Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trình bày thiết kế vector biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115, mang lại ứng dụng tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Xuân Chiến
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Mai Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Nguồn gốc và đặc tính
• 1.1. Xylanase từ Aspergillus
• 1.2. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger
• 1.3. Vector biểu hiện và chủng biểu hiện P.
• 1.3.1. Chủng biểu hiện P.
• 1.3.2. Vector biểu hiện
• 1.4. Tình hình nghiên cứu biểu hiện xylanase
• 1.4.1. Trên thế giới
• 1.5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 1.5.2. Các dung dịch và đệm
• 1.5.3. Môi trường
• 1.5.4. Máy móc và thiết bị thí nghiệm
• 1.5.5. Nội dung nghiên cứu
• 1.5.6. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.6.1. Phương pháp nuôi cấy
• 1.5.6.2. Phương pháp khuếch đại gen từ khuôn ADN tổng số
• 1.5.6.3. Phương pháp nối ghép gen ngoại lai
• 1.5.6.4. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.
• 1.5.6.5. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E.
• 1.5.6.6. Điện di ADN trên gel agarose
• 1.5.6.7. Xử lý ADN plasmid bằng enzym cắt giới hạn
• 1.5.6.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose
• 1.5.6.9. Biến nạp ADN plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 1.5.6.10. Tách chiết ADN tổng số nấm men
• 1.5.6.11. Xác định hoạt tính xylanase
• 1.5.6.11.1. Định tính xylanase
• 1.5.6.11.2. Định lượng xylanase
• 1.5.6.12. Điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)
• 1.5.6.13. Xử lý số liệu
• 1.6. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 1.6.1. Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A.
• 1.6.2. Nhân dòng gen mã hóa xylanase D
• 1.6.3. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/xlnD (pPXlnD)
• 1.6.4. pastoris GS115 mang gen xln D
• 1.6.5. Biểu hiện rXlnD tái tổ hợp trong P.
• 1.6.6. Nghiên cứu thời gian biểu hiện
• 1.6.7. Nghiên cứu nồng độ methanol cảm ứng
• 1.6.8. Kết quả nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A.
• 1.6.9. Kết quả biểu hiện rXlnD tái tổ hợp
• 1.7. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện xylanase tái tổ hợp

Nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115 đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Xylanase là enzym quan trọng trong quá trình thủy phân xylan, một polysaccharid phong phú trong thành tế bào thực vật. Việc thiết kế vector biểu hiện cho phép sản xuất xylanase với hoạt tính cao, đáp ứng nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dược phẩm và xử lý chất thải. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất enzym mà còn mở ra hướng đi mới cho công nghệ sinh học.

1.1. Định nghĩa và vai trò của xylanase trong công nghiệp

Xylanase là enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết β-1,4 của xylan, giúp chuyển đổi polysaccharid thành xylooligosaccharid và xylose. Các sản phẩm này có ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, và sản xuất nhiên liệu sinh học. Theo báo cáo của Grand View Research, quy mô thị trường enzym toàn cầu dự kiến sẽ mở rộng với tốc độ tăng trưởng hàng năm 6,5% từ năm 2021 đến 2028.

1.2. Tình hình nghiên cứu xylanase trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng xylanase từ các nguồn khác nhau như nấm, vi khuẩn và nấm men có hoạt tính khác nhau. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc cải thiện tính ổn định và hoạt tính của xylanase thông qua công nghệ tái tổ hợp. Việc sử dụng Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện đã cho thấy nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng sản xuất enzym với số lượng lớn và hoạt tính cao.

II. Thách thức trong việc sản xuất xylanase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc sản xuất xylanase tái tổ hợp vẫn gặp phải nhiều thách thức. Độ nhạy của enzym đối với nhiệt độ và pH là một trong những vấn đề lớn nhất. Các enzym tự nhiên thường không ổn định trong điều kiện công nghiệp, dẫn đến hiệu suất thấp. Do đó, việc phát triển các enzym bền nhiệt và ổn định trong môi trường kiềm hoặc acid là rất cần thiết. Nghiên cứu này nhằm tìm ra giải pháp cho những thách thức này.

2.1. Độ nhạy của enzym đối với nhiệt độ và pH

Các enzym xylanase tự nhiên thường có hoạt tính cao ở nhiệt độ và pH nhất định. Tuy nhiên, trong môi trường công nghiệp, điều kiện này thường không được đảm bảo. Việc phát triển các enzym bền nhiệt và ổn định trong môi trường kiềm hoặc acid sẽ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất và mở rộng ứng dụng của xylanase.

2.2. Khó khăn trong việc duy trì điều kiện nuôi cấy

Việc duy trì điều kiện nuôi cấy tối ưu cho vi sinh vật sản xuất xylanase là một thách thức lớn. Các thông số như nhiệt độ, pH, và nồng độ dinh dưỡng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sản xuất enzym hiệu quả. Nghiên cứu này sẽ đề xuất các phương pháp cải tiến để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

III. Phương pháp nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện xylanase

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nhân dòng gen và thiết kế vector biểu hiện để sản xuất xylanase tái tổ hợp. Các bước chính bao gồm khuếch đại gen mã hóa xylanase từ Aspergillus niger, thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/xlnD, và biến nạp ADN plasmid vào tế bào Pichia pastoris. Phương pháp này cho phép sản xuất enzym với hoạt tính cao và ổn định.

