Luận án tiến sĩ hus nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm nac liên quan đến tính chịu hạn

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm nac liên quan đến tính chịu hạn, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Phạm Thu Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA
• 1.2. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa
• 1.3. Ảnh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo
• 1.4. Ảnh hưởng của hạn tới cây lúa
• 1.5. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT
• 1.5.1. Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vật
• 1.5.2. Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật
• 1.6. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT
• 1.6.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A.
• 1.6.2. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A.
• 1.6.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU HẠN
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên Thế giới
• 1.7.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Vector và oligonucleotide
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Xử lý mẫu thực vật
• 2.4.2. Tách chiết, định lượng DNA/RNA
• 2.4.3. Nhân dòng gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 vào vector pGEM-T
• 2.4.4. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 trong tế bào thực vật
• 2.4.5. Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1
• 2.4.6. Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen
• 2.4.7. Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa
• 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA
• 3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam
• 3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn
• 3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn
• 3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
• 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục
• 3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động cảm ứng stress
• 3.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN OsNAC1 VÀO CÂY LÚA
• 3.3.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A.
• 3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa
• 3.3.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện OsNAC1
• 3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T1
• 3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2
• 3.4. ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC DÒNG LÚA CHUYỂN GEN
• 3.4.1. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2
• 3.4.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu giống lúa chuyển gen chịu hạn

Nghiên cứu về giống lúa chuyển gen chịu hạn đang trở thành một trong những lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Với sự gia tăng của biến đổi khí hậu, tình trạng hạn hán ngày càng trở nên nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng lúa gạo. Việc phát triển giống lúa có khả năng chịu hạn thông qua công nghệ sinh học, đặc biệt là việc sử dụng nhân tố phiên mã NAC, đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp.

1.1. Giới thiệu về cây lúa và tầm quan trọng của nó

Cây lúa Oryza sativa là một trong những loại cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới. Lúa không chỉ cung cấp thực phẩm cho hàng tỷ người mà còn đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nhiều quốc gia, đặc biệt là ở châu Á.

1.2. Tình hình hạn hán và ảnh hưởng đến sản xuất lúa

Hạn hán là một trong những yếu tố chính gây ảnh hưởng đến năng suất lúa. Tình trạng này không chỉ làm giảm sản lượng mà còn ảnh hưởng đến chất lượng gạo, gây ra những thiệt hại lớn cho nông dân và nền kinh tế.

II. Thách thức trong việc phát triển giống lúa chịu hạn

Việc phát triển giống lúa chịu hạn gặp nhiều thách thức, từ việc xác định các gen liên quan đến khả năng chịu hạn cho đến việc ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất. Các yếu tố như sự đa dạng di truyền, điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác đều ảnh hưởng đến quá trình này.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chịu hạn của cây lúa

Khả năng chịu hạn của cây lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm gen di truyền, điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác. Việc hiểu rõ các yếu tố này là rất quan trọng để phát triển giống lúa có khả năng chịu hạn tốt.

2.2. Sự cần thiết phải nghiên cứu nhân tố phiên mã NAC

Nhân tố phiên mã NAC đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các gen liên quan đến khả năng chịu hạn. Nghiên cứu về nhóm gen này có thể giúp phát triển giống lúa chịu hạn hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu giống lúa chuyển gen chịu hạn

Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, từ phân lập gen đến thiết kế vector chuyển gen. Các phương pháp này giúp xác định và tối ưu hóa các gen có khả năng tăng cường khả năng chịu hạn cho cây lúa.

3.1. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC

Quá trình phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC từ giống lúa Việt Nam là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các gen như OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã được xác định và phân tích để đánh giá khả năng chịu hạn.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen vào cây lúa

Thiết kế vector chuyển gen là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các vector được thiết kế để đảm bảo rằng gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC có thể được biểu hiện hiệu quả trong cây lúa.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với giống lúa không chuyển gen. Những kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong việc cải thiện năng suất lúa mà còn góp phần vào an ninh lương thực quốc gia.

4.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

Các dòng lúa chuyển gen đã được đánh giá về khả năng chịu hạn thông qua các thử nghiệm thực địa. Kết quả cho thấy chúng có khả năng sống sót và phát triển tốt hơn trong điều kiện hạn hán.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng vào sản xuất giống lúa chịu hạn, giúp nông dân cải thiện năng suất và chất lượng lúa gạo trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn bằng nhân tố phiên mã NAC mở ra nhiều triển vọng cho ngành nông nghiệp. Việc phát triển giống lúa chịu hạn không chỉ giúp tăng năng suất mà còn đảm bảo an ninh lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu giống lúa chịu hạn

Nghiên cứu giống lúa chịu hạn là cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực trong tương lai. Các giống lúa này sẽ giúp nông dân đối phó với các điều kiện thời tiết khắc nghiệt.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu và phát triển

Hướng đi tương lai cho nghiên cứu giống lúa chịu hạn cần tập trung vào việc cải thiện công nghệ chuyển gen và tăng cường khả năng chịu hạn của cây lúa thông qua các phương pháp hiện đại.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu đang làm gia tăng tần suất và mức độ trầm trọng của hạn hán, trở thành nguyên nhân chính gây suy giảm năng suất cây trồng. Trong bối cảnh dân số thế giới được dự báo đạt khoảng 9 tỷ người vào năm 2050 (hoặc lên tới 9,6 tỷ người theo ước tính mở rộng), áp lực đối với vấn đề bảo đảm an ninh lương thực ngày càng gia tăng. Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực quan trọng nhất của nhân loại, đứng thứ hai thế giới sau lúa mì về diện tích và sản lượng. Tại Việt Nam, lúa gạo chiếm trên 60% tổng sản lượng lương thực quốc gia với diện tích canh tác khoảng 3,8 triệu ha. Tuy nhiên, phần lớn diện tích này chịu tác động trực tiếp của các hiện tượng thời tiết bất lợi, đặc biệt là khô hạn. Trong khi đó, tốc độ tăng năng suất lúa có xu hướng bão hòa do suy giảm đa dạng di truyền, áp lực sâu bệnh và sự hạn chế của các phương pháp chọn giống truyền thống đối với các tính trạng đa gen phức tạp.

