Đặt vấn đề Dƣới tác động của iến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng c y trồng. Trong khi đó, d n số toàn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 2050 sẽ tăng lên 9 tỷ ngƣời, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm ảo lƣơng thực. Vì vậy, an ninh lƣơng thực là vấn đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.) là một trong a loại c y lƣơng thực quan trọng nhất của con ngƣời. Trên thế giới, c y lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ 2 sau c y lúa mì về diện tích và sản lƣợng.
Ở Việt Nam, cây lúa có vai trò đặc iệt quan trọng, chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia 60% và đƣợc canh tác với diện tích lớn nhất xấp xỉ 3,8 triệu ha. Tuy nhiên, hầu hết diện tích trồng lúa đang đƣợc canh tác trong môi trƣờng ấp ênh, rất dễ ị tác động ởi các yếu tố thời tiết cực đoan, đặc iệt là hạn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu ph n lập và đặc tính các gen đáp ứng hạn, tiến tới tạo dòng/giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện ất lợi ngoại cảnh hạn có ý nghĩa quan trọng đặc iệt trong việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tƣợng bão hòa trong những năm gần đ y chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đa dạng di truyền các giống lúa và sự xuất hiện ngày càng nhiều côn trùng, dịch bệnh và bất lợi ngoại cảnh.
Trong xu thế đô thị hóa đang diễn ra mọi nơi, nếu chỉ sử dụng các phƣơng pháp truyền thống trong việc tăng năng suất lúa thì sản lƣợng lúa gạo của Việt Nam không thể đáp ứng đƣợc tốc độ tăng d n số và nhu cầu xuất khẩu. Do đó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp giữa phƣơng pháp truyền thống và công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa mang các tính trạng quý nhƣ chống chịu hạn, 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mặn… Trong khi các phƣơng pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yếu để duy trì sự ổn định thì các phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hiện thực hóa ƣớc nhảy vọt trong chọn tạo giống lúa. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự iểu hiện của mỗi gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã đang là trọng t m trong các nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen.
Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã mặc d không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự iểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa iểu hiện của rất nhiều gen chức năng tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh c y lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với c y không chuyển gen. Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã NAC là họ nh n tố phiên mã lớn nhất và đặc trƣng của thực vật. Nh n tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế ào, ao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế ào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh của tế ào.
Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có liên quan tới quá trình đáp ứng hạn và c y lúa chuyển các gen tăng khả năng chịu hạn và năng suất cao hơn so với c y không chuyển gen trong điều kiện hạn. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu tạo ra các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không g y ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển. Các kết quả thu đƣợc sẽ là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu Ph n lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.
Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn. Đối tƣ ng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án: Các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam. ác n i ung nghiên cứu ch nh Nội dung 1: Ph n lập các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam; Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc iểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục Ubiquitine, 35S và hoạt động cảm ứng stress (Lip9, Rd29A). Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã OsNAC1 vào lúa.
Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen. Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Ph n tử, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm Việt – Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm tƣơng tác c y trồng - vi sinh vật thuộc Trung t m nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp. Đóng góp mới của luận án Luận án đã ph n lập đƣợc 3 gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa ản địa Việt Nam lúa Tẻ Đỏ. Luận án đã tạo đƣợc các hệ vector iểu hiện trong tế ào thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển ởi promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và 35S) và promoter 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hoạt động cảm ứng stress (Lip9 và Rd29A.
Luận án đã tạo đƣợc một số dòng lúa chuyển gen iểu hiện gen đích, sinh trƣởng ình thƣờng trong điều kiện không xử lý hạn và có khả năng chịu hạn tốt hơn c y đối chứng không chuyển gen. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng lúa T2 mang một ản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp iểu hiện dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và promoter hoạt động liên tục Ubiquitin. C y chuyển gen có kiểu hình tƣơng đồng với c y đối chứng không chuyển gen về khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất trong điều kiện ình thƣờng không có stress hạn, trong khi khả năng chịu hạn và tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý stress hạn. Đ y là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung trong công tác tạo giống c y chuyển gen chịu hạn.
Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector iểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống c y trồng quan trọng nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo ra các giống c y chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza.
Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới, trong đó có 23 loài hoang dã và 2 loài lúa trồng (O. Loài Oryza sativa L. (2n = 24 đƣợc trồng phổ biến trên thế giới, tập trung chủ yếu ởcác quốc gia châu Á. Dựa vào đặc điểm hình thái, Kato và cộng sự 1928 đã đề nghị phân chia lúa Oryza sativa L.
thành 2 loài phụ là Oryza sativa L. indica (lúa Indica) và Oryza sativa L. Lúa Indica thƣờng phân bố ở vĩ độ thấp nhƣ Ấn Độ, Việt Nam, Indonexia… cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô, nở nhiều,… Lúa Japonica thƣờng phân bố ở vĩ độ cao nhƣ: Nhật Bản, Bắc Trung Quốc, ch u Âu… cây thấp, lá to xanh đậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm dẻo, ít nở…[28]. Lúa có kiểu hình đa dạng, đƣợc trồng ở cả hệ sinh thái vùng cao và vùng thấp.
Tuy nhiên, khoảng 76% sản lƣợng gạo toàn cầu đƣợc sản xuất từ lúa nƣớc ở hệ sinh thái v ng đất trũng. Tiềm năng năng suất lúa đƣợc hình thành/xác định trong giai đoạn sinh dƣỡng. Chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh liên quan đến số lƣợng bông), sự phát triển của rễ, diện tích lá là những đặc điểm chính của giai đoạn sinh trƣởng. Kích thƣớc và hình thái ông đƣợc quyết định trong giai đoạn sinh sản, trong khi kích thƣớc hoặc khối lƣợng của hạt đƣợc quyết định trong giai đoạn chín.
Giai đoạn sinh sản đƣợc xác định là giai đoạn cây lúa nhạy cảm nhất với stress sinh học và phi sinh học, ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này [71]. Thời gian sinh trƣởng của c y lúa đƣợc tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chín, dao động từ 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh. Trong canh 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tác lúa hiện đại, thời gian sinh trƣởng của các giống lúa đƣợc các nhà nông học quan tâm đặc biệt do liên quan trực tiếp đến năng suất và cơ cấu thời vụ, luân canh. Giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn hoặc quá dài có năng suất thấp do sinh trƣởng dinh dƣỡng bị hạn chế đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn), dễ bị lốp đổ và chịu nhiều tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá dài).