3.1. Khuếch đại gen mã hóa xylanase

Gen mã hóa xylanase được khuếch đại từ ADN tổng số của Aspergillus niger bằng phương pháp PCR. Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để đảm bảo tính chính xác trong quá trình khuếch đại. Kết quả khuếch đại sẽ được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA xlnD

Vector biểu hiện pPICZαA/xlnD được thiết kế để tối ưu hóa việc sản xuất xylanase trong Pichia pastoris. Vector này chứa các yếu tố điều khiển cần thiết cho việc biểu hiện gen, bao gồm promoter AOX1 và tín hiệu xuất khẩu. Việc thiết kế vector này là bước quan trọng để đảm bảo hoạt tính enzym cao trong điều kiện nuôi cấy.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của xylanase

Kết quả nghiên cứu cho thấy xylanase tái tổ hợp được sản xuất từ Pichia pastoris GS115 có hoạt tính cao và ổn định. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng enzym này có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ công nghiệp thực phẩm đến dược phẩm. Việc sử dụng xylanase trong sản xuất thực phẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm.

4.1. Kết quả biểu hiện xylanase trong Pichia pastoris

Xylanase tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong Pichia pastoris với hoạt tính cao. Các thí nghiệm điện di SDS-PAGE cho thấy sự hiện diện của protein xylanase với kích thước mong đợi. Kết quả này mở ra cơ hội cho việc sản xuất enzym quy mô lớn.

4.2. Ứng dụng xylanase trong công nghiệp thực phẩm

Xylanase có thể được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để cải thiện giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Enzym này giúp phân giải các polysaccharid phức tạp, tạo ra các sản phẩm dễ tiêu hóa hơn. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng mới.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115 đã mở ra nhiều cơ hội mới cho công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector biểu hiện và sản xuất enzym với hoạt tính cao sẽ giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng trong các ngành công nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho xã hội.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy xylanase tái tổ hợp có hoạt tính cao và ổn định, mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Việc sản xuất enzym này có thể giúp cải thiện hiệu suất trong các ngành công nghiệp sử dụng xylanase.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc cải tiến các phương pháp sản xuất xylanase và mở rộng ứng dụng của enzym này trong các lĩnh vực khác nhau. Việc phát triển các enzym bền nhiệt và ổn định sẽ là một trong những mục tiêu chính trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Xylanase là nhóm enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glycosid của xylan – thành phần chính của hemicellulose, chiếm từ 20% đến 30% sinh khối thành tế bào thực vật (bên cạnh cellulose chiếm 35–50% và lignin chiếm 20–30%). Quá trình thủy phân xylan giải phóng các sản phẩm có giá trị cao gồm xylo-oligosaccharid (XOS) và đường xylose. Các sản phẩm này là nguyên liệu thiết yếu phục vụ công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp giấy - bột giấy, nhiên liệu sinh học và đặc biệt là công nghiệp dược phẩm. Trong lĩnh vực y dược, XOS đóng vai trò như một prebiotic thế hệ mới, có khả năng kích thích sự phát triển của hệ vi khuẩn có lợi đường ruột (như Bifidobacteria), hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, nâng cao khả năng hấp thu calci, hỗ trợ kiểm soát bệnh đái tháo đường týp II, chống oxy hóa và giảm thiểu nguy cơ ung thư ruột kết.

Báo cáo thị trường của Grand View Research (2020) chỉ ra rằng quy mô thị trường enzym toàn cầu đạt 10,69 tỷ USD và dự kiến đạt tốc độ tăng trưởng kép hàng năm (CAGR) 6,5% giai đoạn 2021–2028, trong đó phân khúc carbohydrase chiếm tỷ trọng doanh thu trên 45,0%. Tuy nhiên, phần lớn các quy trình sản xuất công nghiệp đòi hỏi enzym phải hoạt động ở điều kiện nhiệt độ cao và pH biến đổi. Các enzym xylanase tự nhiên phân lập từ vi sinh vật thường được sinh tổng hợp với hiệu suất thấp, điều kiện nuôi cấy nghiêm ngặt và khó duy trì ổn định ở quy mô công nghiệp lớn.

Để giải quyết bài toán về sản lượng và tính chất enzym, kỹ thuật di truyền tái tổ hợp được ứng dụng nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa xylanase trong các hệ thống sinh vật chủ thích hợp. Đề tài khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: "Nhân dòng, thiết kế vector biểu hiện xylanase D tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115" được thực hiện nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

1. Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957.
2. Biểu hiện thành công xylanase D tái tổ hợp trong hệ thống nấm men Pichia pastoris GS115.

