phân tử peptide giảm xuống còn 10 kDa, cho thấy hiệu quả phá vỡ cấu trúc collagen tăng lên.

3. Tính năng công nghệ của collagen hydrolysate (CH): CH có khả năng hoà tan trong nước lạnh cao hơn collagen nguyên liệu, đồng thời tăng khả năng tạo bọt và tạo nhũ, phù hợp cho ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm.

4. So sánh với các nghiên cứu khác: DH thu được thấp hơn so với enzym Alcalase (25,74%) nhưng sản phẩm CH có trọng lượng phân tử phù hợp hơn cho ứng dụng thực phẩm chức năng. Việc kết hợp sóng siêu âm giúp nâng cao hiệu quả thuỷ phân tương tự như các nghiên cứu sử dụng vi sóng hoặc enzym Protamex.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase bị hạn chế do cấu trúc xoắn ba bền vững của collagen. Sóng siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực khí, bong bóng khí nổ vỡ làm phá vỡ cấu trúc collagen, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc enzym, từ đó nâng cao DH và giảm trọng lượng phân tử peptide. Kết quả này được minh họa qua biểu đồ DH tăng theo thời gian xử lý sóng siêu âm và đồ thị phân bố trọng lượng phân tử peptide qua SDS-PAGE.

Tính năng công nghệ của CH được cải thiện rõ rệt so với collagen nguyên liệu, thể hiện qua các chỉ số tạo bọt và nhũ tương, phù hợp với yêu cầu ứng dụng trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. So với các enzym khác như Alcalase hay Protamex, Neutrase cho sản phẩm ít đắng hơn do mức độ thuỷ phân vừa phải, đồng thời kết hợp sóng siêu âm giúp nâng cao hiệu quả mà vẫn giữ được tính an toàn và chất lượng sản phẩm.

Những kết quả này khẳng định tính khả thi và ưu việt của phương pháp thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, mở ra hướng phát triển sản phẩm CH từ da cá Tra với giá trị kinh tế và ứng dụng cao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng công nghệ sóng siêu âm trong quy trình thuỷ phân collagen: Khuyến nghị các nhà sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm áp dụng sóng siêu âm với cường độ 30% công suất máy trong 6 phút trước khi thuỷ phân enzym để nâng cao hiệu quả thuỷ phân, tăng DH lên ít nhất 35% trong vòng 3 giờ.

2. Tối ưu hóa điều kiện thuỷ phân enzym Neutrase: Duy trì tỷ lệ cơ chất/nước 1:4, tỷ lệ enzym/protein 39,45 U/g, nhiệt độ 50°C, pH 7,0 để đạt hiệu suất thuỷ phân tối ưu, đảm bảo sản phẩm CH có trọng lượng phân tử khoảng 10 kDa phù hợp cho ứng dụng thực phẩm chức năng.

3. Phát triển sản phẩm collagen hydrolysate đa dạng: Khuyến khích nghiên cứu và phát triển các sản phẩm CH có tính năng công nghệ cao như khả năng tạo bọt, nhũ hoá và độ hoà tan tốt, phục vụ cho ngành thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và dược phẩm.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho cán bộ kỹ thuật và doanh nghiệp về quy trình thuỷ phân collagen kết hợp sóng siêu âm, đảm bảo vận hành hiệu quả và an toàn trong sản xuất quy mô công nghiệp.

5. Thời gian thực hiện: Các giải pháp trên nên được triển khai trong vòng 12-18 tháng để nhanh chóng đưa sản phẩm CH chất lượng cao ra thị trường, góp phần nâng cao giá trị phụ phẩm da cá Tra và phát triển kinh tế địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và mỹ phẩm: Nghiên cứu cung cấp quy trình công nghệ thuỷ phân collagen hiệu quả, giúp doanh nghiệp phát triển sản phẩm CH chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường về sản phẩm chống lão hóa và bổ sung dinh dưỡng.

2. Các viện nghiên cứu và trường đại học chuyên ngành công nghệ thực phẩm, sinh học: Tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu phát triển enzym thuỷ phân protein, ứng dụng sóng siêu âm trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

3. Cơ quan quản lý và phát triển ngành thủy sản: Thông tin về khai thác hiệu quả phụ phẩm da cá Tra, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và bảo vệ môi trường vùng đồng bằng sông Cửu Long.

