MỞ ĐẦU Chế phẩm enzyme lactase được sử dụng ở dạng tự do và cố định. Tuy nhiên enzym cố định có nhiều ưu điểm so với enzyme tự do khi ứng dụng vì: Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ enzyme chống lại các ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng độ cơ chất cao, sự thay đổi pH, nhiệt độ, sự có mặt của các chất ức chế như galactose, ion kim loại… Khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme cố định rộng hơn, nhờ đó tăng khả năng ứng dụng của chế phẩm trong thực tiễn. Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng, do đó giảm chi phí về thiết bị và năng lượng. Có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần trong khi vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học ổn định.
Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục. Trong nghiên cứu này, enzyme lactase thu nhận từ L. acidophilus sẽ được nghiên cứu phương pháp gắn trên một chất mang phù hợp nhằm tạo được một chế phẩm lactase cố định và nghiên cứu các đặc tính của chế phẩm này, cũng như khả năng ứng dụng của chế phẩm. Nội dung nghiên cứu gồm: Khảo sát chọn phương pháp cố định lactase.
Xác định quy trình và các thông số tạo chế phẩm lactase cố định. Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định. Thử nghiệm ứng dụng thủy phân lactose trong sữa và dịch whey. HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM ix GVHD: TS.
TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 Chƣơng 1. Phản ứng xúc tác của lactase Lactase là tên gọi thông thường của β-D-galactosidase, hay β-D-galactoside galactohydrolase, E.23), thủy phân liên kết β-D-1,4-galactosidic, bao gồm lactose, oligosaccharides và polysaccharides (Rark và cộng sự, 2010). Lactase xúc tác phản ứng thủy phân lactose tạo glucose và galactase.1 Thủy phân lactose bởi xúc tác enzyme lactase Ngoài xúc tác phản ứng thủy phân lactose, lactase còn xúc tác phản ứng transgalactosyl chuyển hóa lactose thành Galacto-oligosaccharide (GOS) (Zárate và López-Leiva, 1990). GOS bao gồm Galacto-disaccharides (GOS-2), Galacto- trisaccharides (GOS-3), Galacto-tetrasaccharides (GOS-4), và pentasaccharides.
GOS được coi như một prebiotic, kích thích sự sinh sôi của hệ vi khuẩn lactic và hệ vi sinh vật đường ruột giúp cải thiện sức khỏe con người (Sako và cộng sự, 1999). Khả năng xúc tác của lactase cho phản ứng transgalactosyl và phản ứng thủy phân lactose là như nhau. Tỷ lệ xảy ra giữa 2 phản ứng trên phụ thuộc vào nguồn thu lactase (Cheng và cộng sự, 2006). Enzyme lactase từ Eschrichia coli và Aspergillus niger, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis có tác dụng mạnh cho xúc tác phản ứng thủy phân.
Trong khi đó lactase từ Aspergillus oryzae hay Bacillus circulans có tác HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 10 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 dụng mạnh cho xúc tác phản ứng transgalactosyl (Prenosil và cộng sự, 1987; Nakanishi và cộng sự, 1983; Mahoney, 1985; Sheu và cộng sự, 1998). Nguồn thu nhận enzyme lactase Nguồn thu enzyme lactase có trong cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Thường thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật, đặc biệt là từ nấm mốc Aspergillus và Penicillium (Nagy và cộng sự, 2001; Haider và Husain, 2008), nấm men Kluyveromyces (Kim và cộng sự, 2004), vi khuẩn E.
coli, Bacillus, Bifidobacterium (Phan Tran và cộng sự, 1998; Moller và cộng sự, 2001) và Sulfolobus và Pyrococcus (Petzelbauer và cộng sự, 1999). Ngoài ra còn có nguồn enzyme lactase chịu nhiệt từ Sulfolobus solfataricus (Pisani và cộng sự, 1990), Pyrococcus woesei (Xiong và cộng sự, 2007), Thermotoga maritime (Kim và cộng sự, 2004) và Thermus sp. Cụ thể được tổng hợp trong bảng sau: Bảng 1.1 Nguồn thu nhận enzyme lactase (Sanders và Klaenhammer, 2001; Fatma, 2007; Panesar và cộng sự, 2010) Nguồn thu nhận Cụ thể Ví dụ Động vật Ruột Vị trí tại các vi nhung mao của tế bào nhầy Hồng Trái cây chín (tồn tại ở quá trình chín giúp làm mềm vỏ, Đu đủ do làm enzyme này thủy phân làm giảm nồng độ Thực vật galactosyl trong vách tế bào và thành phần liên kết với Quả hạnh pectin) (Amygdalus communis) Nấm men Bullera singularis Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensic, S. fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K.