Tính trạng chịu hạn ở thực vật chịu sự điều hòa chặt chẽ ở mức độ phiên mã. Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã (transcription factor - TF) không trực tiếp tham gia vào cấu trúc bảo vệ nhưng đóng vai trò trung tâm trong việc điều hòa mạng lưới biểu hiện của hàng loạt gen chức năng hạ nguồn. Trong số các họ nhân tố phiên mã thực vật, họ NAC là một trong những họ lớn nhất và đặc thưng cho giới thực vật, chi phối nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa và phản ứng chống chịu stress phi sinh học. Một số gen thuộc nhóm NAC ở lúa như SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã được chứng minh có vai trò cải thiện khả năng chịu hạn. Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Phạm Thu Hằng đã thực hiện luận án tiến sĩ chuyên ngành Hóa sinh học với đề tài: "Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn".

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.
2. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn.

Để thực hiện hai mục tiêu trên, luận án triển khai bốn nội dung nghiên cứu chính:

1. Nội dung 1: Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.
2. Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dưới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin, 35S) và hoạt động cảm ứng stress (Lip9, Rd29A).
3. Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1 vào lúa.
4. Nội dung 4: Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC (OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10) liên quan đến tính chịu hạn phân lập từ giống lúa bản địa Việt Nam (giống Tẻ Đỏ); các vector biểu hiện thực vật; chủng vi khuẩn biến nạp; mô sẹo và các thế hệ cây lúa chuyển gen (T0, T1, T2).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại ba cơ sở khoa học gồm: Bộ môn Bệnh học Phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam); Phòng Thí nghiệm Việt – Pháp thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp; Phòng Thí nghiệm tương tác cây trồng – vi sinh vật thuộc Trung tâm Nghiên cứu vì sự Phát triển (IRD) tại Montpellier, Cộng hòa Pháp.
• Phạm vi thời gian: Luận án được hoàn thành và bảo vệ vào năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan, tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về cây lúa, tác động của hạn hán và cơ chế di truyền phân tử:

• Về phân loại học và sinh học cây lúa: Tác giả dẫn xuất công trình của Kato và cộng sự (1928) phân chia Oryza sativa L. thành hai loài phụ chính là indica và japonica, phản ánh sự khác biệt về hình thái, vùng sinh thái và khả năng thích nghi. Giai đoạn sinh sản được xác định là thời điểm cây lúa mẫn cảm nhất với stress hạn, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này.
• Về thiệt hại do hạn hán: Hạn hán tác động tới ít nhất 23 triệu ha lúa (chiếm 20% diện tích lúa) tại châu Á. Luận án điểm lại các đợt hạn hán lịch sử tại Ấn Độ vào các năm 1918, 1957–1958, 1965 và năm 1987 (ảnh hưởng 60% diện tích trồng trọt và 285 triệu người); thiệt hại hàng năm tại Trung Quốc giai đoạn 1978–2003 ước tính 14 triệu ha (chiếm 0,5%–3,3% GDP nông nghiệp); hạn hán năm 2004 tại Thái Lan ảnh hưởng 2 triệu ha và hơn 8 triệu người. Số liệu từ Bộ Nông nghiệp Mỹ (năm 2016) cho thấy lượng gạo tồn kho của ba nước xuất khẩu gạo hàng đầu (Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam) giảm xuống còn 19 triệu tấn. Báo cáo dự báo của FAO chỉ rõ sản lượng lúa hai vụ của Việt Nam, đặc biệt vùng đồng bằng sông Hồng, có thể suy giảm 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070 dưới tác động của hạn hán.
• Về phản ứng hình thái, sinh lý và sinh hóa: Yang và nhóm nghiên cứu (2014) ghi nhận sự suy giảm hàm lượng chlorophyll và hiệu suất lượng tử của hệ thống quang hợp quang hệ II (Fv/Fm) trong điều kiện hạn. Về cơ chế hormone, Teng và cộng sự (2014) cùng Ahmad và nhóm cộng sự (2014) đã làm rõ vai trò trung gian của Abscisic acid (ABA) trong việc điều khiển đóng khí khổng thông qua ức chế bơm proton phụ thuộc ATP, giảm thoát hơi nước và kích hoạt biểu hiện gen đáp ứng stress. Về mặt sinh hóa, Kemble và Mac-Pherson (1954) lần đầu tiên công bố hiện tượng tích lũy proline tự do ở thực vật; sau đó Iyer và cộng sự (2000) chứng minh chất trung gian P5C (pirolin-5-cacboxylat) có khả năng kích hoạt gen điều chỉnh thẩm thấu dhn4. Về cơ chế chống oxy hóa, Sharma và nhóm tác giả (2012) phân tích hai con đường tạo gốc oxy hoạt hóa (ROS), trong khi Li và nhóm nghiên cứu (2011) xác nhận phản ứng tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT, POD, APX) ở cây lúa non giúp hạn chế tổn thương tế bào.
• Về các nhóm nhân tố phiên mã đáp ứng hạn: Luận án phân tích vai trò của họ AP2/ERF (tiêu biểu là phân họ DREB với DREB1A, OsDREB2A), họ WRKY (nhận biết hộp W với trình tự lõi TTGACC/T, gồm các gen OsWRKY), họ bZIP (nhận biết các yếu tố cis như ABRE, gồm OsABF1, OsbZIP23, OsbZIP46), và họ MYB (như BcMYB1, MYB96, OsMYB3R-2, OsMYB55).
• Về nhân tố phiên mã NAC và kỹ thuật chuyển gen: Nghiên cứu của Hu và cộng sự (2006) chỉ ra việc tăng cường biểu hiện gen SNAC1 giúp cây lúa tăng tỷ lệ sống sót thêm 80% trong điều kiện hạn thông qua điều hòa hơn 150 gen chức năng. You và cộng sự (2014) chứng minh gen OsOAT là đích tác động trực tiếp của SNAC2. Luận án cũng tổng quan cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens qua vai trò của plasmid Ti, vùng T-DNA và operon vir (gồm các protein VirA, VirB, VirC, VirG, VirD1, VirD2, VirD4, VirE2). Đồng thời, tác giả khảo sát đặc tính của promoter cấu định (CaMV 35S, Ubiquitin) và promoter cảm ứng stress (Lip9, Rd29A).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen chịu hạn trước đây tập trung khai thác các gen từ giống lúa quốc tế hoặc sinh vật mô hình, chưa khai thác đầy đủ nguồn gen điều hòa bản địa từ các giống lúa địa phương của Việt Nam (như giống Tẻ Đỏ). Thêm vào đó, việc sử dụng promoter cơ định hoạt động liên tục thường dẫn đến sự tiêu tốn năng lượng không cần thiết trong điều kiện sinh trưởng bình thường. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống này bằng cách phân lập các gen NAC từ giống lúa bản địa Tẻ Đỏ, đồng thời thiết kế và so sánh song song các vector mang promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin, 35S) với promoter cảm ứng stress (Lip9, Rd29A) nhằm tìm kiếm giải pháp biểu hiện gen đích tối ưu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của đề tài dựa trên học thuyết về mạng lưới điều hòa phiên mã ở thực vật và cơ chế biến nạp gen qua trung gian vi khuẩn:

• Cấu trúc protein NAC: Gồm domain NAC bảo thủ ở đầu N (150–160 axit amin, chia thành 5 vùng từ A đến E) thực hiện chức năng liên kết đặc hiệu DNA tại trình tự nhận biết NACRS và hình thành cấu trúc dimer; đầu C chứa vùng điều hòa phiên mã (TRR) có tính biến động cao, quyết định hoạt tính hoạt hóa hoặc ức chế các gen hạ nguồn.
• Cơ chế sinh lý - sinh hóa chống chịu hạn: Giảm thoát hơi nước qua cơ chế cuốn lá; duy trì thế nước tế bào thông qua tích lũy chất điều hòa thẩm thấu (proline); hạn chế tổn thương quang hợp (bảo vệ hàm lượng chlorophyll a, b) và trung hòa các chất oxy hóa hoạt tính (ROS như $H_2O_2$) nhờ hệ enzyme bảo vệ.
• Cơ chế chuyển gen nhờ A. tumefaciens: Tín hiệu phenolic từ tế bào thực vật cảm ứng hoạt hóa hệ thống gen vir, phức hợp VirD1/VirD2 cắt sợi đơn T-DNA tại hai đầu biên (LB và RB), kết hợp với VirE2 tạo phức hệ protein-ssDNA vận chuyển qua kênh VirB/VirD4 vào nhân và tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết RNA tổng số và DNA tổng số từ lá lúa được xử lý hạn; kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng điện di gel agarose và đo mật độ quang phổ hấp thụ (OD).
  • Kỹ thuật RT-PCR và PCR để nhân bản cDNA khung đọc mở (ORF) của ba gen OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10.
  • Nhân dòng đoạn gen đích vào vector trung gian pGEM-T, biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli, sàng lọc thể biến nạp bằng chỉ thị màu X-Gal/IPTG và PCR khuẩn lạc.
  • Cắt và nối phân tử DNA bằng các enzyme giới hạn chuyên biệt (như BamHI) và enzyme T4 DNA ligase để tạo 4 cấu trúc vector biểu hiện thực vật dựa trên vector nhị phân pBI101 và pCAMBIA1301.
  • Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) dựa trên giá trị chu kỳ ngưỡng ($C_t$).
  • Xác định sự hiện diện và số lượng bản sao của gen chỉ thị kháng kháng sinh Hygromycin bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
• Phương pháp nuôi cấy mô và chuyển gen thực vật:
  • Khử trùng hạt lúa, cảm ứng tạo mô sẹo (callus) từ phôi hạt trên môi trường Murashige & Skoog (MS) bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D.
  • Biến nạp cấu trúc biểu hiện vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens, đồng nuôi cấy với mô sẹo lúa.
  • Chọn lọc mô sẹo kháng trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Hygromycin; tái sinh chồi và rễ trên môi trường MS bổ sung BAP, NAA và kinetin; thuần hóa cây T0 trong nhà lưới.
• Phương pháp đo đạc sinh lý, sinh hóa:
  • Đánh giá khả năng chịu hạn qua chỉ số độ cuốn lá dựa theo thang điểm tiêu chuẩn của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI).
  • Xác định hàm lượng nước tương đối (Relative Water Content - RWC) của mô lá.
  • Định lượng hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và diệp lục tổng số theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ bước sóng thích hợp.
  • Định lượng hàm lượng proline tự do theo phương pháp so màu với thuốc thử ninhydrin.
  • Đánh giá mức độ tích tụ hydrogen peroxide ($H_2O_2$) trong mô lá và theo dõi tỷ lệ sống sót, khả năng phục hồi của cây sau 2 tuần ngừng tưới nước hoàn toàn.
• Phương pháp thống kê: Xử lý số liệu thực nghiệm bằng các phần mềm thống kê chuyên dụng trong sinh học để so sánh sai khác giữa các nghiệm thức và đối chứng.

