CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Danh pháp và các tên gọi trong lịch sử Ficin (hay còn gọi là ficain) là enzyme thủy phân protein chính có trong nhựa cây sung, vả (Ficus). Việc sử dụng nhựa sung vào nhiều mục đích khác nhau được nhắc đến từ lâu trong các tác phẩm lịch sử, văn học.
Trong tác phẩm Iliad (khoảng 850 TCN), Homer nhắc đến việc sử dụng nhựa cây vả tây (F. carcia) mọc hoang để làm đông tụ sữa. Pedanius Dioscorides vào thế kỷ đầu tiên của kỷ nguyên Kitô giáo trích dẫn việc sử dụng nhựa vả tây của người Hy Lạp cổ làm thuốc nhuận tràng, chữa bệnh gout, phong cùi, động vật độc cắn, bệnh da, và làm đông tụ sữa. Trải qua nhiều thế kỷ, ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều loại bệnh tật được cho rằng đã giảm bớt hoặc chữa khỏi bởi quả vả/sung hoặc nhựa của chúng như sốt, phong, các vết thương, tiểu đường, chân bị nứt và viêm, và đau răng,.
Ở nhiều nơi trên thế giới nhựa của các loài thuộc chi Ficus còn được dùng để lấy cao su, bẫy chim, nhuộm baktik, làm nến, chất keo, sơn dầu, trị giun…[1]. Ở Colombia, Venezuela và Trung Mĩ, Paraguay và Peru, nhựa họ sung/vả được gọi theo tên địa phương là “leche de higueron”, “Leche de higueron branco” hoặc “leche de oje” và chúng thu được từ Ficus laurifolia Hort., Ficus glabrata HBK, Ficus anthelmintica Mart. - hiện nay là Ficus insipida Wild. Các nghiên cứu của Peckolt được tiếp tục bởi một số nhà nghiên cứu Brazil.
Moncorvo (1881), một bác sĩ ở Rio, đã mô tả Ficus doliara (Ficus gameleira Standley) và hoạt động tiêu hóa của nhựa cây, mà ông gọi là “leite de gamelleira”. Nó có hoạt tính giống như là một 1 loại thuốc giun với sự hiện diện của “doliarina”, tương tự như papain của Carica papaya L. Mussi (1890) đã kiểm tra các đặc tính tiêu hóa của nhựa Ficus carica L., xác định các đặc tính của enzyme mà ông gọi là “cradina” và phân biệt nó với pepsin và papain. Chadot và Rouge (1906) đã đặt tên “labferment” trong nhựa “sycochymase” và nhấn mạnh rằng nó là enzyme đông tụ lâu đời nhất được biết đến, đã được sử dụng ở Hy Lạp cổ đại để sản xuất phô mai[1].
Tên gọi “ficin” được đặt ra bởi Robbins vào năm 1930 cho một loại bột protein ông đã thu nhận từ cây vả tây (sung ngọt) thuộc chi Ficus. Robbins nhận thấy trong nhựa của cây thuộc chi Ficus có một loại enzyme có khả năng tiêu diệt được giun tròn Ascaris [3]. Năm 1961, ficin được chính thức đưa vào Hệ thống phân loại enzyme quốc tế với mã số là EC 3. Đến năm 1972 ficin được mã hóa lại, thành EC 3.
Nhiều nghiên cứu về nhóm enzyme thủy phân protein trong họ Ficus đã chứng minh rằng trong Ficus không chỉ có cysteine protease mà còn có cả aspartic protease và serine protease [4, 5]. Tính chất của enzyme ficin 1. Thành phần acid amin Những kết quả nghiên cứu về thành phần acid amin của enzyme ficin của những tác giả khác nhau là khác nhau [6].1 cho biết thành phần acid amin của ficin theo kết quả nghiên cứu của Marini- Betolo (1963), Metrione (1963), Gould (1964) trên chế phẩm enzyme ficin, được tinh sạch chỉ bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bởi muối trung tính; và của Englund (1968) đã xác định thành phần acid amin trên chế phẩm ficin, thu nhận từ quá trình kết tủa bằng muối và sắc ký trên CM-cellulose [7].1 Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin Tên tác giả nghiên cứu STT Amino acid Lynn Marini – Metrione Gould Englund (1968) Betolo (1967) (1965) (1968) [7] [5] (1965) [8] [9] [10] 1 Lysin 12 7 9 9 5 2 Histidine 7 2 2 2 1 (3) (Amonia) - - 52 25 4 Arginine 19 8 7 10 10 5 Aspartic acid 74 20 21 21 17 6 Threonine 38 10 8 10 8 7 Serine 37 13 10 16 14 8 Glutamic acid 44 22 23 25 25 9 Proline 25 11 12 13 11 10 Glycine 44 28 30 32 28 11 Alanine 32 19 21 21 20 12 Half-cystine - 7 4 9 8 13 Valine 35 15 15 19 18 14 Methionine 2 3 3 4 5 15 Isoleucine 22 7 10 10 7 16 Leucine 39 14 17 17 15 17 Tyrosine 14 11 14 15 15 18 Phenylalanine 23 6 5 6 5 19 Tryptophan - 3 - 9 6 Tổng số gốc amino acid* 206 211 300 243 *số lượng các gốc amino acid/ 1 mol protein 3 Cấu trúc bậc I của ficin có chứa nhóm sulfhydryl (-SH). Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng khá giống với trình tự đã được tìm thấy của những thiol- protease thực vật khác như papain và bromelain (Hình 1.