Nghiên cứu được triển khai tại Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội và Phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cấp Viện mã số 106 do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

• Enzym xylanase và phân loại: Xylanase thuộc nhóm O-glycosid hydrolase (EC 3.2.1.x), phân bố chủ yếu trong các họ glycosid hydrolase GH10, GH11 và một số họ khác như GH5, GH7, GH8, GH43. Trong đó, gen xlnD mã hóa xylanase D thuộc họ GH43 – họ enzym có cấu trúc không gian đặc trưng dạng cánh quạt năm cánh ($\beta$-propeller), có khả năng tiếp cận và phân giải các cơ chất polysaccharide phức tạp như xylan, arabinan hoặc arabinoxylan.
• Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris GS115: Là chủng nấm men sử dụng methanol (methylotrophic yeast), sở hữu các ưu điểm của sinh vật nhân thực (khả năng cuộn gập protein chính xác, hình thành cầu nối disulfid và cải biến sau dịch mã) đồng thời dễ nuôi cấy và đạt mật độ tế bào cao tương tự vi khuẩn. Hệ thống sử dụng promoter AOX1 (alcohol oxidase 1) có mức độ cảm ứng phiên mã mạnh bởi methanol khi cạn kiệt nguồn carbon kìm hãm (như glucose hoặc glycerol).
• Vector biểu hiện pPICZαA: Kích thước 3.593 bp, chứa promoter AOX1, peptit tín hiệu tiết $\alpha$-factor giúp tiết protein ngoại bào, gen kháng Zeocin cho phép chọn lọc trên cả vi khuẩn và nấm men, cùng trình tự mã hóa epitope c-myc và đuôi polyhistidin (6xHis) ở đầu C hỗ trợ nhận diện và tinh sạch protein.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử và hóa sinh chuẩn xác bao gồm các kỹ thuật:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật và thông số thực nghiệm chính
Khuếch đại và tách dòng gen	Phản ứng PCR khuếch đại gen xlnD từ DNA tổng số của A. niger DSM1957 bằng cặp mồi đặc hiệu có gắn vị trí cắt của enzym giới hạn EcoRI và NotI. Tách dòng trung gian trên vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10B bằng phương pháp sốc nhiệt ($42^\circ\text{C}$, 45 giây).
Thiết kế vector biểu hiện	Xử lý plasmid pJXlnD và vector pPICZαA bằng hai enzym cắt giới hạn EcoRI và NotI; tinh sạch sản phẩm cắt bằng cột silica gel; nối ghép đoạn gen ngoại lai bằng T4 DNA ligase ở $22^\circ\text{C}$; giải trình tự DNA kiểm tra khung đọc mở.
Biến nạp vào nấm men	Mở vòng vector tái tổ hợp pPXlnD tại vùng AOX1 bằng enzym cắt giới hạn SacI; tinh sạch DNA mở vòng; chuẩn bị tế bào khả biến P. pastoris GS115 trong dung dịch sorbitol 1 M; biến nạp bằng xung điện với thông số 1,5 kV, 25 $\mu\text{F}$, 200 $\Omega$; chọn lọc thể tái tổ hợp trên đĩa thạch YPDS bổ sung Zeocin ($100,\mu\text{g/ml}$).
Kiểm tra hội nhập bộ gen	Tách chiết DNA tổng số của các khuẩn lạc nấm men kháng Zeocin bằng phương pháp sốc nhiệt kết hợp hóa chất (Triton X-100, SDS) và phenol/chloroform; thực hiện phản ứng PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu (XylD_F/XylD_R) và cặp mồi kiểm tra vùng chèn 5'AOX1/3'AOX1.
Biểu hiện và đánh giá hoạt tính	Nuôi cấy tạo sinh khối trong môi trường YPG (1% glycerol, $28^\circ\text{C}$, 200 rpm), chuyển sang môi trường YP cảm ứng bằng methanol định kỳ sau mỗi 24 giờ. Định tính hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cơ chất xylan 0,5% nhuộm Lugol 0,2%; định lượng hoạt tính bằng phản ứng với thuốc thử DNS ở bước sóng 540 nm; phân tích kích thước protein bằng điện di SDS-PAGE 12,5% nhuộm bạc.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Nguồn gốc và đặc tính

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về cấu trúc, cơ chế tác dụng, phân loại và nguồn gốc của enzym xylanase trong tự nhiên. Nội dung phân tích chi tiết tiềm năng sinh học của xylanase từ chi nấm sợi Aspergillus, đặc biệt là loài Aspergillus niger – sinh vật sản xuất xylanase ngoại bào chủ lực với 8 gen mã hóa đã được định danh trên cơ sở dữ liệu quốc tế Uniprot.