Nguồn tư liệu và dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm thu thập trực tiếp từ các lô thí nghiệm nuôi cấy mô, phòng phân tích phân tử và hệ thống nhà lưới theo dõi thế hệ T0, T1, T2 tại Viện Di truyền Nông nghiệp và IRD Montpellier.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 1 cung cấp cơ sở dữ liệu lý luận và thực tiễn toàn diện về đối tượng nghiên cứu:

• Đặc điểm sinh học và vị trí nông học của cây lúa Oryza sativa, sự phân hóa giữa hai phân loài indica và japonica, chu kỳ sinh trưởng từ 90 đến 180 ngày; phân tích các giai đoạn mẫn cảm, trong đó giai đoạn sinh sản chịu ảnh hưởng nặng nhất từ stress khô hạn.
• Đánh giá tác động tiêu cực của hạn hán đối với an ninh lương thực toàn cầu và Việt Nam, trích dẫn các số liệu lịch sử về diện tích bị hạn, suy giảm sản lượng và các cảnh báo suy giảm dự trữ gạo quốc tế.
• Phân tích cơ chế tác động của hạn hán lên cây lúa ở bốn mức độ:
  • Hình thái: Kìm hãm sinh trưởng chồi, kích thích rễ phát triển đâm sâu nhằm hút nước; hiện tượng cuốn lá giúp hạn chế diện tích thoát hơi nước.
  • Sinh lý: Đóng khí khổng, ức chế quá trình cố định $CO_2$, làm suy giảm hoạt tính các enzyme quang hợp (Rubisco, PEPC...), giảm tích lũy sinh khối và hàm lượng diệp lục; vai trò tín hiệu của ABA trong việc điều tiết khí khổng.
  • Sinh hóa: Tích lũy các chất hòa tan điều hòa áp suất thẩm thấu gồm proline, polyamine (putrescine, spermidine, spermine); cơ chế gây độc của các gốc oxy hóa tự do (ROS) và sự kích hoạt mạng lưới enzyme chống oxy hóa bảo vệ tế bào (SOD, CAT, POD, APX).
  • Phân tử: Con đường truyền tín hiệu nội bào qua protein kinase (MAPK, CDPK), sự kích hoạt các gen chức năng trực tiếp (protein LEA, protein sốc nhiệt HSP, protein kênh nước aquaporin) và các gen điều hòa phiên mã cấp cao.
• Hệ thống hóa cấu trúc phân tử và chức năng của họ nhân tố phiên mã NAC: Mô tả chi tiết 5 subdomain (A, B, C, D, E) của domain NAC ở đầu N và cấu trúc dimer hóa; chức năng vùng điều hòa phiên mã TRR ở đầu C; vai trò của các protein NAC liên kết màng (NTL).
• Tổng kết cơ chế phân tử chuyển gen qua vi khuẩn A. tumefaciens: Cấu tạo plasmid Ti, chức năng sinh học của 24 gen vùng vir, trình tự biên trái (LB) và biên phải (RB); nguyên lý thiết kế hệ thống vector nhị phân (binary vector) và vector liên hợp (co-integrative vector); cơ chế vận hành của các nhóm promoter thực vật (promoter cấu định CaMV 35S, Ubiquitin; promoter cảm ứng hạn Rd29A, Lip9).
• Khảo cứu hiện trạng nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, chủng vi sinh vật và các bước kỹ thuật:

• Vật liệu nghiên cứu: Giống lúa Tẻ Đỏ bản địa Việt Nam; chủng vi khuẩn E. coli DH5$\alpha$; chủng vi khuẩn A. tumefaciens (EHA105); các vector nhân dòng pGEM-T; các vector biểu hiện pBI101, pCAMBIA1301 mang các promoter Ubiquitin, CaMV 35S, Lip9, Rd29A; danh mục các cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu (Bảng 2.1).
• Quy trình phân lập gen: Xử lý mẫu mầm lúa trong điều kiện hạn nhân tạo; tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất bảo vệ DEPC; tổng hợp cDNA sợi một và nhân bản đoạn gen đích OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 bằng phản ứng RT-PCR; tinh sạch sản phẩm PCR và gắn vào vector pGEM-T.
• Thiết kế 4 cấu trúc vector biểu hiện thực vật mang gen OsNAC1:
  • Vector biểu hiện liên tục: pBI-35S/OsNAC1 và pBI-Ubi/OsNAC1.
  • Vector biểu hiện cảm ứng stress: pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM-Lip9/OsNAC1.
• Kỹ thuật chuyển gen vào mô sẹo lúa thông qua A. tumefaciens: Quá trình tạo mô sẹo từ phôi hạt lúa chín, lây nhiễm với dịch khuẩn, đồng nuôi cấy trong bóng tối, khử trùng vi khuẩn bằng kháng sinh Cefotaxime, chọn lọc mô sẹo chuyển gen trên môi trường bổ sung Hygromycin (chỉ tiêu Bảng 3.2).
• Phương pháp sàng lọc và theo dõi di truyền: Kiểm tra sự hiện diện của gen đích OsNAC1 và gen chọn lọc Hygromycin bằng PCR trên các thế hệ cây tái sinh T0, T1, T2; xác định số lượng bản sao chèn đoạn bằng kỹ thuật sinh học phân tử; định lượng mức độ biểu hiện gen đích dưới điều kiện bình thường và hạn bằng qRT-PCR.
• Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu sinh lý - hóa sinh: Đánh giá độ cuốn lá theo thang điểm chuẩn IRRI (Bảng 2.2); xác định RWC; đo quang phổ hấp thụ diệp lục a, b và tổng số; xác định nồng độ proline tự do bằng thuốc thử ninhydrin; nhuộm phát hiện tích tụ chất oxy hóa $H_2O_2$ trong mô lá; theo dõi tỷ lệ sống và phục hồi sau 14 ngày xử lý hạn.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được kèm theo thảo luận học thuật:

• Khảo sát khả năng chịu hạn của các giống lúa Việt Nam: Đánh giá tập đoàn giống lúa và chọn lọc được giống lúa Tẻ Đỏ thể hiện khả năng chống chịu điều kiện khô hạn tốt nhất (Bảng 3.1).
• Phân lập và giải trình tự gen: Tác giả nhân bản thành công 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa Tẻ Đỏ. Kết quả giải trình tự và phân tích dịch mã suy diễn cho thấy các chuỗi axit amin đều mang đầy đủ domain NAC bảo thủ đặc trưng (Hình 3.6).
• Đánh giá biểu hiện gen trong điều kiện hạn: Kết quả phân tích qRT-PCR cho thấy cả 3 gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đều được cảm ứng tăng cường biểu hiện rõ rệt khi cây lúa gặp điều kiện hạn hán (Hình 3.7). Gen OsNAC1 được lựa chọn để tiến hành các bước thiết kế vector chuyển gen tiếp theo.
• Thiết kế thành công các vector biểu hiện thực vật: Kiểm tra thể biến nạp bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc và cắt bằng enzyme giới hạn xác nhận đã tái tổ hợp thành công 4 cấu trúc vector: pBI-35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1, pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM-Lip9/OsNAC1 (Hình 3.8 đến 3.14).
• Nghiên cứu chuyển gen và sàng lọc thế hệ T0: Biến nạp các vector vào A. tumefaciens và tiến hành lây nhiễm mô sẹo giống lúa nghiên cứu. Kết quả sàng lọc các dòng lúa tái sinh T0 bằng PCR xác nhận sự có mặt của gen đích và gen chỉ thị chọn lọc (Bảng 3.3). Phân tích số lượng bản sao xác định được các dòng mang 1 bản sao gen chèn vào hệ gen (Bảng 3.4). Các cây lúa T0 sinh trưởng phát triển bình thường trong nhà lưới (Bảng 3.5).
• Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T1 và T2: Tiếp tục sàng lọc và nhân dòng các thế hệ T1 (Bảng 3.6, Bảng 3.7). Luận án đã chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen T2 đồng hợp tử mang 1 bản sao của gen OsNAC1 điều khiển bởi promoter Ubiquitin (Ubi:OsNAC1) và promoter cảm ứng Lip9 (Lip9:OsNAC1) (Hình 3.17, 3.18).
• Đánh giá khả năng sinh trưởng và chống chịu hạn của dòng chuyển gen T2:
  • Trong điều kiện cấp nước bình thường: Các dòng chuyển gen T2 sinh trưởng, phát triển, đẻ nhánh và cho các chỉ tiêu hình thái, năng suất tương đồng với dòng đối chứng không chuyển gen (Hình 3.19).
  • Trong điều kiện xử lý hạn: Các dòng chuyển gen thể hiện khả năng chịu hạn vượt trội so với đối chứng không chuyển gen qua các chỉ tiêu định lượng (Bảng 3.8 đến Bảng 3.14):
    • Độ cuốn lá: Các dòng chuyển gen có điểm số cuốn lá thấp hơn, duy trì sức trương tế bào lá tốt hơn sau 2 tuần hạn (Hình 3.20).
    • Hàm lượng nước tương đối (RWC): Các dòng chuyển gen duy trì giá trị RWC trong mô lá cao hơn rõ rệt so với đối chứng.
    • Hàm lượng diệp lục: Sự suy giảm hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và diệp lục tổng số ở các dòng chuyển gen diễn ra chậm hơn và giữ mức cao hơn đối chứng (Bảng 3.10, 3.11, 3.12).
    • Hàm lượng proline: Tích lũy proline tự do ở các dòng chuyển gen tăng cao rõ rệt dưới tác động của hạn (Bảng 3.13).
    • Tích tụ $H_2O_2$ và khả năng phục hồi: Mức độ tích tụ $H_2O_2$ gây hại tế bào ở mô lá dòng chuyển gen thấp hơn đối chứng (Hình 3.21); sau khi tưới nước trở lại, tỷ lệ phục hồi và tái sinh trưởng của các dòng chuyển gen cao hơn có ý nghĩa so với dòng đối chứng (Hình 3.22, Bảng 3.14).

Bảng tổng hợp các chỉ tiêu đánh giá sinh lý, sinh hóa và khả năng chống chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen theo danh mục bảng của luận án:

STT danh mục	Tên bảng số liệu trong luận án	Nội dung số liệu / Phương pháp đánh giá
Bảng 3.1	Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam	Khảo sát tập đoàn giống bản địa, xác định kiểu hình giống Tẻ Đỏ
Bảng 3.2	Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens	Tỷ lệ mô sẹo nhiễm khuẩn, tỷ lệ tạo mô kháng Hygromycin
Bảng 3.3	Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh được chuyển gen OsNAC1	Phân tích PCR kiểm tra gen đích và gen chọn lọc ở thế hệ T0
Bảng 3.4	Kết quả xác định số lượng bản sao gen kháng Hygromycin trong cây lúa chuyển gen T0	Phân tích số bản sao T-DNA chèn vào hệ gen lúa
Bảng 3.5	Kết quả sinh trưởng của cây lúa chuyển gen T0 trong nhà lưới	Chiều cao cây, số nhánh, khả năng trổ bông ở điều kiện thường
Bảng 3.6	Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1	Tỷ lệ phân ly kiểu gen và kiểm tra PCR ở thế hệ T1
Bảng 3.7	Kết quả sinh trưởng của các cây lúa chuyển gen đời T1	Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học ở thế hệ T1
Bảng 3.8	Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen dựa trên độ cuốn lá	Chấm điểm độ cuốn lá theo thang điểm chuẩn IRRI
Bảng 3.9	Kết quả xác định hàm lượng nước tương đối trong dòng lúa chuyển gen	Định lượng RWC ở mô lá trước và sau xử lý hạn
Bảng 3.10	Hàm lượng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyển gen	Đo quang phổ hấp thụ của diệp lục a trong điều kiện hạn
Bảng 3.11	Hàm lượng chất diệp lục b trong các dòng lúa chuyển gen	Đo quang phổ hấp thụ của diệp lục b trong điều kiện hạn
Bảng 3.12	Hàm lượng chất diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyển gen	Tổng hợp lượng sắc tố quang hợp toàn phần
Bảng 3.13	Hàm lượng proline trong các dòng lúa	Đo nồng độ proline tự do qua phản ứng tạo màu ninhydrin
Bảng 3.14	Kết quả so sánh tương quan khả năng chịu hạn của các dòng lúa	Đánh giá tổng hợp tỷ lệ sống sót và phục hồi sau hạn