4. Nhà sản xuất enzym và thiết bị siêu âm công nghiệp: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hiệu quả enzym Neutrase và sóng siêu âm trong thuỷ phân collagen, hỗ trợ phát triển sản phẩm enzym và thiết bị phù hợp với ngành công nghiệp thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn enzym Neutrase để thuỷ phân collagen?
   Neutrase là enzym protease trung tính có hoạt tính cao trong khoảng pH 5,5-7,0 và nhiệt độ 45-55°C, tạo ra sản phẩm peptide ít đắng hơn so với các enzym khác như Alcalase. Mức độ thuỷ phân DH tối đa khoảng 10-15% phù hợp để tạo CH có trọng lượng phân tử vừa phải, an toàn cho thực phẩm và mỹ phẩm.

2. Sóng siêu âm hỗ trợ thuỷ phân collagen như thế nào?
   Sóng siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực khí, bong bóng khí nổ vỡ làm phá vỡ cấu trúc collagen, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc enzym, từ đó nâng cao hiệu quả thuỷ phân, tăng DH và giảm trọng lượng phân tử peptide.

3. Collagen hydrolysate có ứng dụng gì trong thực phẩm và mỹ phẩm?
   CH có khả năng hoà tan cao, tạo bọt và nhũ tương tốt, được sử dụng trong thực phẩm chức năng giúp cải thiện sức khỏe xương khớp, làm đẹp da, đồng thời là thành phần trong mỹ phẩm trẻ hóa da, tăng độ ẩm và giảm nếp nhăn.

4. Mức độ thuỷ phân (DH) ảnh hưởng thế nào đến chất lượng CH?
   DH phản ánh tỷ lệ liên kết peptide bị cắt. DH quá thấp sản phẩm có trọng lượng phân tử lớn, khó hấp thu; DH quá cao có thể tạo vị đắng và mất hoạt tính sinh học. Mức DH khoảng 10-15% là tối ưu để tạo CH có trọng lượng phân tử phù hợp và vị dễ chịu.

5. Có thể áp dụng quy trình này cho các loại collagen khác không?
   Quy trình enzym Neutrase kết hợp sóng siêu âm có thể áp dụng cho các nguồn collagen khác như da cá khác, gelatin từ vảy cá, hoặc collagen từ động vật có xương sống, tuy nhiên cần điều chỉnh thông số phù hợp với đặc tính nguyên liệu.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện thuỷ phân collagen từ da cá Tra bằng enzym Neutrase tối ưu với DH đạt 11,02% và peptide trọng lượng phân tử nhỏ nhất 19 kDa.
• Kết hợp sóng siêu âm 6 phút với enzym Neutrase nâng cao DH lên 14,92%, tăng 35,39% so với enzym đơn thuần, đồng thời giảm trọng lượng phân tử peptide xuống 10 kDa.
• Collagen hydrolysate thu được có tính năng công nghệ vượt trội như khả năng hoà tan, tạo bọt và nhũ tương, phù hợp ứng dụng trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.
• Phương pháp kết hợp enzym Neutrase và sóng siêu âm là giải pháp hiệu quả, an toàn, thân thiện môi trường để sản xuất CH từ phụ phẩm da cá Tra.
• Đề xuất triển khai ứng dụng công nghệ này trong sản xuất công nghiệp trong vòng 12-18 tháng nhằm nâng cao giá trị kinh tế và phát triển bền vững ngành thủy sản vùng đồng bằng sông Cửu Long.

Hành động tiếp theo: Các doanh nghiệp và viện nghiên cứu nên phối hợp chuyển giao công nghệ, tối ưu quy trình và phát triển sản phẩm collagen hydrolysate đa dạng, đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu tạo của da cá Da cá là tổ chức khá phức tạp, mô da là một khối tổng hợp gồm 3 lớp: Biểu bì, trung bì và hạ bì kết hợp chặt chẽ với nhau thành các lớp tổ chức bao phủ mang tính chất co dãn, có tính nhớt, tính tạo hình, có các lớp biểu mô, các mô liên kết, lông và gốc lông, thớ cơ, tận cùng các dây thần kinh, lưới mạch máu và bạch mạch. Thành phần hóa học của da cá 1. Protein Collagen: là thành phần chính của protein trong da.

Cấu tạo và chức năng của collagen sẽ được trình bày cụ thể ở phần 1. Albumin: là protein tan được trong nước, dung dịch muối loãng, acid loãng và kiềm loãng. Albumin bị kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa và bị đông tụ khi bị đun nóng. Quá trình ngâm rửa nguyên liệu sẽ loại được phần lớn protein này.