Chương này cũng tổng kết vai trò sinh học của các loại oligosaccharid khác nhau trong dinh dưỡng và trị liệu, đồng thời phân tích cơ chế điều hòa biểu hiện của hệ thống Pichia pastoris dưới sự kiểm soát của promoter AOX1. Các nghiên cứu biểu hiện xylanase tái tổ hợp trên thế giới (Ping và cộng sự, 2006; Fang và cộng sự, 2014; Elgharbi và cộng sự, 2015; Long và cộng sự, 2020) và tại Việt Nam (Trần Liên Hà, 2013; Đặng Thị Kim Anh, 2016) được tổng thuật nhằm làm rõ khoảng trống khoa học về biểu hiện xylanase thuộc họ GH43.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật, danh mục hóa chất, các dung dịch đệm, công thức môi trường nuôi cấy (LB, LB agar, YP, YPD, YPDS, YPG) và danh mục trang thiết bị sử dụng trong các bước thí nghiệm.

Chương này xác lập các thông số kỹ thuật cho toàn bộ chu trình nghiên cứu: từ thiết kế mồi PCR (XylD_F, XylD_R, 5'AOX1, 3'AOX1), quy trình biến nạp, xử lý enzym giới hạn, tinh sạch DNA, tách chiết DNA nấm men, đến quy trình định lượng đường khử theo phương pháp DNS với đường chuẩn D-xylose xây dựng trong khoảng nồng độ 10–200 $\mu\text{g/ml}$ và quy trình điện di protein SDS-PAGE 12,5% biến tính nhuộm bạc theo Bassam (1991).

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình tạo dòng đến nuôi cấy biểu hiện và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp xylanase D tái tổ hợp:

• Nhân dòng gen xlnD: Khuếch đại PCR từ bộ gen A. niger DSM1957 thu được một băng DNA duy nhất kích thước khoảng 1.000 bp (tương ứng kích thước lý thuyết 957 bp). Sản phẩm nối vào vector pJET1.2/blunt tạo vector pJXlnD, khi cắt kiểm tra bằng EcoRI và NotI giải phóng hai phân đoạn đặc trưng: 3.000 bp (vector) và 1.000 bp (đoạn chèn xlnD).
• Thiết kế vector biểu hiện pPXlnD: Đoạn gen xlnD được tinh sạch và nối ghép thành công vào vector biểu hiện pPICZαA. Cắt kiểm tra plasmid pPXlnD bằng EcoRI và NotI xuất hiện hai băng kích thước ~3.600 bp và ~1.000 bp. Kết quả giải trình tự khẳng định đoạn chèn dài 957 bp, mã hóa 318 acid amin, có độ tương đồng 100% với trình tự công bố trên GenBank (mã số EU861039), đúng khung đọc mở và bảo tồn nguyên vẹn trình tự thẻ 6xHis.
• Tạo chủng nấm men tái tổ hợp: Plasmid pPXlnD được tuyến tính hóa bằng enzym SacI (băng điện di ~4.500 bp) và biến nạp vào tế bào khả biến P. pastoris GS115 bằng xung điện. Phân tích PCR DNA bộ gen các dòng tái tổ hợp kháng Zeocin cho thấy:
  • Cặp mồi đặc hiệu XylD_F/XylD_R khuếch đại phân đoạn gen kích thước 1.000 bp.
  • Cặp mồi 5'AOX1/3'AOX1 cho hai băng kích thước 2.200 bp (vùng gen AOX1 nội sinh của nấm men) và 1.400 bp (đoạn gen xlnD tích hợp cùng các vùng đệm trên vector).
• Biểu hiện enzym rXlnD: Dịch nuôi cấy ngoại bào sau 120 giờ cảm ứng tạo vòng phân giải rõ nét trên đĩa thạch xylan 0,5% (đối chứng âm mang vector rỗng không tạo vòng phân giải). Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào nhuộm bạc phát hiện băng protein tái tổ hợp có khối lượng phân tử $>35,\text{kDa}$ (phù hợp với khối lượng phân tử lý thuyết 35,5 kDa).
• Khảo sát điều kiện biểu hiện:
  • Thời gian nuôi cấy: Khảo sát từ 24 đến 192 giờ cho thấy hoạt tính tăng dần và đạt đỉnh ở 120 giờ ($1,233 \pm 0,037,\text{IU/ml}$), sau đó giảm dần do cạn kiệt dinh dưỡng và hiện tượng phân hủy protein.
  • Nồng độ methanol cảm ứng: Khảo sát từ 0,1% đến 2,0% cho thấy hoạt tính đạt tối đa tại nồng độ cảm ứng 1,0% methanol bổ sung sau mỗi 24 giờ ($1,153 \pm 0,050,\text{IU/ml}$, mật độ quang $\text{OD}{600}$ đạt 7,66). Khi nồng độ methanol tăng lên 1,5%–2,0%, mật độ tế bào và hoạt tính enzym giảm mạnh ($\text{OD}{600}$ còn 1,12 và hoạt tính đạt $0,919 \pm 0,009,\text{IU/ml}$ ở 2,0% methanol) do tích lũy độc chất hydrogen peroxid sinh ra trong quá trình oxy hóa methanol quá mức.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật và kết quả thực nghiệm

