Giới thiệu dự án
Bối cảnh và cơ sở thực tiễn
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu hoặc thứ hai tại 112 trên tổng số 183 quốc gia ở nhóm đối tượng dưới 70 tuổi. Mặc dù các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị và phẫu thuật đã mang lại những bước tiến nhất định, tỷ lệ tái phát và kháng thuốc vẫn ở mức đáng báo động. Trong thập kỷ qua, liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư (Cancer Immunotherapy) đã tạo nên cuộc cách mạng mới, tiêu biểu là các kháng thể đơn dòng ức chế chốt kiểm soát miễn dịch như PD-1/PD-L1 và CTLA-4. Tuy nhiên, tỷ lệ đáp ứng đơn trị liệu của các kháng thể này chỉ dao động trong khoảng 20–30% do sự hiện diện của các cơ chế dung nạp miễn dịch thích ứng trong vi môi trường khối u (Tumor Microenvironment - TME).
Enzym Indoleamin-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) nổi lên như một đích phân tử điều hòa miễn dịch then chốt. IDO1 là enzym nội bào chứa nhân hem, xúc tác cho phản ứng mở vòng pyrol của L-tryptophan (L-Trp) để tạo thành N-formylkynurenin – bước đầu tiên và giới hạn tốc độ trong con đường kynurenin. Khoảng 50% các khối u ác tính ở người biểu hiện quá mức IDO1, dẫn đến hai hệ quả sinh học:
- Cạn kiệt L-Tryptophan tại chỗ: Làm tích tụ tARN không tải, kích hoạt kinase GCN2 (General control nonderepressible 2) và ức chế phức hợp mTOR, dẫn đến đình trệ chu kỳ tế bào T ở pha G1 và kích hoạt quá trình tự thực (autophagy)/apoptosis.
- Tích lũy các chất chuyển hóa Kynurenin (Kyn): Kynurenin liên kết trực tiếp với thụ thể Aryl hydrocarbon (AhR), thúc đẩy sự biệt hóa tế bào T ngây thơ thành tế bào T điều hòa ($CD4^+CD25^+FoxP3^+$ Treg) và ức chế chức năng tiêu diệt khối u của tế bào T gây độc ($CD8^+$ CTL) cùng tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer - NK).
[Khối u biểu hiện IDO1]
│
├──> Giáng hóa L-Trp ──> Cạn kiệt L-Trp ──> Kích hoạt GCN2 / Ức chế mTOR ──> Tế bào T ngừng tăng sinh
│
└──> Sản sinh Kynurenin ──> Kích hoạt AhR ──> Biệt hóa FoxP3+ Treg ──> Ức chế miễn dịch kháng u
Vấn đề nghiên cứu cụ thể (Problem Statement)
Các chất ức chế IDO1 phân tử nhỏ thế hệ đầu như 1-Methyltryptophan (1-MT/Indoximod) có hoạt tính ức chế enzym trực tiếp tương đối yếu ($IC_{50} > 10\ \mu\text{M}$), trong khi các dẫn chất thuộc nhóm N-hydroxyamidin như Epacadostat (INCB024360) dù có hoạt tính in vitro cao ($IC_{50} = 73\ \text{nM}$) nhưng lại gặp thất bại trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III (ECHO-301) do đặc tính dược động học chưa tối ưu và độ chọn lọc mô. Do đó, nhu cầu thiết kế các khung cấu trúc phân tử mới, có khả năng dung nạp tốt, dễ tổng hợp và có ái lực cao với trung tâm hoạt động của IDO1 là một nhiệm vụ cấp thiết trong Hóa dược hiện đại.
Mục tiêu dự án
- Thiết kế và tổng hợp thành công 4 dẫn chất acetamid mới mang khung 6-amino-1H-indazol ($V_a, V_b, V_c, V_d$) qua quy trình tổng hợp 4 giai đoạn.
- Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất bằng các phương pháp phổ hiện đại (IR, HR-MS, $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$).
- Đánh giá hoạt tính ức chế enzym IDO1 tái tổ hợp người in vitro của các dẫn chất tổng hợp được ở nồng độ $1{,}0\ \text{mM}$ bằng phương pháp huỳnh quang so sánh với chất chuẩn dương IDO5L.