Tuỳ theo nguồn thu nhận enzyme ficin từ các loài khác nhau mà thành phần hóa học sẽ khác nhau [11].1 Trình tự các acid amin nằm ở vùng lân cận nhóm –SH hoạt động ở enzyme ficin so sánh với papain và bromelain Nguồn: Whitaker và cộng sự [12] a: Theo R. Liener (1967), Husain và G. Tính tương đồng về trình tự của các acid amin nằm quanh vùng hoạt động của các protease thực vật trên phản ánh một cơ chế xúc tác chung. Từ các dữ liệu nghiên cứu được trình bày ở Bảng 1.2 cho thấy các loại ficin tuy khác nhau nhưng có trình tự acid amin gần giống nhau.2 Trình tự acid amin của phân tử Ficin S T Tên enzyme Nguồn thu nhận Trình tự Acid amin Tham khảo T 1 Microcarpain Ficus microcarpa VPETVDWRSKGAV [16] 2 Ficin A Ficus carica LPETVDWRSKGAV [17] 3 Ficin 3 Ficus carica LPETVDWRSKGAV [18] 4 Ficin D Ficus carica LPETVDWRSKGAV [19] 5 Ficin 4 Ficus carica LPESVDWRSKGAV [20] 1.
Tính chất vật lý Tương tự như thành phần hóa học, tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin mà tính chất vật lý của chúng cũng không giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn. Tóm tắt về những tính chất vật lý nghiên cứu được được trình bày ở Bảng 1. Một số tính chất vật lý chung của enzyme ficin như sau: Một số tính chất vật lý [11, 21]: - Trọng lượng phân tử: Trọng lượng phân tử: 20000 Da [16], 23800-26000 (Ficus spp., Phân tích axit amin, siêu ly tâm, lọc gel, chuẩn độ với 5,5'-dithiobis (2- nitrobenzoic acid), điện di SDS); 50000 (Ficus elastica, HPLC)[21].
- Đơn vị con: Monomer, Dimer (2 x 29000, Ficus elastica, SDS-electrophoresis) - Nhiệt độ có hoạt tính: 30-800C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác: 50-70oC - Hệ số lắng: 2,5 - 2,7 S - Điểm đẳng điện: 9-10 - Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hoặc glycerine 5 Bảng 1.3 Tính chất của các dạng Ficin từ Ficus carcia var Horaishi Ficin Ficin Ficin Ficin Ficin Tính chất S A B C D Hoạt tính riêng (U/mg) Casein 1,8 2,0 2,8 3,7 5,7 Tos-Arg-Ome (x10-2) 2,4 2,4 12,3 2,5 2,6 pHotp 8,0 7,5 7,0 7,0 7,5 Totp 60 65 60 78 55 Đồ bền với pH 2 8 Độ bền nhiệt 67 67 63 80 56 Tỉ lệ thủy phân casein (%) 13 13 18 17 16 Chất hoạt hóa [10-2 M] (%) Cysteine (0,0025M) 100 100 100 100 100 Cysteine 99 103 96 98 98 Mercaptoethanol 80 74 75 90 82 Chất ức chế [10-6M] (hoạt tính còn lại %) HgCl2 3,5 2,0 3,7 3,5 3,0 p-chloromercurybenzoate 76 74 30 9,6 8,4 pI 9,1 8,3 10,2 >10,2 >10,2 MW (x10000) 2,6 2,4 2,4 2,6 2,6 Hàm lượng đường (%) 4,8 0 0 0 0 Nguồn: Sugiura và cộng sự [22] 6 Bảng 1.4 Những tính chất vật lý của ficin Hệ số Trọng Bước Nguồn thu Phương pháp tinh Hệ số Tham lắng lượng pI sóng nhận sạch tắt khảo (S0) phân tử (nm) F. glabrata Tủa muối → sắc ký 25.500 21,0 267 [7] trên CMcellulose, 750 pH7 F. glabrata Chỉ tủa muối 2,56 S 26.
carica var Mỗi hợp chất có > 9,6 20,2 [24] Kadota hoạt tính được tách trực tiếp từ nhựa bằng sắc ký trên CMcellulose, pH7 F. Chỉ tủa muối 26. Tính chất xúc tác của ficin Ficin là một thiol protease, với cơ chế xúc tác như trên Hình 1. Trung tâm hoạt động gồm 2 acid amin là cystein và histidine.