Nấm mốc Aspergillus niger, A. Vi sinh vật carbinarius Penicillum canescens, P. expansum Streptomyces violaceus Curvularia inaequalis Alternaria alternate, Alternaria palmi Auerobasidium pullulans HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 11 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum Mucor meihei, Muco pusillus Neurospora crassa Saccharopolyspora rectivergula Scopulariapsis sp.
Vi khuẩn Escherichia coli Lactobacillus acidophilus; L. Delbrueckii; Streptococcus thermophilus Bifidobacterium bifidum, B. infantis Alicyclobacillus acidocaldarius subsp; A. rittmannii Arthrobacter sp.
stearothermophilus Bacteriodes polypragmatus Clostridium acetobutylicum,C. thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E. cloaceae Klebsiella pneumoniae Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, P. pento Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S.
thermophius Sulfolobus solfatarius Thermoanaerobacter sp. aquaticus Trichoderma reesei Vibrio cholera Xanthomonas campestris HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 12 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 So sánh enzyme từ các nguồn phân bố khác nhau Enzyme lactase từ nấm mốc có thể là enzyme ngoại bào và nội bào. Enzyme lactase từ nấm men, vi khuẩn là enzyme nội bào.
Enzyme ngoại bào được thu nhận dễ dàng hơn, còn với nguồn enzyme nội bào để thu nhận cần phá vỡ tế bào vủa vi sinh vật. Một số đặc tính của β- galactosidase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau được liệt kê trong bảng dưới đây.2 Các tính chất của enzyme lactase từ các nguồn vi sinh vật (Mahoney, 1985; Gekas và Lopez-Leiva, 1985) M pHopt Topt Chất hoạt Chất ức chế Nguồn gốc (kDa) (0C) hóa Nấm mốc A.3 37 K+, Mg+2 Ca+2, Na+, Zn, Cu K.0 30-55 - - Sự lựa chọn enzyme là theo nhu cầu ứng dụng của nó, và có thể dựa vào dãy pH hoạt động. Theo bảng thống kê ở trên có thể chia enzyme thành 2 nhóm gồm: enzyme acid từ nấm mốc, và enzyme pH trung tính từ nấm men và vi khuẩn. Các enzyme acid từ nấm mốc thích hợp cho quy trình sản xuất whey acid permeate; enzyme có pH trung tính từ nấm men và vi khuẩn nói chung thích hợp cho sữa và quy trình sản xuất whey ngọt (sweet whey).
Enzyme lactase từ nấm mốc không những có pH tối ưu là vùng acid từ 3-5 mà còn có khoảng nhiệt độ tối ưu cao từ 55-600C làm ức chế nhiều vi sinh vật phát triển. Tuy nhiên nguồn enzyme này thường không tinh khiết bằng các nguồn enzyme còn lại, chúng thường có lẫn các enzyme khác như protease, lipase và amylase. Do đó làm hạn HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 13 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 chế khả năng ứng dụng loại enzyme từ nguồn này trong các sản phẩm không có tính acid hay sử dụng cho dược phẩm (Mahoney, 1985).
Enzyme từ nấm men, đặc biệt từ nguồn K. lactis được sản xuất thương mại và sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa tạo sản phẩm cho những người không dung nạp lactose, có hoạt tính cao ở pH từ 6-7 (Pivarnik, Senecal, và Rand, 1995; Rech và Ayub, 2007). Enzyme lactase từ nguồn vi khuẩn, đặc biệt nhóm vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đa dạng của lactococci, streptococci và lactobacilli đã và đang trở thành trọng tâm nghiên cứu vì chúng được coi là an toàn (theo GRAS, Generally recognized as safe) nên enzyme từ nguồn này có thể sử dụng mà không cần quá trình tinh sạch phức tạp (Vasiljevic và Jelen, 2001). Ngoài ra, khả năng hoạt động của enzyme từ nguồn vi khuẩn là mạnh và có tính ổn định.