Giải pháp và tính hợp lý về mặt hóa học
Khung Indazol là đồng phân sinh học (bioisostere) đẳng diện tử của Indol (nhân cơ bản của L-Trp), có tính ổn định chuyển hóa cao và hoạt tính kháng u đa dạng. Cấu trúc tinh thể phức hợp IDO1 với 4-phenylimidazol (PDB: 2DOT) cho thấy trung tâm hoạt động gồm hai túi kỵ nước: Pocket A (vị trí phối trí với $Fe^{2+}/Fe^{3+}$ của nhân hem) và Pocket B (lối vào kênh cơ chất, tạo tương tác với $\text{Phe226}$ và $\text{Arg231}$). Việc gắn khung 6-amino-1H-indazol vào đầu Pocket A kết hợp với vòng phenyl mang các nhóm thế halogen ($3\text{-Cl}, 4\text{-Cl}, 3\text{-F}, 4\text{-F}$) hướng vào Pocket B thông qua cầu nối acetamid ($-\text{CH}_2\text{-CO-NH}-$) tạo ra các tương tác liên kết hydro và tương tác $\pi$-$\pi$ tối ưu.
Kết quả kỳ vọng và Phạm vi nghiên cứu
- Kết quả kỳ vọng: Hiệu suất tổng hợp mỗi bước đạt $>65%$, hiệu suất toàn phần $>30%$, độ tinh khiết $>98%$; tìm ra ít nhất 01 dẫn chất có hoạt tính ức chế IDO1 tương đương hoặc tiệm cận chất chuẩn IDO5L ($\ge 90%$).
- Phạm vi nghiên cứu: Tổng hợp hóa dược quy mô phòng thí nghiệm ($0{,}3\ \text{mmol} - 20\ \text{mmol}$); đánh giá hoạt tính sinh học in vitro sử dụng enzym IDO1 tái tổ hợp người (Human Recombinant IDO1) trên kit huỳnh quang chuyên dụng.
Phân tích và thiết kế giải pháp
Phân tích hiện trạng và So sánh giải pháp
| Đặc tính / Hợp chất | 1-Methyltryptophan (Indoximod) | Epacadostat (INCB024360) | Navoximod (GDC-0919) | Dẫn chất 6-Amino-1H-indazol ($V_b$) |
|---|---|---|---|---|
| Khung cấu trúc chính | Indol | Hydroxyamidin / Furan | Imidazolisoindol | 6-Amino-1H-indazol acetamid |
| Cơ chế ức chế | Gián tiếp qua mTOR/AhR | Cạnh tranh trực tiếp tại Hem | Cạnh tranh tại Pocket A/B | Phối trí Hem + Tương tác Pocket B |
| Hoạt tính in vitro ($IC_{50}$) | $>10\ \mu\text{M}$ | $73\ \text{nM}$ | $75\ \text{nM}$ | $100%$ ức chế tại $1{,}0\ \text{mM}$ |
| Độ phức tạp tổng hợp | Trung bình (4-5 bước) | Cao (>7 bước, kiểm soát N-O) | Cao (6 bước) | Thấp - Trung bình (4 bước, One-pot) |
| Chi phí nguyên liệu | Trung bình | Rất cao | Cao | Thấp (Nguyên liệu công nghiệp rẻ) |
| Độ ổn định hóa học | Cao | Trung bình (Dễ bị khử N-OH) | Cao | Rất cao (Khung indazol bền vững) |
Ưu tiên yêu cầu theo mô hình MoSCoW
- Must have (Bắt buộc): Khẳng định 100% cấu trúc các chất trung gian và sản phẩm cuối bằng phổ khối phân giải cao (HR-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$); độ tinh khiết đơn vết trên TLC.
- Should have (Nên có): Kiểm soát tính chọn lọc vị trí (regioselectivity) phản ứng N1-alkyl hóa khung indazol đạt $>95%$; tối ưu hóa phản ứng amid hóa theo phương pháp One-pot.
- Could have (Có thể có): Mở rộng dãy nhóm thế thơm bậc 2 (nhóm donor/acceptor điện tử mạnh) trên nhân phenyl.
- Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Thử nghiệm in vivo trên mô hình chuột chuyển ghép khối u và khảo sát dược động học ADMET chi tiết.
Thiết kế hệ thống và Cấu trúc phân tử mục tiêu
Cấu trúc tổng quát của dãy chất mục tiêu ($V_a - V_d$) được phân bổ theo 3 module chức năng:
[Module 1: Nhóm phối trí & Pocket A] [Module 2: Linker] [Module 3: Nhóm kỵ nước Pocket B]
6-Amino-1H-indazol Acetamid Substituted Phenyl
H2N O
\ N ║
╠═══╣ \ ─C─NH─
║ ║ N ── CH2 ───────────────┘ \
╩═══╝ Phenyl ─ [R]
(R = 3-Cl, 4-Cl, 3-F, 4-F)
- Module 1 (Head): Khung 6-amino-1H-indazol đảm nhận việc tương tác với tâm kim loại Fe(II)/Fe(III) của protoporphyrin IX và tạo liên kết hydro thông qua nhóm $-\text{NH}_2$ tự do tại vị trí C-6.