Globulin: là protein không tan trong nước nhưng tan được trong dung dịch acid loãng, kiềm loãng và dung dịch muối trung tính (8 ÷ 18% NaCl), dễ đông tụ hơn albumin khi bị đun nóng. Keratin: là protein tạo chất sừng, trong mạch phân tử của keratin ngoài liên kết ion và liên kết hydro còn có liên kết disulfide. Các liên kết disulfide bị thủy phân trong kiềm nhưng không bị acid thủy phân nên keratin bị phá hủy trong môi trường kiềm và tương đối ổn định trong môi trường acid. Elastin: là protein có màu vàng, các sợi elastin có tính co giãn và có thể kéo giãn khoảng 5%, không tan trong nước, tương đối ổn định trong môi trường kiềm và acid, bị phân giải bởi enzyme elastase.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 4 Mucin và mucoid: protein trong niêm dịch, có thể hòa tan trong dung dịch kiềm loãng. Trong dung dịch acid loãng, mucin bị kết tủa còn mucoid thì không. Trong nước chúng đều nở ra, chúng có thể hòa tan trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung dịch muối bão hòa.

Các thành phần khác Lipid: là thành phần dễ bị oxi hóa, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng của collagen nên cần loại lipid trước khi trích ly. Khoáng: thành phần khoáng trong da cá chủ yếu là phosphate calci (Ca3(PO4)2) và carbonate calci (CaCO3). Thành phần này cũng có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của collagen, để loại khoáng, cần ngâm acid trước trích ly. Sắc tố: ít tan trong nước và acid loãng, có thể tan trong dung dịch kiềm loãng (như dung dịch KOH, NaOH…).

Cấu trúc Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật, là thành phần chính của các mô liên kết, có khả năng đàn hồi và chịu lực rất cao. Collagen chiếm 25% tổng lượng protein của cơ thể người và chiếm khoảng 70% - 80% protein của da. Collagen có cấu trúc rất phức tạp. Phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là những phần tử nhỏ, chúng sẽ tập hợp thành các phần tử lớn hơn là các sợi, và hình thành các bó sợi collagen.

Tropocollagen là một protein hình trụ dài khoảng 2.800 Å và đường kính 14-15 Å (Foegeding et al, 1996). Nó được tạo thành từ ba chuỗi polypeptide (chuỗi α) và do đó collagen có cấu trúc bậc 4. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix, liên kết giữa các chuỗi là liên kết hydro. Mỗi chuỗi α có chứa khoảng 1000 axit amin (Wong, 1989) và có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa.

Tổng khối lượng phân tử của tropocollagen khoảng 300 kDa (Foegeding et al, 1996). HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 5 Polypeptide của collagen có dạng xoắn ốc. Mỗi một chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự, thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X – Hyp.

Trong đó, X, Y là những đơn vị amino acid khác. Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen. Các amino acid còn lại chiếm 1/2.

Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cấp – collagen fiber. Vì thế collagen rất chắc, dai, và bền. Cấu trúc xoắn 3 của Collagen Hình 1.

Thứ tự bậc cấu tạo của Collagen HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 6 1. Sự khác nhau của collagen – collagen cá so với các loại protein khác [20] Collagen là protein đặc biệt so với các loại protein khác. Thành phần chủ yếu của collagen là các acid amin không phân cực như Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine.

và chứa hàm lượng lớn các acid amin không thiết yếu. Collagen có chứa khoảng 20 loại acid amin, trong đó Glycine, Proline và Hydroxyproline chiếm hơn 50% thành phần acid amin. Collagen chứa hàm lượng Glycine (33%) và Proline (12%) với sự xuất hiện của 4-hydroxyproline (12%) và 5- hydroxylysine (1%) (Burghagen, 1999). Tuy nhiên, collagen lại là protein không chứa Tryptophan và Cystein.

Hydroxyproline và Hydroxylysine là hai acid amin rất hiếm gặp ở các loại protein khác hoặc có mặt với hàm lượng rất thấp. Đối với collagen thì Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng trong thành phần hóa học. Hàm lượng collagen trong cơ cá phụ thuộc vào loài, quá trình phát triển và thức ăn của cá (Regenstein và Regenstein, 1991). Nói chung, hàm lượng collagen trong cơ cá dao động từ khoảng 1 - 12% protein thô.