Thông số / Chỉ tiêu phân tích	Giá trị / Kết quả xác định trong khóa luận
Kích thước gen xlnD	957 bp, mã hóa chuỗi polypetit gồm 318 acid amin (GenBank EU861039)
Khối lượng phân tử protein rXlnD	Phân tích lý thuyết ~35,5 kDa; phân tích điện di SDS-PAGE cho băng $>35,\text{kDa}$
Hệ thống vector và chủng chủ	Vector biểu hiện pPICZαA (3.593 bp), chủng chủ Pichia pastoris GS115
Hoạt tính định lượng dịch thô (120h)	$1,276 \pm 0,057,\text{IU/ml}$
Thời gian nuôi cấy tối ưu	120 giờ (hoạt tính đạt $1,233 \pm 0,037,\text{IU/ml}$)
Nồng độ methanol cảm ứng tối ưu	1,0% (v/v) bổ sung định kỳ sau mỗi 24 giờ (hoạt tính đạt $1,153 \pm 0,050,\text{IU/ml}$)

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Đóng góp khoa học: Khóa luận đã xây dựng thành công cấu trúc vector biểu hiện pPICZαA/xlnD mang gen xylanase D từ chủng A. niger DSM1957; chứng minh tính khả thi của việc biểu hiện ngoại bào enzym xylanase họ GH43 trên hệ thống nấm men P. pastoris GS115 dưới sự điều khiển của promoter AOX1.
• Đóng góp thực tiễn: Tạo ra chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris GS115 mang gen xlnD ổn định, cung cấp nguồn chủng giống phục vụ các nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men sinh khối quy mô lớn, hướng đến sản xuất enzym công nghiệp trong nước để ứng dụng thủy phân sinh khối tạo XOS làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng và dược phẩm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Khóa luận mới dừng lại ở việc khảo sát sơ bộ hai yếu tố lên men đơn lẻ (thời gian và nồng độ chất cảm ứng methanol) trong bình tam giác ở quy mô phòng thí nghiệm; chưa đánh giá sự tương tác đa yếu tố hoặc tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng phức hợp.
• Protein tái tổ hợp chưa được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực và chưa được phân tích cấu trúc chính xác bằng phương pháp khối phổ MALDI-TOF.
• Chưa xác định đầy đủ các đặc tính hóa lý của enzym tái tổ hợp sau tinh sạch (khoảng nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu, độ bền nhiệt, ảnh hưởng của các ion kim loại).

Hướng nghiên cứu tiếp

1. Tiếp tục tối ưu hóa các thành phần môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống, tốc độ cấp khí trong thiết bị lên men) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzym của chủng nấm men tái tổ hợp.
2. Tinh sạch xylanase D tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực kim loại (dựa trên đuôi 6xHis) để đánh giá độ tinh sạch, hiệu suất thu hồi và tiến hành xác định khối phổ MALDI-TOF.
3. Nghiên cứu chi tiết các đặc tính động học, độ bền nhiệt, độ bền pH của enzym tinh sạch và thử nghiệm ứng dụng thủy phân các phụ phẩm nông nghiệp tạo xylo-oligosaccharid (XOS).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các đối tượng và nội dung sau:

• Sinh viên, học viên ngành Dược học, Công nghệ sinh học và Hóa sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo về quy trình nhân dòng gen, kỹ thuật thiết kế vector biểu hiện cho hệ thống nấm men nhân thực và các bước thực nghiệm thao tác với nấm men Pichia pastoris.
• Cán bộ nghiên cứu công nghệ enzym và protein tái tổ hợp: Cung cấp thông số thực nghiệm về phản ứng PCR khuếch đại họ gen GH43, quy trình biến nạp xung điện vào P. pastoris, các phương pháp định tính/định lượng hoạt tính phân giải cơ chất polysaccharide (phương pháp DNS, giếng thạch Lugol) và kỹ thuật điện di SDS-PAGE nhuộm bạc độ nhạy cao.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn hệ thống biểu hiện Pichia pastoris GS115 thay vì vi khuẩn Escherichia coli?

Pichia pastoris là sinh vật nhân thực có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như tạo cầu nối disulfid và cuộn gập protein chính xác, giúp protein biểu hiện giữ được hoạt tính sinh học và hòa tan. Ngược lại, E. coli thiếu các cơ chế này, dễ dẫn đến việc protein bị cuộn xoắn sai lệch, hình thành thể vùi (inclusion bodies) không hoạt động hoặc bị bất hoạt.

2. Gen xlnD được khuếch đại từ nguồn sinh vật nào và có các đặc điểm cấu trúc phân tử ra sao?

Gen xlnD được khuếch đại từ DNA tổng số của chủng nấm sợi Aspergillus niger DSM1957. Trình tự gen có độ dài 957 bp, mã hóa chuỗi polypetit gồm 318 acid amin với khối lượng phân tử tính toán lý thuyết là 35,5 kDa, có trình tự tương đồng 100% với dữ liệu GenBank mã số EU861039 và thuộc họ glycosid hydrolase GH43.