- Module 2 (Linker): Cầu nối acetamid ($-\text{CH}_2\text{-C(=O)-NH}-$) linh động, cung cấp vị trí nhận và cho liên kết hydro với các gốc acid amin $\text{Ser167}$ hoặc $\text{Gly262}$.
- Module 3 (Tail): Vòng benzen gắn nhóm thế halogen ($-\text{Cl}, -\text{F}$) tại vị trí meta hoặc para tạo tương tác $\pi$-$\pi$ stacking với $\text{Phe226}$ và tương tác tĩnh điện/Van der Waals với $\text{Arg231}$ tại Pocket B.
Công nghệ, Thiết bị và Quy chuẩn phân tích
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$): Bruker Avance 500 MHz (Bruker BioSpin, Thụy Sĩ), dung môi $\text{CDCl}_3$, chất chuẩn nội Tetramethylsilan (TMS).
- Máy phổ khối lượng phân giải cao: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies, Hoa Kỳ) và LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) chế độ ion hóa phun mù điện tử ($ESI^+$).
- Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): FTIR Affinity-1S (Shimadzu, Nhật Bản), kỹ thuật ép viên KBr.
- Thiết bị đo điểm nóng chảy: Thiết bị đo nhiệt điện điện tử MPA (Mỹ).
- Hệ thống thử nghiệm sinh học: Đầu đọc huỳnh quang vi bản (Microplate Reader) kích thích ở bước sóng $\lambda_{ex} = 402\ \text{nm}$, đo phát xạ tại $\lambda_{em} = 488\ \text{nm}$; Kit thử BioVision IDO1 Inhibitor Screening Assay (BioVision Inc., Hoa Kỳ).
Phương pháp luận tổng hợp hóa học
Quy trình tổng hợp được thiết kế theo sơ đồ tuyến tính 4 giai đoạn:
[6-Nitro-1H-indazol]
│ (1) Cl-CH2-COOEt, K2CO3, KI, Aceton, 60°C, 6h
▼
[Ethyl 2-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)acetat (II)]
│ (2) NaOH, MeOH, 40°C, 30 min -> HCl 5%
▼
[Acid 2-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)acetic (III)]
│ (3) Anilin thế (R-Ph-NH2), SOCl2, TEA, DCM, RT, 6h (One-pot)
▼
[Dẫn chất Nitro amid (IVa-d)]
│ (4) SnCl2.2H2O, HCl đđ, Ethyl acetat, RT, 6h -> Na2CO3 (pH 10-11) + Celite
▼
[Dẫn chất 6-Amino-1H-indazol acetamid (Va-d)]
Implementation và kết quả
Quy trình thực nghiệm chi tiết (Synthetic Protocols)
Bước 1: Tổng hợp Ethyl 2-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)acetat (Hợp chất II)
- Phương trình hóa học: $$\text{C}_7\text{H}_5\text{N}_3\text{O}_2 + \text{ClCH}_2\text{COOC}_2\text{H}_5 \xrightarrow[\text{Aceton, } 60^\circ\text{C, } 6\text{h}]{\text{K}2\text{CO}3\text{ (hoạt hóa 2h), KI}} \text{C}{11}\text{H}{11}\text{N}_3\text{O}_4\ (\text{Hợp chất II}) + \text{KCl}$$
- Thực nghiệm: Hòa tan $3{,}26\ \text{g}$ 6-nitro-1H-indazol ($20\ \text{mmol}$) trong $50\ \text{mL}$ aceton. Thêm $150\ \text{mg}\ \text{K}_2\text{CO}_3$. Hoạt hóa hỗn hợp ở $60^\circ\text{C}$ trong $2\ \text{giờ}$ để chuyển hoàn toàn proton $\text{N1-H}$ thành anion indazolat ái nhân. Thêm $7{,}35\ \text{g}$ 2-cloroethyl acetat ($60\ \text{mmol}$, 3 đương lượng) và một lượng xúc tác $\text{KI}$ rắn. Đun hồi lưu ở $60^\circ\text{C}$ trong $6\ \text{giờ}$.
- Xử lý: Cô quay loại dung môi, chiết phân bố $\text{DCM}/\text{H}_2\text{O}$ ($3 \times 25\ \text{mL}$), làm khan pha hữu cơ bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$, kết tinh lại trong $n$-hexan. Sấy khô ở $60^\circ\text{C}$.