Cơ chế thủy phân gồm 2 giai đoạn: acyl hóa và deacyl hóa 7 Hình 1.2 Cơ chế xúc xác của thiol protease Bảng 1.5 Các tính chất hóa học và hóa sinh của Ficin Tính chất Nội dung Tham khảo Phản ứng xúc tác Protein+ H2O sản phẩm thủy phân protein [11, 21] Loại phản ứng - Thủy phân liên kết Carboxylic acid amide (peptide, endopeptidase) [11, 21] - Các cơ chất tự nhiên: Protein (như gelatin, collagen, Cơ chất protein sữa, hemoglobin, elastin, protein đậu nành, [11, 21] fibrin, fibrinogen) - Proteins + H2O (thủy phân các liên kết peptide-, ester-, và amide ưu tiên ở Gly, Ser, Thr, Met, Lys, Arg, citrulline, Leu, isoAsp, Tyr) 8 - N-Benzyloxycarbonyi-Phe-citrulline-p- nitroanilide + H2O (Phe được thay thế bằng Gly-Phe, Gly-Gly-Phe) - Hippuric acid ester (thành phần rượu như p- nitrophenol) + H2O - Alpha-N-benzyloxycarbonyi-L-amino acid-p- nitrophenyl ester + H2O (amino acid: Gly, Ala, Lys, Val, Leu, Phe) - Các protein bị thủy phân Sản phẩm thủy - N-Benzyloxycarbonyi-Phe-citrulline + aniline [11, 21] phân - Hippuric acid + alcohol - Alpha-N-benzyloxycarbonyl-amino acid + p- nitrophenol Diisopropylfluorophosphate; Phenylmethane Chất kìm hãm sulfonyl fluoride; Diethylpyrocacbonate; Chất ức chế [11, 21] proteinase (từ tinh dịch, từ khoai tây, từ gan chuột); N-Ethylmaleimide; Benzamidoacetonitrile; Gly-Giy- Tyr (benzyi) -Arg; Hg2 +; Alpha-macroglobulin (từ huyết thanh người); 1,3-dibromoaceton; Chlorometylketones (có nguồn gốc từ N-toluen-p- sulfonyi-L-Lys và N-toluen-p-sulfonyi-L-Phe); N- (4-dimetylamino-3, 5-dinitrophenyl) maleimide; lodoacetic acid; lodoacetamide; Chloroacetamide; Natri tetrathionat; H2O2[21].2 (Ficus pH tối thích carica var.Kadota); 7,0-7,5; 8,0 [11, 21] - pH tối thích (pHopt) của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzyme: gelatin: pHopt = 5, casein: pHopt= 9,5 , hemoglobin: pHopt =7. Đối với cơ chất nhân tạo như benzoyl-L-arginine ethyl ester, benzoyl L- argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt= 6,5 [11]. pH hoạt động 4,5-9,5 [11, 21] Topt 60 (Ficin S, Ficin B); 55 (Ficin D); 65 (Ficin A); 78 [11, 21] (Ficin C) 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính ficin 1.
Sự hoạt hóa và bất hoạt của ficin 9 Giống như các hợp chất sinh học khác, hoạt tính của ficin cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch. Các yếu tố hoạt hoá Để biểu hiện hoạt tính thủy phân protein tối đa đối với protein hoặc cơ chất tổng hợp, ficin cần được hoạt hóa bởi một trong các chất như glutathione, cysteine, hydrogen sulfide, cyanide, sulfite, disulfate. Chế phẩm thô của các enzyme luôn luôn đi kèm với chất hoạt hóa tự nhiên (có thể là glutathione) để cho phép hoạt động thủy phân protein; việc bổ sung thêm chất khử, có thể làm tăng tốc độ hoạt động của enzyme. Cysteine hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0,005-0,05M có thể làm tăng hoạt tính ficin ở dạng tinh thể và HCN 0,075M làm ficin có hoạt tính xúc tác cực đại so với các tác nhân hoạt hóa khác.