Trong các enzyme lactase từ vi khuẩn thì nguồn từ E. coli được dùng làm mô hình nghiên cứu cơ chế hoạt động nhưng không dùng trong thực phẩm vì sinh ra độc tố. Ngoài ra, để tăng khả năng sinh tổng hợp lactase ngày nay có nhiều nghiên cứu tạo giống vi sinh vật tái tổ hợp. Enzym lactase của vi khuẩn L.
acidophilus Theo phân loại của Bergey thì L. acidophilus Giới: Bacteria Ngành: Firicules Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Chi (giống): Lactobacillus Loài: L. acidophilus HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 14 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 Hình 1.2 Hình ảnh vi khuẩn L.
acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic. Là trực khuẩn Gram dương, không di động, có chiều dài 1. Các tế bào vi khuẩn này thường xếp theo dạng cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Khuẩn lạc trong môi trường thạch có kích thước 2 đến 5 mm, lồi, đục, mịn, bóng và không có sắc tố (Gopal, 2011).
acidophilus sử dụng nguồn carbon lactose, glucose, sucrose, maltose, mannose, esculin, salicin; không lên men arabinose, xylose, rhammose, ribose, sorbitol. Nguồn cacbon được sử dụng để sản sinh năng lượng và sinh acid lactic. acidophilus thường cư trú ở đường tiêu hóa, miệng và âm đạo. acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí hoặc kỵ khí.
Nhiệt độ tối ưu cho L. acidophilus phát triển thường từ 35-40oC, có một vài loài phát triển ở 45oC, pH tối ưu từ 5.0, tuy nhiên chúng có thể sống ở môi trường có tính acid cao pH 4-5 hoặc thấp hơn. acidophilus sinh sản bằng cách chia đôi hay trực phân. acidophilus đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men nhiều loại thực phẩm như sữa, lên men trái cây và rau quả.
Có rất nhiều sản phẩm sữa lên men sử dụng L. acidophilus ví dụ ở thị trường Mỹ có sản phẩm sữa acidophilus ngọt và sữa acidophilus chua, được tiêu thụ bởi người kém tiêu hóa và những người không dung nạp lactose. acidophilus cũng được sử dụng cùng với các vi khuẩn lactic khác trong công nghệ sản xuất sữa đề làm giảm pH, đưa sữa về điểm đẳng điện để tạo tính động tụ, tạo gel cho sữa chua. Trong quá trình lên men yogurt và nước uống yogurt điều quan trọng là phải chọn chủng L.
acidophilus có thể kết hợp với S. Tốc độ tăng trưởng của S. thermophilus cao hơn nhiều so với L. acidophilus, sự phát triển của L.
acidophilus trong sữa sẽ giúp chuyển hóa một số sản phẩm của S. thermophilus như acid formic, pyruvate và CO2 (Jafarei và Ebrahimi, 2011). HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 15 GVHD: TS. TRẦN BÍCH LAM CHƢƠNG 1 1.
acidophilus Enzym lactase thu từ vi khuẩn L. acidophilus phân lập từ lên men Ragi (Eleusine coracana) được phát hiện có hoạt tính tốt hơn so với lactase thương mại được sản xuất bởi K. Enzym lactase từ L. acidophilus có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu là 5 và 500C, Km là 3.8mM, Vm là 120mM/ml.phút trên cơ chất nền sử dụng là p- nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (Akolkar và cộng sự, 2005) Theo các nghiên cứu in vitro, Lactase của L.
acidophilus NCFM có hoạt tính 4.phút, đạt mức cao trong số tất cả các loại probiotic Lactobacillus thử nghiệm. Mức dao động hoạt tính của các probiotic Lactobacillus khác là 0.10-7 µg của σ-nitrophenol/cfu. Tuy nhiên so với mức độ hoạt động của lactase của các chủng S.10-7 µg của σ- nitrophenol/cfu.phút thì mức độ lactase của probiotic Lactobacillus là thấp. Theo Hughes và Hoover (1995), khi so sánh hoạt tính Lactase của NCFM với một số chủng bifidobacteria cho thấy rằng hoạt tính của Lactase NCFM là tương đương với B.
acidophilus được sử dụng để tổng hợp các prebiotic GOS từ lactose với sản lượng GOS tối đa là 38.