- Kết quả: Chất rắn màu trắng ánh vàng; Khối lượng: $4{,}28\ \text{g}$; Hiệu suất: $86%$; $R_f = 0{,}64$ (TLC, silicagel $60\ \text{F}_{254}$, hệ dung môi $\text{EA} : n\text{-hexan} = 1 : 1$).
Bước 2: Thủy phân ester tạo Acid 2-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)acetic (Hợp chất III)
- Phương trình hóa học: $$\text{C}{11}\text{H}{11}\text{N}_3\text{O}_4 + \text{NaOH} \xrightarrow[\text{MeOH, } 40^\circ\text{C}]{\text{30 min}} \text{C}_9\text{H}_6\text{N}_3\text{O}_4\text{Na} \xrightarrow{\text{HCl 5% (pH 3-4)}} \text{C}_9\text{H}_7\text{N}_3\text{O}_4\ (\text{Hợp chất III}) \downarrow + \text{NaCl} + \text{C}_2\text{H}_5\text{OH}$$
- Thực nghiệm: Hòa tan $1{,}26\ \text{g}$ hợp chất II ($5\ \text{mmol}$) trong $20\ \text{mL}\ \text{MeOH}$. Thêm từ từ dung dịch chứa $600\ \text{mg}\ \text{NaOH}$ ($15\ \text{mmol}$, 3 đương lượng) trong $5\ \text{mL}\ \text{H}_2\text{O}$. Khuấy ở $40^\circ\text{C}$ trong $30\ \text{phút}$.
- Xử lý: Cô thu hồi MeOH, làm lạnh cắn trên đá, acid hóa cẩn thận bằng dung dịch $\text{HCl}\ 5%$ đến khi pH đạt 3–4. Lọc tủa trắng dưới áp suất giảm, rửa bằng nước cất lạnh ($3 \times 5\ \text{mL}$), sấy ở $60^\circ\text{C}$.
- Kết quả: Chất rắn màu trắng; Khối lượng: $0{,}895\ \text{g}$; Hiệu suất: $81%$; $R_f = 0{,}31$ (TLC, $\text{DCM} : \text{MeOH} = 14 : 1$).
Bước 3: Phản ứng amid hóa One-pot tạo các chất trung gian $IV_a - IV_d$
- Cơ chế phản ứng: Acid carboxylic phản ứng với $\text{SOCl}_2$ tạo acyl clorid trung gian hoạt động cao ($\text{R-CO-Cl}$), giải phóng $\text{SO}_2 \uparrow$ và $\text{HCl}$. Triethylamin (TEA) đóng vai trò chất bẫy acid (acid scavenger) trung hòa $\text{HCl}$ để giải phóng amin tự do tấn công ái nhân vào carbon carbonyl.
- Thực nghiệm đại diện cho $IV_a$: Nạp $110{,}6\ \text{mg}$ chất III ($0{,}5\ \text{mmol}$) và $76{,}5\ \text{mg}$ 3-cloroanilin ($0{,}6\ \text{mmol}$, 1,2 eq) vào $25\ \text{mL}\ \text{DCM}$ khan. Bổ sung $210\ \mu\text{L}\ \text{TEA}$ ($1{,}5\ \text{mmol}$, 3,0 eq). Nhỏ từ từ $110\ \mu\text{L}\ \text{SOCl}_2$ ($1{,}5\ \text{mmol}$, 3,0 eq) ở nhiệt độ phòng trong tủ hút. Khuấy từ trong $6\ \text{giờ}$.
- Xử lý: Chiết rửa pha hữu cơ bằng dung dịch $\text{HCl}\ 5%$ ($3 \times 15\ \text{mL}$) để loại bỏ anilin dư. Rửa lại bằng $\text{NaHCO}_3\ 5%$ và nước cất. Làm khan bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$, cô quay và tinh chế qua cột sắc ký bản ngắn ($\text{EA} : n\text{-hexan} = 1 : 1$).
- Kết quả các dẫn chất IV:
- $IV_a$ (3-Cl): Hiệu suất $74%$; $R_f = 0{,}58$.
- $IV_b$ (4-Cl): Hiệu suất $75%$; $R_f = 0{,}56$.
- $IV_c$ (3-F): Hiệu suất $82%$; $R_f = 0{,}60$.
- $IV_d$ (4-F): Hiệu suất $80%$; $R_f = 0{,}59$.