3. Phương pháp nào được sử dụng để kiểm tra sự hội nhập của vector biểu hiện vào bộ gen nấm men?

Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR trên khuôn DNA tổng số của nấm men tái tổ hợp với hai hệ mồi:

• Cặp mồi đặc hiệu (XylD_F/XylD_R) cho một băng DNA kích thước 1.000 bp xác nhận có sự hiện diện của gen xlnD.
• Cặp mồi kiểm tra vùng chèn 5'AOX1/3'AOX1 cho hai băng kích thước 2.200 bp (vùng gen AOX1 tự nhiên của tế bào chủ) và 1.400 bp (đoạn gen xlnD được chèn tại vị trí đa điểm cắt giữa hai mồi trên vector).

4. Điều kiện cảm ứng biểu hiện rXlnD tối ưu được xác định trong khóa luận là gì?

Điều kiện nuôi cấy tối ưu đạt được tại thời điểm 120 giờ nuôi cấy với nồng độ methanol cảm ứng là 1,0% (v/v) bổ sung định kỳ sau mỗi 24 giờ, cho hoạt tính enzym ngoại bào đạt $1,153 \pm 0,050,\text{IU/ml}$ và mật độ tế bào $\text{OD}_{600}$ đạt 7,66.

5. Vì sao khi tăng nồng độ methanol lên 1,5%–2,0% thì sinh khối và hoạt tính enzym đều suy giảm?

Methanol vừa là chất cảm ứng promoter AOX1 vừa là nguồn cơ chất cho quá trình trao đổi chất của nấm men. Khi nồng độ methanol trong môi trường quá cao (1,5%–2,0%), tốc độ oxy hóa methanol của enzym alcohol oxidase tăng mạnh làm giải phóng lượng lớn hydrogen peroxid ($\text{H}_2\text{O}_2$), gây độc tế bào, ức chế sinh trưởng và làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzym tái tổ hợp.

---

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành mục tiêu nhân dòng thành công gen xlnD kích thước 957 bp từ chủng Aspergillus niger DSM1957 và thiết kế vector biểu hiện pPXlnD đúng khung đọc mở. Chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris GS115 mang gen xlnD đã biểu hiện thành công enzym ngoại bào rXlnD có khối lượng phân tử $>35,\text{kDa}$ với hoạt tính thủy phân xylan rõ rệt. Kết quả khảo sát bước đầu xác định điều kiện cảm ứng thích hợp là 1,0% methanol tại thời điểm 120 giờ nuôi cấy, đặt nền tảng kỹ thuật quan trọng cho các nghiên cứu tối ưu hóa quy trình lên men và ứng dụng xylanase trong công nghệ dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Định nghĩa Xylanase là glycosidase (O-glycosid hydrolase, EC 3.x) xúc tác quá trình thủy phân các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan. Các enzym này giúp phân giải polysaccharid xylan mạch thẳng thành xylose, một nguồn carbon chính cho quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật. Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955 [38], ban đầu chúng được gọi là pentosanase, và được Liên minh Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (IUBMB) công nhận vào năm 1961 khi được gán mã enzym EC 3.

Tên chính thức của chúng là endo-1,4-β-xylanase, nhưng các thuật ngữ đồng nghĩa thường được sử dụng bao gồm xylanase, endoxylanase, 1,4-β-D-xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β-D-xylanase, β- 1,4-xylanase và β-xylanase. Phân loại Hệ thống phân loại các xylanase được giới thiệu năm 1989 [34] phân loại dựa trên sự so sánh cấu trúc sơ cấp của các vùng xúc tác và các nhóm enzym trong các họ có trình tự liên quan. Phân loại ban đầu đã nhóm các cellulase và xylanase thành 6 họ (A-F) [34], và được cập nhật thành 77 họ vào năm 1999 (1-77) [35] và tiếp tục phát triển khi các trình tự glycosidase mới được xác định. Hiện tại, có 172 họ glycosid hydrolase tồn tại được chú thích trong cơ sở dữ liệu CAZy [45].

Về cơ bản, xylanase được chia vào hai họ GH10 và GH11 dựa trên trình tự gen, xylanase cũng được tìm thấy trong các họ glycosid hydrolase khác, chẳng hạn như GH 5, 7, 8 và 43 [43]. Nguồn gốc và đặc tính Xylanase được tạo ra bởi nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, côn trùng,… [59]. Những xylanase này có đặc tính hóa lý, cấu trúc, khả năng hoạt động, sản lượng và tính đặc hiệu không giống nhau, do đó làm tăng hiệu quả và mức độ thủy phân xylan, cũng như sự đa dạng và phức tạp của các xylanase. Sự đa dạng này có thể là kết quả của sự dư thừa di truyền, một số trường hợp do sự khác biệt xử lý sau dịch mã.

Xylanase được tạo ra bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp.) hoạt động hiệu quả trong phạm vi pH rộng hơn từ 5-9, với nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xylanase từ 35ºC đến 60ºC [52]. Các nghiên cứu về Bacillus spp. cho thấy hoạt tính xylanase cao hơn ở pH kiềm và nhiệt độ cao [48]. Nấm (Aspergillus spp.) là những nhà sản xuất xylanase quan trọng do giải phóng xylanase ngoại bào với sản lượng enzym cao.