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

1. Luận án đã phân lập thành công ba gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ nguồn gen giống lúa bản địa Tẻ Đỏ của Việt Nam, xác định trình tự nucleotide và chứng minh mức độ cảm ứng phiên mã mạnh mẽ của các gen này dưới tác động của stress hạn.
2. Thiết kế hoàn chỉnh hệ thống các vector biểu hiện thực vật mang gen OsNAC1 dưới sự điều khiển của hai nhóm promoter: promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin, 35S) và promoter cảm ứng điều kiện stress (Lip9, Rd29A).
3. Chứng minh việc biểu hiện gen OsNAC1 giúp tăng cường khả năng chống chịu hạn của cây lúa thông qua cơ chế tổng hợp: duy trì thế nước và hàm lượng nước tương đối (RWC), bảo vệ hệ sắc tố quang hợp (diệp lục a, b), tăng cường tích lũy proline để điều hòa thẩm thấu và giảm thiểu mức độ tích tụ gốc oxy hóa tự do $H_2O_2$.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng:

1. Tạo ra các dòng lúa chuyển gen thế hệ T2 mang một bản sao của gen OsNAC1 ở trạng thái đồng hợp tử điều khiển bởi promoter cảm ứng stress Lip9 và promoter liên tục Ubiquitin. Các dòng chuyển gen này có kiểu hình sinh trưởng, phát triển và năng suất tương đồng với dòng đối chứng không chuyển gen trong điều kiện bình thường, đồng thời có tỷ lệ sống sót và khả năng phục hồi vượt trội trong điều kiện khô hạn.
2. Các cấu trúc vector biểu hiện gen OsNAC1 do luận án thiết kế tạo nguồn vật liệu di truyền phục vụ việc tiếp tục thử nghiệm chuyển gen vào các giống cây trồng cạn kinh tế khác như ngô, bông, đậu tương nhằm thích ứng với điều kiện biến đổi khí hậu tại Việt Nam.

Kiến nghị và đề xuất giải pháp:

• Tiếp tục theo dõi, đánh giá tính ổn định di truyền của gen chuyển và các chỉ tiêu năng suất của các dòng lúa T2 mang cấu trúc Ubi:OsNAC1 và Lip9:OsNAC1 ở các thế hệ tiếp theo (T3, T4).
• Ứng dụng các vector biểu hiện đã tạo ra để chuyển nạp vào các đối tượng cây trồng cạn có nhu cầu chịu hạn cao như ngô và đậu tương.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Các thử nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng và tính chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen T2 mới được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và hệ thống chậu vại trong nhà lưới có kiểm soát, chưa tiến hành khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng trong điều kiện canh tác tự nhiên và các vùng sinh thái khô hạn khác nhau.
• Trong ba gen NAC được phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ (OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10), nghiên cứu chỉ tập trung thiết kế vector và đánh giá chức năng chuyển gen đối với gen OsNAC1; hai gen OsNAC5 và OsNAC10 chưa được đưa vào thử nghiệm chuyển gen đồng thời để so sánh hiệu quả.
• Nghiên cứu chưa đi sâu giải trình tự toàn bộ hệ transcriptome nhằm nhận diện đầy đủ danh mục các gen chức năng hạ nguồn chịu sự chi phối trực tiếp của nhân tố phiên mã OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Đưa các dòng lúa chuyển gen T2 có triển vọng khảo nghiệm tính ổn định và khả năng chống chịu ở các thế hệ sau (T3, T4) ngoài đồng ruộng.
• Tiếp tục sử dụng hệ thống vector biểu hiện đã hoàn thiện để biến nạp gen OsNAC1 vào các cây trồng khác như ngô, bông, đậu tương theo định hướng ứng dụng thực tế.
• Khảo sát chức năng và thiết kế vector chuyển gen đối với hai gen còn lại là OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa bản địa Tẻ Đỏ.

Giá trị tham khảo

Giá trị đối với các đối tượng học thuật và ứng dụng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Hóa sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học và Công nghệ sinh học nông nghiệp có thể sử dụng luận án làm tài liệu tham khảo chuyên khảo về quy trình phân lập gen, thiết kế vector biểu hiện thực vật và kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens.
• Các nhà khoa học và cán bộ nghiên cứu tại các viện chọn tạo giống cây trồng có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa promoter cảm ứng stress (Lip9) và gen điều hòa phiên mã để nâng cao tính chống chịu mà không làm suy giảm năng suất sinh học của cây.
• Các nhà quản lý nông nghiệp và chuyên gia chính sách có thể tham khảo luận án như một minh chứng khoa học thực nghiệm về tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học trong tái thiết cơ cấu giống cây trồng ứng phó với biến đổi khí hậu.