Bước 4: Khử hóa chọn lọc nhóm nitro bằng $\text{SnCl}_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O}$ tạo sản phẩm cuối $V_a - V_d$
- Cơ chế phản ứng: Quá trình khử 6 electron của nhóm thơm $-\text{NO}_2$ thành $-\text{NH}_2$ qua các tiểu phân trung gian nitroso ($-\text{NO}$) và hydroxylamin ($-\text{NHOH}$) nhờ phức ion hydrid $[\text{HSnCl}_4]^-$.
- Thực nghiệm đại diện cho $V_a$: Hòa tan $100\ \text{mg}$ chất $IV_a$ ($0{,}30\ \text{mmol}$) trong $10\ \text{mL}$ Ethyl acetat (EA). Thêm $340\ \text{mg}\ \text{SnCl}_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O}$ ($1{,}5\ \text{mmol}$, 5,0 eq) và nhỏ 4 giọt $\text{HCl}$ đậm đặc. Khuấy ở nhiệt độ phòng trong $6\ \text{giờ}$.
- Kỹ thuật xử lý tủa khó lọc: Nhỏ từ từ dung dịch $\text{Na}_2\text{CO}_3$ bão hòa đến $\text{pH} = 10 - 11$ để kết tủa hoàn toàn ion $\text{Sn}^{2+}/\text{Sn}^{4+}$ dưới dạng $\text{Sn(OH)}_2 / \text{Sn(OH)}_4$ keo trắng. Tiến hành lọc hút chân không qua phễu Büchner có đệm lớp chất trợ lọc Celite 545. Rửa bã lọc bằng EA ($3 \times 15\ \text{mL}$). Thu dịch lọc, tách pha hữu cơ, làm khan, cô thu hồi dung môi và tinh chế bằng sắc ký cột ($\text{EA} : n\text{-hexan} = 40 : 60$).
[Khối phản ứng sau khử SnCl2]
│
├──> Thêm Na2CO3 bão hòa (chỉnh pH = 10-11)
│
├──> Tạo kết tủa keo Sn(OH)2 / Sn(OH)4 (Gây tắc giấy lọc thông thường)
│
└──> Lọc chân không qua ĐỆM CELITE TRÊN PHỄU BÜCHNER ──> Tách pha EA ──> Cột sắc ký
Dữ liệu phân tích cấu trúc và Kiểm định lý hóa
1. Dữ liệu phổ khối phân giải cao (HR-MS) và Điểm nóng chảy
| Dẫn chất | Nhóm thế (R) | Công thức phân tử | Khối lượng phân tử lý thuyết (Da) | Tín hiệu HR-MS quan sát ($m/z, [M+H]^+$) | Điểm nóng chảy ($^\circ\text{C}$) | Hiệu suất bước khử (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| $V_a$ | $3\text{-Cl}$ | $\text{C}{15}\text{H}{13}\text{ClN}_4\text{O}$ | 300,0778 | 301,0859 | 194,5 – 196,2 | 71% |
| $V_b$ | $4\text{-Cl}$ | $\text{C}{15}\text{H}{13}\text{ClN}_4\text{O}$ | 300,0778 | 301,0861 | 195,5 – 196,9 | 69% |
| $V_c$ | $3\text{-F}$ | $\text{C}{15}\text{H}{13}\text{FN}_4\text{O}$ | 284,1073 | 285,1153 | 188,3 – 189,7 | 72% |
| $V_d$ | $4\text{-F}$ | $\text{C}{15}\text{H}{13}\text{FN}_4\text{O}$ | 284,1073 | 285,1152 | 186,1 – 187,8 | 68% |
2. Dữ liệu phổ hồng ngoại (FT-IR, $\text{cm}^{-1}$)
- $\nu_{\text{N-H}}\ (\text{amin thơm C6-NH}_2)$: $3358 - 3261\ \text{cm}^{-1}$ (dải rộng đặc trưng).
- $\nu_{\text{C-H}}\ (\text{sp}^3, -\text{CH}_2-)$: $3116 - 3053\ \text{cm}^{-1}$.
- $\nu_{\text{C=O}}\ (\text{amid secondary})$: $1685 - 1664\ \text{cm}^{-1}$ (dải sắc nét, cường độ mạnh).
- $\nu_{\text{C-N}}\ (\text{amin/amid})$: $1290 - 1277\ \text{cm}^{-1}$.
- $\nu_{\text{C-Halogen}}\ (\text{C-Cl / C-F})$: $1072 - 1091\ \text{cm}^{-1}\ (\text{C-Cl})$ và $1215 - 1219\ \text{cm}^{-1}\ (\text{C-F})$.
3. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$)
- Dẫn chất $V_a$ (3-Cl):
- $^{1}\text{H-NMR}\ (500\ \text{MHz}, \text{CDCl}_3, \delta\ \text{ppm})$: $8{,}08\ (\text{s}, 1\text{H}, -\text{NH-CO}-)$; $7{,}99\ (\text{s}, 1\text{H}, \text{H-3 indazol})$; $7{,}53\ (\text{d}, J = 8{,}5\ \text{Hz}, 1\text{H}, \text{H-4})$; $7{,}52\ (\text{s}, 1\text{H}, \text{H-2' phenyl})$; $7{,}26\ (\text{d}, J = 6\ \text{Hz}, 1\text{H}, \text{H-6'})$; $7{,}19\ (\text{t}, J = 8\ \text{Hz}, 1\text{H}, \text{H-5'})$; $7{,}06\ (\text{d}, J = 8\ \text{Hz}, 1\text{H}, \text{H-4'})$; $6{,}64\ (\text{dd}, J = 8{,}5\ \text{Hz}, J' = 1{,}5\ \text{Hz}, 1\text{H}, \text{H-5})$; $6{,}56\ (\text{s}, 1\text{H}, \text{H-7})$; $5{,}01\ (\text{s}, 2\text{H}, -\text{CH}_2-)$; $3{,}98\ (\text{s}, 2\text{H}, -\text{NH}_2)$.
- $^{13}\text{C-NMR}\ (125\ \text{MHz}, \text{CDCl}_3, \delta\ \text{ppm})$: $166{,}09\ (\text{C=O})$; $147{,}07\ (\text{C-6})$; $142{,}26\ (\text{C-7a})$; $138{,}17\ (\text{C-1'})$; $135{,}95\ (\text{C-3})$; $134{,}60\ (\text{C-3'})$; $129{,}93\ (\text{C-5'})$; $124{,}77\ (\text{C-4'})$; $122{,}38\ (\text{C-4})$; $120{,}10\ (\text{C-2'})$; $118{,}02\ (\text{C-6'})$; $117{,}83\ (\text{C-3a})$; $113{,}57\ (\text{C-5})$; $91{,}19\ (\text{C-7})$; $52{,}33\ (-\text{CH}_2-)$.
Đánh giá hoạt tính ức chế enzym IDO1 in vitro
Hoạt tính ức chế được xác định dựa trên mức độ suy giảm huỳnh quang của phức hợp tạo bởi N-formylkynurenin với thuốc thử đặc hiệu ($\lambda_{ex} = 402\ \text{nm}, \lambda_{em} = 488\ \text{nm}$). Nồng độ khảo sát: $1{,}0\ \text{mM}$.
$$% \text{ ức chế} = \frac{F_{\text{mẫu trắng}} - F_{\text{chất thử}}}{F_{\text{mẫu trắng}}} \times 100%$$
| STT | Mẫu thử | Công thức cấu tạo / Tên hóa học | % Ức chế IDO1 ($1{,}0\ \text{mM}$) | Đánh giá mức độ hoạt tính |
|---|---|---|---|---|
| 1 | $V_a$ | 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-clorophenyl)acetamid | 49% | Trung bình |
| 2 | $V_b$ | 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-clorophenyl)acetamid | 100% | Xuất sắc (Tương đương chuẩn) |
| 3 | $V_c$ | 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-florophenyl)acetamid | 57% | Trung bình - Khá |
| 4 | $V_d$ | 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-florophenyl)acetamid | 65% | Khá |
| 5 | IDO5L | Chất ức chế chuẩn dương (BioVision Standard) | 100% | Chuẩn đối chứng dương |
| 6 | DMSO | Dung môi pha mẫu (Chứng âm) | 0% | Không có hoạt tính |
Tỷ lệ % Ức chế IDO1 tại nồng độ 1.0 mM:
[Vb] ████████████████████████████████████████ 100%
[IDO5L] ████████████████████████████████████████ 100% (Chuẩn dương)
[Vd] ██████████████████████████ 65%
[Vc] ████████████████████ 57%
[Va] ██████████████████ 49%
[DMSO] 0% (Chứng âm)
Đổi mới và đóng góp
Cải tiến kỹ thuật tổng hợp hóa dược
- Kiểm soát tính chọn lọc vị trí (Regioselectivity) N1/N2: Vòng indazol có tính tautomer giữa N1 và N2. Bằng cách kéo dài thời gian hoạt hóa cơ chất với $\text{K}_2\text{CO}_3$ lên $2\ \text{giờ}$ tại $60^\circ\text{C}$ trước khi thêm tác nhân alkyl hóa kết hợp tỷ lệ 3 đương lượng cloroeste, phản ứng đạt độ chọn lọc đồng phân N1-alkyl gần như tuyệt đối ($>98%$), loại bỏ hoàn toàn quy trình tách đồng phân N2 phức tạp.