Ngoài ra, xylanase của nấm có hoạt tính cao hơn so với vi khuẩn hoặc nấm men. Tuy nhiên, xylanase có nguồn gốc từ nấm có một số đặc điểm khiến chúng không khả dụng cho 3 một số ứng dụng công nghiệp [48]. Hầu hết các xylanase này hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 40-60ºC và phạm vi pH từ 4-7 [13] [28]. Xylanase có thể được sản xuất công nhiệp bằng quá trình lên men rắn (SSF) hoặc lên men chìm (SmF), năng suất sinh enzym trong SSF cao hơn nhiều so với trong SmF [78].

Tuy nhiên, SSF hiện chỉ được sử dụng ở một mức độ nhỏ để sản xuất enzym và chất chuyển hóa thứ cấp do một số vấn đề về kỹ thuật quy trình. Ứng dụng Xylanase có nhiều ứng dụng công nghiệp từ công nghiệp giấy và bột giấy đến công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Ứng dụng chính của xylanase là biến đổi sinh học sinh khối lignocellulose hoặc chất thải nông nghiệp thành các sản phẩm lên men [59]. Xylanase đã được ứng dụng hiệu quả trong tẩy trắng sinh học và quá trình phân hủy sinh học của ngành công nghiệp giấy và bột giấy.

Xylanase giúp giảm hàm lượng lignin và tăng độ sáng của bột giấy [40]. Xylanase ổn nhiệt hỗ trợ quá trình đường hóa sinh khối lignocellulose thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao trước khi sản xuất cồn sinh học. Do đó, xylanase cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong ngành nhiên liệu sinh học [60]. Các loại thức ăn chăn nuôi phổ biến như ngũ cốc, lúa mạch, và thức ăn có đậu nành rất giàu sinh khối lignocellulose.

Xử lý bằng xylanase đối với thức ăn chăn nuôi sẽ tạo điều kiện giải phóng các chất dinh dưỡng trong các đại phân tử, do đó các enzym tiêu hóa có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất của chúng, giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn chăn nuôi [65]. Ứng dụng xylanase trong lĩnh vực y dược trong những năm gần đây đang ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nước và trên thế giới. Các phương pháp enzym được ưu tiên để sản xuất các oligosaccharid thực phẩm và thuốc. Sản phẩm thủy phân được xúc tác bởi enzym còn tạo ra các sản phẩm có tác dụng sinh học cao.

Việc sử dụng phương pháp enzym hiện nay còn được coi là kinh tế, nhanh chóng và thân thiện với môi trường hơn so với các phương pháp xử lý hóa lý để tạo các sản phẩm thủy phân, quá trình xử lý bằng enzym không tạo ra các hợp chất có hại cũng như không yêu cầu các thiết bị đặc biệt [10] [41]. Quá trình thủy phân xylan được xúc tác bởi xylanase tạo ra xylo-oligosaccharid (XOS). Các oligosaccharid (xylo-oligomers, cello-oligomers) cho thấy một số ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng. XOS có đặc tính prebiotics và có thể được sản xuất bằng cách thủy phân xylan từ các nguồn khác nhau như lõi ngô, vỏ lúa mạch, vỏ trấu, rơm, lúa mì [53].

XOS ổn định ở nhiệt độ cao và pH có tính acid là nguồn carbon thích hợp giúp tăng cường hệ vi khuẩn có lợi ở đường ruột như Bifidobacteria, giúp tăng cường sức khỏe, cải thiện hệ tiêu hóa [21]. XOS cũng 4 được sử dụng trong một số sản phẩm đồ uống như sữa đậu nành, trà, cà phê và các sản phẩm từ sữa khác [39]. Cấu trúc và tính chất của XOS có thể thay đổi do sự thay đổi về mức độ trùng hợp, các phương pháp được sử dụng để chiết xuất và loại liên kết hiện có. XOS có tiềm năng đáng chú ý là prebiotics mới và cho thấy nhiều lợi ích khác nhau như tăng khả năng hấp thụ calci để tăng hoạt tính sinh học [54], hoạt tính gây độc tế bào trên bệnh bạch cầu [5], cải thiện chức năng ruột [70], giảm thiểu nguy cơ ung thư ruột kết [70], tác dụng cụ thể trên vị trí đối với bệnh đái tháo đường týp II [66], và các đặc tính chống oxy hóa [69].