Các phần nội dung đáng tham khảo nhất trong văn bản:

• Chương 1: Phần tổng hợp hệ thống mạng lưới nhân tố phiên mã thực vật (AP2/ERF, WRKY, bZIP, MYB, NAC) và cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen qua plasmid Ti.
• Chương 2: Các quy trình thực nghiệm chi tiết về thiết kế vector nhị phân, quy trình nuôi cấy mô sẹo và tái sinh lúa chuyển gen, thang điểm đánh giá độ cuốn lá IRRI và các phương pháp định lượng RWC, proline, diệp lục.
• Chương 3: Dữ liệu thực nghiệm so sánh tính tương quan giữa các chỉ số sinh lý, sinh hóa và mức độ tích tụ chất oxy hóa $H_2O_2$ giữa dòng chuyển gen và dòng đối chứng.

Câu hỏi thường gặp

1. Giống lúa nào của Việt Nam được tác giả lựa chọn để phân lập các gen NAC và những gen cụ thể nào đã được nhân dòng?

Tác giả đã khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam và lựa chọn giống lúa bản địa Tẻ Đỏ. Từ giống lúa này, ba gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn đã được phân lập thành công gồm: OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10.

2. Luận án đã thiết kế gen OsNAC1 dưới sự kiểm soát của những promoter nào?

Tác giả đã thiết kế bốn cấu trúc vector biểu hiện thực vật mang gen OsNAC1 thuộc hai nhóm promoter:

• Nhóm promoter hoạt động liên tục (constitutive promoter): promoter CaMV 35S (trong vector pBI-35S/OsNAC1) và promoter Ubiquitin (trong vector pBI-Ubi/OsNAC1).
• Nhóm promoter cảm ứng stress (inducible promoter): promoter Lip9 (trong vector pCAM-Lip9/OsNAC1) và promoter Rd29A (trong vector pCAM-Rd29A/OsNAC1).

3. Phương pháp nào được sử dụng để chuyển cấu trúc gen vào cây lúa?

Luận án sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens (chủng EHA105) mang hệ thống vector nhị phân. Vật liệu nhận gen là mô sẹo (callus) được cảm ứng và phát sinh từ phôi hạt lúa chín, sau đó trải qua quá trình chọn lọc bằng kháng sinh Hygromycin và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

4. Các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa nào được tác giả sử dụng để chứng minh khả năng chịu hạn của dòng lúa chuyển gen?

Khả năng chịu hạn được đánh giá qua các chỉ tiêu định lượng:

• Điểm đánh giá độ cuốn lá theo thang đo chuẩn của IRRI.
• Hàm lượng nước tương đối (RWC) trong mô lá.
• Hàm lượng các sắc tố quang hợp: diệp lục a, diệp lục b và diệp lục tổng số.
• Nồng độ tích lũy proline tự do (chất điều hòa thẩm thấu).
• Mức độ tích tụ hydrogen peroxide ($H_2O_2$) trong mô lá và tỷ lệ cây phục hồi sau 14 ngày xử lý hạn.

5. Dòng lúa chuyển gen thế hệ T2 biểu hiện các đặc tính sinh trưởng và chịu hạn như thế nào so với dòng đối chứng không chuyển gen?

Trong điều kiện bình thường, cây chuyển gen T2 mang cấu trúc Ubi:OsNAC1 và Lip9:OsNAC1 có các chỉ tiêu sinh trưởng (chiều cao, khả năng đẻ nhánh) và năng suất hạt tương đương cây đối chứng không chuyển gen. Trong điều kiện khô hạn, cây chuyển gen có độ cuốn lá thấp hơn, hàm lượng nước tương đối cao hơn, hàm lượng diệp lục ít bị suy giảm hơn, tích lũy proline cao hơn, tích tụ $H_2O_2$ thấp hơn và tỷ lệ phục hồi sau hạn cao hơn dòng đối chứng.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thu Hằng đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu phân lập ba gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC (OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10) từ giống lúa bản địa Tẻ Đỏ của Việt Nam và xác nhận tính cảm ứng mạnh mẽ của các gen này dưới tác động của stress hạn. Nghiên cứu đã thiết kế thành công các hệ thống vector biểu hiện thực vật mang gen OsNAC1 dưới sự điều khiển của cả promoter cấu định (Ubiquitin, 35S) và promoter cảm ứng stress (Lip9, Rd29A), đồng thời chuyển nạp thành công vào hệ gen cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các dòng lúa chuyển gen thế hệ T2 đồng hợp tử mang một bản sao gen đích đã thể hiện khả năng duy trì sinh trưởng ổn định trong điều kiện bình thường và nâng cao rõ rệt các chỉ số sinh lý, sinh hóa chống chịu stress khi gặp hạn. Kết quả thực nghiệm của luận án cung cấp nguồn vật liệu di truyền và cơ sở khoa học phục vụ công tác chọn tạo các giống cây trồng chuyển gen thích ứng với điều kiện khô hạn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Dƣới tác động của iến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng c y trồng. Trong khi đó, d n số toàn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 2050 sẽ tăng lên 9 tỷ ngƣời, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm ảo lƣơng thực. Vì vậy, an ninh lƣơng thực là vấn đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.) là một trong a loại c y lƣơng thực quan trọng nhất của con ngƣời. Trên thế giới, c y lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ 2 sau c y lúa mì về diện tích và sản lƣợng.