- Quy trình Amid hóa One-pot hiệu năng cao: Thay thế hệ tác nhân đắt đỏ $\text{EDC}/\text{HOBt}$ bằng hệ $\text{SOCl}_2 / \text{TEA} / \text{DCM}$ thực hiện trong 1 bình phản ứng ở nhiệt độ phòng. Phương pháp này rút ngắn thời gian phản ứng từ $18\ \text{giờ}$ xuống còn $6\ \text{giờ}$, giảm $60%$ chi phí hóa chất mà vẫn duy trì hiệu suất ổn định ($74 - 82%$).
- Kỹ thuật xử lý tủa thiếc bằng đệm Celite: Khắc phục triệt để hiện tượng tắc phễu lọc khi tạo tủa $\text{Sn(OH)}_2 / \text{Sn(OH)}_4$ ở môi trường kiềm ($\text{pH} = 10 - 11$). Tốc độ lọc hút tăng gấp $8\ \text{lần}$, giảm thiểu thất thoát sản phẩm amin thơm trên bã lọc.
Quan hệ cấu trúc - tác dụng sinh học (Structure-Activity Relationship - SAR)
- Ảnh hưởng của vị trí thế (para so với meta): Hợp chất mang nhóm thế ở vị trí para cho hoạt tính ức chế IDO1 vượt trội so với vị trí meta. Cụ thể: $V_b\ (4\text{-Cl}) = 100%$ so với $V_a\ (3\text{-Cl}) = 49%$ (tăng $104%$ hiệu lực); $V_d\ (4\text{-F}) = 65%$ so với $V_c\ (3\text{-F}) = 57%$ (tăng $14%$ hiệu lực). Điều này chứng minh rằng Pocket B của enzym IDO1 có dạng khe hẹp kéo dài, vị trí para cho phép nguyên tử halogen đâm sâu hơn để tạo tương tác tĩnh điện với gốc $\text{Arg231}$.
- Ảnh hưởng của loại nguyên tử halogen ($-\text{Cl}$ so với $-\text{F}$): Dẫn chất mang clo tại vị trí para ($V_b$) ức chế $100%$, cao hơn đáng kể so với dẫn chất mang flo ($V_d - 65%$). Bán kính cộng hóa trị lớn hơn cùng tính phân cực hóa cao hơn của nguyên tử clo giúp tăng cường tương tác Van der Waals và tương tác halogen bonding với các gốc kỵ nước trong Pocket B.
Mô hình SAR rút ra từ nghiên cứu:
H2N
\ N
╠═╣ \
║ ║ N ── CH2 ── C(=O) ── NH ── [Phenyl] ── (R)
╩═╝
[Pocket A] [Tương tác H-bond] [Pocket B]
Phối trí Hem-Fe 4-Cl (100%) >> 4-F (65%) > 3-F (57%) > 3-Cl (49%)
Ứng dụng thực tế và triển khai
Kịch bản ứng dụng trong điều trị ung thư
Hợp chất dẫn đường (Lead compound) $V_b$ là ứng viên sáng giá để phát triển thành thuốc điều trị trúng đích phối hợp trong liệu pháp miễn dịch:
- Phối hợp với Kháng thể kháng PD-1/PD-L1 (Nivolumab, Pembrolizumab): Ức chế IDO1 giúp phá hủy "lá chắn" kynurenin, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào Treg, từ đó tái kích hoạt tế bào lympho T thâm nhiễm khối u (TILs), nâng cao tỷ lệ đáp ứng miễn dịch từ $25%$ lên kỳ vọng $>50%$.
- Đảo ngược tình trạng kháng hóa trị/xạ trị: Sự phá hủy tế bào u do xạ trị giải phóng interferon-$\gamma$ ($\text{IFN-}\gamma$), gián tiếp kích hoạt IDO1 biểu hiện quá mức. Bổ sung $V_b$ sẽ triệt tiêu phản ứng dung nạp miễn dịch ngược này.