Ở thịt cá tươi collagen chiếm 0,2 - 2,2% và 1,7 - 4,6% collagen trong da cá (Sikorski et al, 1990). Nhiệt độ biến tính của collagen cá thấp hơn so với collagen từ da lợn (Nagai và Suzuki, 2000) bởi vì collagen cá có chứa hàm lượng imino acid thấp hơn collagen động vật có vú (Foegeding etal, 1996. Mặt khác, nhiệt độ biến tính của collagen từ cá nước lạnh thấp hơn nhiều so với các loài cá ôn đới và nhiệt đới (Wang et al, 2008). Nhiệt độ biến tính (Tmax) của các collagen thu được từ các phần khác nhau của cá sẽ khác nhau như: collagen từ da (25,0 – 39,5ºC), collagen từ xương (29,5 - 30,0ºC) và collagen từ vây cá (28,0 - 29,1 º C), (Nagia và Suzuki, 2000).

Những giá trị này thấp hơn khoảng 7 - 12ºC so với collagen thu được từ da lợn. HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 7 1. Tính chất hóa lý của Collagen [5, 41, 56] Collagen là một loại protein cấu trúc dạng sợi nên nó có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein như tính kị nước, tính hydrat hóa, bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ, pH.

Ngoài ra, nó còn có các tính chất đặc trưng của Collagen như: Khả năng trương nở Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100 g collagen khô có thể hút được khoảng 200 g nước, trong đó khoảng 70 g là nước liên kết và 20 g là liên kết vững chắc. Do nước phân cực nên làm suy yếu các liên kết hydro trong phân tử collagen dẫn đến làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 ÷ 4 lần. Sự gia tăng độ trương nở dưới tác động của acid là kết quả của sự giảm nồng độ ion H+ tác động đến các anion acid, và tác động của bazơ gây ra bởi nồng độ nhóm OH- giảm ảnh hưởng đến các cation bazơ. Khả năng hòa tan: Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước lạnh.

Nhưng khi thủy phân collagen thành những peptide có trọng lượng phân tử nhỏ thì nó lại có khả năng hòa tan trong nước lạnh. Các yếu tố ảnh hưởng đến Collagen [19, 28, 40, 53]  Ảnh hưởng của không khí Ở các độ tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong ống nghiệm, không khí có một vai trò quan trọng trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel và Hansen, 1989). Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein, nguyên nhân là do sự thay đổi về mặt hóa học.  Ảnh hưởng của acid và kiềm  Ảnh hưởng của acid Acid acetic có thể làm collagen trương nở 50% và tăng khả năng peptid hóa collagen hơn HCl ở pH 2,0.

Điều đó chứng tỏ rằng acid yếu (ví dụ như acid acetic) ở pH 2,0 cho phép phóng thích các proton từ nhóm cacboxyl của collagen. HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 8 Sự ảnh hưởng của HCl tới collagen: một số cation H+ kết hợp với anion – COO-. Quá trình này tiếp tục cho đến khi tất cả nhóm –COO- đã được phóng điện và tất cả nhóm cation đều ở dạng tự do.Vì vậy, pha nước bên trong cấu trúc collagen sẽ chứa nhiều Cl- hơn H+.

Sự phân phối ion khác nhau giữa hai pha tạo ra sự khác nhau về áp suất thẩm thấu và khả năng tích điện. Để tạo trạng thái cân bằng nồng độ ion giữa hai pha, nước chảy vào các phân tử collagen và gây ra sự trương nở.  Ảnh hưởng của kiềm Trong trường hợp bazơ mạnh (như NaOH) khả năng trương nở của collagen gia tăng đặc biệt là các hydroxide của ion kim loại hóa trị hai ở pH > 10, ở pH này có sự chuyển hóa không thuận nghịch thành các ion. Sự phân hủy nhóm hydroxy của các acid amin (serin và threonine) và sự thủy phân của liên kết keto - imide giữa proline và hydroxyproline xảy ra trong suốt quá trình xử lý collagen bằng kiềm ở pH 12 ÷ 14.

Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, collagen phân giải biến thành gelatine, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau: Lúc xử lý ở nhiệt độ cao trong nước, gelatine dễ tiếp tục thủy phân thành:  Ảnh hưởng của nhiệt độ:  Nhiệt độ thấp: Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g collagen khô có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng 25%, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần. HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc GVHD: PGS.PHAN ĐÌNH TUẤN MSHV: 10110190 TS. PHAN NGỌC HOÀ 9  Nhiệt độ cao: Nhiệt độ là nguyên nhân làm cho một số protein trong collagen bị biến tính.

Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tương đối nhỏ. Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 65qC collagen hút nước bị phân giải và nếu tiếp tục đun collagen sẽ tiếp tục thủy phân thành gelatin. Sự ổn định nhiệt được xem là tỷ lệ thuận với tổng lượng proline và hydroxyproline, collagen càng bền nhiệt khi lượng proline và hydroxyproline càng nhiều.