Ở Việt Nam, cây lúa có vai trò đặc iệt quan trọng, chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia 60% và đƣợc canh tác với diện tích lớn nhất xấp xỉ 3,8 triệu ha. Tuy nhiên, hầu hết diện tích trồng lúa đang đƣợc canh tác trong môi trƣờng ấp ênh, rất dễ ị tác động ởi các yếu tố thời tiết cực đoan, đặc iệt là hạn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu ph n lập và đặc tính các gen đáp ứng hạn, tiến tới tạo dòng/giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện ất lợi ngoại cảnh hạn có ý nghĩa quan trọng đặc iệt trong việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tƣợng bão hòa trong những năm gần đ y chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đa dạng di truyền các giống lúa và sự xuất hiện ngày càng nhiều côn trùng, dịch bệnh và bất lợi ngoại cảnh.

Trong xu thế đô thị hóa đang diễn ra mọi nơi, nếu chỉ sử dụng các phƣơng pháp truyền thống trong việc tăng năng suất lúa thì sản lƣợng lúa gạo của Việt Nam không thể đáp ứng đƣợc tốc độ tăng d n số và nhu cầu xuất khẩu. Do đó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp giữa phƣơng pháp truyền thống và công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa mang các tính trạng quý nhƣ chống chịu hạn, 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mặn… Trong khi các phƣơng pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yếu để duy trì sự ổn định thì các phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hiện thực hóa ƣớc nhảy vọt trong chọn tạo giống lúa. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự iểu hiện của mỗi gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã đang là trọng t m trong các nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen.

Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã mặc d không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự iểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa iểu hiện của rất nhiều gen chức năng tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh c y lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với c y không chuyển gen. Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã NAC là họ nh n tố phiên mã lớn nhất và đặc trƣng của thực vật. Nh n tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế ào, ao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế ào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh của tế ào.

Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có liên quan tới quá trình đáp ứng hạn và c y lúa chuyển các gen tăng khả năng chịu hạn và năng suất cao hơn so với c y không chuyển gen trong điều kiện hạn. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu tạo ra các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không g y ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển. Các kết quả thu đƣợc sẽ là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu Ph n lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.

Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn. Đối tƣ ng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án: Các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam. ác n i ung nghiên cứu ch nh  Nội dung 1: Ph n lập các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam;  Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc iểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục Ubiquitine, 35S và hoạt động cảm ứng stress (Lip9, Rd29A).  Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã OsNAC1 vào lúa.

 Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen. Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Ph n tử, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm Việt – Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm tƣơng tác c y trồng - vi sinh vật thuộc Trung t m nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp. Đóng góp mới của luận án Luận án đã ph n lập đƣợc 3 gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa ản địa Việt Nam lúa Tẻ Đỏ. Luận án đã tạo đƣợc các hệ vector iểu hiện trong tế ào thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển ởi promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và 35S) và promoter 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hoạt động cảm ứng stress (Lip9 và Rd29A.

Luận án đã tạo đƣợc một số dòng lúa chuyển gen iểu hiện gen đích, sinh trƣởng ình thƣờng trong điều kiện không xử lý hạn và có khả năng chịu hạn tốt hơn c y đối chứng không chuyển gen. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng lúa T2 mang một ản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp iểu hiện dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và promoter hoạt động liên tục Ubiquitin. C y chuyển gen có kiểu hình tƣơng đồng với c y đối chứng không chuyển gen về khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất trong điều kiện ình thƣờng không có stress hạn, trong khi khả năng chịu hạn và tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý stress hạn. Đ y là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung trong công tác tạo giống c y chuyển gen chịu hạn.

Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector iểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống c y trồng quan trọng nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo ra các giống c y chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza.

Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới, trong đó có 23 loài hoang dã và 2 loài lúa trồng (O. Loài Oryza sativa L. (2n = 24 đƣợc trồng phổ biến trên thế giới, tập trung chủ yếu ởcác quốc gia châu Á. Dựa vào đặc điểm hình thái, Kato và cộng sự 1928 đã đề nghị phân chia lúa Oryza sativa L.

thành 2 loài phụ là Oryza sativa L. indica (lúa Indica) và Oryza sativa L. Lúa Indica thƣờng phân bố ở vĩ độ thấp nhƣ Ấn Độ, Việt Nam, Indonexia… cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô, nở nhiều,… Lúa Japonica thƣờng phân bố ở vĩ độ cao nhƣ: Nhật Bản, Bắc Trung Quốc, ch u Âu… cây thấp, lá to xanh đậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm dẻo, ít nở…[28]. Lúa có kiểu hình đa dạng, đƣợc trồng ở cả hệ sinh thái vùng cao và vùng thấp.

Tuy nhiên, khoảng 76% sản lƣợng gạo toàn cầu đƣợc sản xuất từ lúa nƣớc ở hệ sinh thái v ng đất trũng. Tiềm năng năng suất lúa đƣợc hình thành/xác định trong giai đoạn sinh dƣỡng. Chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh liên quan đến số lƣợng bông), sự phát triển của rễ, diện tích lá là những đặc điểm chính của giai đoạn sinh trƣởng. Kích thƣớc và hình thái ông đƣợc quyết định trong giai đoạn sinh sản, trong khi kích thƣớc hoặc khối lƣợng của hạt đƣợc quyết định trong giai đoạn chín.

Giai đoạn sinh sản đƣợc xác định là giai đoạn cây lúa nhạy cảm nhất với stress sinh học và phi sinh học, ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này [71]. Thời gian sinh trƣởng của c y lúa đƣợc tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chín, dao động từ 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh. Trong canh 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tác lúa hiện đại, thời gian sinh trƣởng của các giống lúa đƣợc các nhà nông học quan tâm đặc biệt do liên quan trực tiếp đến năng suất và cơ cấu thời vụ, luân canh. Giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn hoặc quá dài có năng suất thấp do sinh trƣởng dinh dƣỡng bị hạn chế đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn), dễ bị lốp đổ và chịu nhiều tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá dài).