XOS cũng đã chứng minh khả năng trong việc tổng hợp các hợp chất hoạt động chống lại các hợp chất gây ung thư và virus. Sự thay đổi cấu trúc của oligosaccharid đã cho thấy các đặc tính khác như kháng virus, kháng u, chống đông máu và các đặc tính tái tạo mô/sụn [55]. Nguồn gốc và vai trò của các oligosaccharid khác nhau [10] Oligosaccharids Nguồn cung cấp Chức năng Vỏ trấu Bengal, cám Chất chống oxy hóa, mỹ phẩm, Xylo-oligosaccharid lúa mì và rơm rạ, gỗ chất điều chỉnh, chất kích thích (XOS) cây dương, vỏ lúa tăng trưởng thực vật, prebiotic, mạch,. điều trị đái tháo đường,… Tỏi, cà chua, hành tây, mật ong, lúa mạch đen, lúa mạch, Các đặc tính cariogenic, giá trị Fructo-oligosaccharid chuối diếp xoăn, calo thấp.

thanh long, măng tây,… Phản ứng kích thích sinh trưởng Arabino-oligosaccharid của vi khuẩn trong ruột kết, tạo Củ cải đường (AOS) điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng dinh dưỡng của động vật. Các hoạt động chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, bảo vệ các Chitosan-oligosaccharid Sản phẩm khử phân tế bào bình thường khỏi quá trình (COS) tử chitosan apoptosis, chống tăng huyết áp, chống vi khuẩn và chống lại các tế bào ung thư, ung thư vú. Sữa bò và sữa người, Có tác dụng trên sức khỏe đường Galacto-oligosaccharid đường Lactose, hạt ruột, ung thư ruột kết, bệnh viêm đậu nành ruột. 5 Đậu cô ve, cẩm quỳ, đậu Hà Lan, hạt các Phòng trừ dịch bệnh cho động thực Raffinose-oligosaccharid loại đậu, đậu lăng, vật và con người.

đậu, composite và mù tạt Tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển ưu tiên của vi khuẩn Human milk Sữa mẹ bifidobacteria và lactobacilli oligosaccharid (HMO) trong ruột kết của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ. Beta-Glucan Chế độ ăn kiêng dựa Tạo hiệu ứng “lactobacillogenic” oligosaccharid trên yến mạch tốt hơn. Thực vật bậc cao, Được sử dụng trong sữa công thức Pectin-derived acidic bao gồm trái cây và cho trẻ sơ sinh, làm giảm tiêu oligosaccharid (pAOS) rau quả, trái cây chảy. Mannan-oligosaccharid Các mảnh thành tế Điều chỉnh hệ vi sinh vật đường (MOS) bào của nấm men ruột của cá tráp biển vàng.

Algae derived marin Kích thích miễn dịch, chất chống oligosaccharid (ADMO) ung thư. Bảo vệ hiệu quả HDO chống lại sự Oligo-diaminogalactose phân cắt RNase A mà không làm (ODAGal) giảm hoạt tính RNase H của gapmer. Cello-oligosaccharid Dược phẩm, công thức thức ăn chăn nuôi và ứng dụng thực phẩm Bản chất không tiêu hóa của Rơm rạ, rơm lúa mì, Manno-oligosaccharid prebiotic, phản ứng kích thích sự lõi ngô, kẹo cao su phát triển của vi khuẩn trong ruột guar kết. Pectic-oligosaccharid Đặc tính chống kết dính.

Xylanase từ Aspergillus 1. Chi Aspergillus Chi Aspergillus bao gồm hơn 340 loài nấm sợi được chính thức chấp nhận là một trong những loài nấm phổ biến và phân bố khắp nơi trên trái đất [58]. Trong tự nhiên, nấm Aspergillus là tác nhân chính phân hủy các chất hữu cơ khác nhau. Nấm Aspergillus cũng gây ra một số bệnh và tạo ra các độc tố khác nhau gây hại cho thực vật.

Một số loài Aspergillus, chẳng hạn như A. flavus, có thể ảnh hưởng nghiêm 6 trọng đến sức khỏe cộng đồng bằng cách gây ra bệnh aspergillosis xâm lấn hoặc aspergillosis phế quản phổi dị ứng [19], [33]. Một số loài bao gồm A. parasiticus có thể làm ô nhiễm thực phẩm và thức ăn có nguồn gốc thực vật với độc tố aflatoxin nấm mốc, là chất gây ung thư mạnh nhất được tìm thấy trong tự nhiên.

Sử dụng thực phẩm hoặc thức ăn nhiễm aflatoxin có thể dẫn đến các tình trạng nghiêm trọng như nhiễm độc aflatoxin, hoại tử gan hoặc ung thư gan [33]. Mặc dù vậy, nhiều loài Aspergillus được sử dụng để sản xuất enzym, lên men thực phẩm, công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm. oryzae được sử dụng rộng rãi để lên men thực phẩm truyền thống ở Đông Á [37], A. niger được sử dụng để sản xuất các enzym khác nhau như amylase [6] và pectinase [44] và acid hữu cơ như acid citric [58].

Kể từ khi xylanase sinh ra từ A. niger lần đầu tiên được tinh sạch và biểu hiện vào năm 1977, A. niger được coi như một nhà sản xuất xylanase xuất sắc. Hiện nay, nhiều gen xylanase mới từ A.

niger mới đã được phân lập, nhân dòng và biểu hiện. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger Tính đến nay, đã có 551 gen mã hóa cho protein khác nhau từ A. niger được giải trình tự hoàn toàn và lưu trữ trên kho lưu trữ Uniprot [73].