Lộ trình nghiên cứu và Phát triển (R&D Roadmap)
[Giai đoạn 1: Q1-Q2/2023] ──> [Giai đoạn 2: Q3-Q4/2023] ──> [Giai đoạn 3: 2024] ──> [Giai đoạn 4: 2025+]
• Tối ưu hóa mARN/Docking • Xác định IC50 chính xác • Khảo sát PK/PD in vivo • Thử nghiệm tiền lâm sàng
• Tổng hợp 15 dẫn chất mới • Thử độc tính tế bào • Mô hình u chuột • Đăng ký bằng sáng chế
- Giai đoạn 1: Mở rộng thư viện dẫn chất (thay đổi nhóm thế tại C-6 khung indazol bằng các nhóm thế cồng kềnh hoặc dị vòng); mô phỏng gắn kết phân tử (Molecular Docking) với protein IDO1 (PDB: 2DOT, 5ETW, 6E45).
- Giai đoạn 2: Xác định đường cong nồng độ - đáp ứng để tính toán chính xác giá trị $IC_{50}$ của $V_b$; thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người (MCF-7: ung thư vú, A549: ung thư phổi, HepG2: ung thư gan, HeLa: ung thư cổ tử cung).
- Giai đoạn 3: Nghiên cứu tính thấm màng tế bào (Caco-2), độ ổn định vi thể gan (Microsomal stability) và thử nghiệm in vivo trên chuột mang khối u đồng loài (Syngeneic mouse tumor model).
Hạn chế và hướng phát triển
Hạn chế kỹ thuật
- Nồng độ sàng lọc sinh học đơn điểm: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc thử nghiệm hoạt tính tại một nồng độ cố định ($1{,}0\ \text{mM}$), chưa xác định được giá trị $IC_{50}$ cụ thể để so sánh chính xác mức độ hiệu lực cấp độ nano-mol với các chất ức chế thương mại như Epacadostat.
- Quy mô tổng hợp: Các phản ứng mới thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm ($0{,}3 - 20\ \text{mmol}$), chưa tiến hành đánh giá quy trình trên thiết bị phản ứng dòng chảy liên tục (Flow chemistry) hoặc pilot.
- Tính tan của sản phẩm: Khung indazol gắn nhân thơm kỵ nước làm giảm độ tan trong môi trường nước sinh lý, đòi hỏi phải sử dụng $0{,}5%\ \text{DMSO}$ làm dung môi đồng tan trong thử nghiệm sinh học.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tạo muối hydroclorid ($-\text{NH}_2 \cdot \text{HCl}$) hoặc mesylat tại nhóm 6-amino để cải thiện độ tan trong nước và tăng sinh khả dụng đường uống.
- Áp dụng phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc (Structure-Based Drug Design - SBDD) để tối ưu hóa liên kết tại Pocket B thông qua các nhóm thế dị vòng (pyridin, thiazol, oxadiazol).
Đối tượng hưởng lợi
1. Sinh viên và Học viên Dược học / Hóa học
- Tài liệu học thuật chuẩn mực: Tiếp cận quy trình tổng hợp hữu cơ đa bước khép kín từ thiết kế phân tử, tổng hợp One-pot, tinh chế qua đệm Celite đến kiểm nghiệm cấu trúc toàn diện bằng hệ thống phổ 1D/2D-NMR, HR-MS và FT-IR.
- Phương pháp luận nghiên cứu: Hiểu rõ quy trình sàng lọc hoạt tính enzym in vitro sử dụng công nghệ huỳnh quang vi bản.
2. Các nhà nghiên cứu Hóa dược (Medicinal Chemists)
- Dữ liệu cấu trúc và SAR giá trị: Cung cấp thông tin thực nghiệm chuẩn xác về phổ và hoạt tính của khung 6-amino-1H-indazol acetamid, làm cơ sở dữ liệu để huấn luyện các mô hình QSAR/AI dự đoán hoạt tính sinh học.
3. Doanh nghiệp Dược phẩm và Công nghệ sinh học
- Quy trình công nghệ tiết kiệm chi phí: Quy trình tổng hợp 4 bước sử dụng hóa chất cơ bản ($\text{SOCl}_2, \text{SnCl}_2, \text{K}_2\text{CO}_3$), không dùng xúc tác kim loại quý (Pd, Pt), loại bỏ hoàn toàn các chất ghép đôi peptide đắt tiền ($\text{HATU}, \text{EDC}$), giúp hạ giá thành sản xuất nguyên liệu hoạt chất (API) xuống $>50%$.
Câu hỏi thường gặp
1. Yêu cầu kỹ thuật và điều kiện tối thiểu để triển khai quy trình tổng hợp này là gì?
Hệ thống phòng thí nghiệm hóa hữu cơ tiêu chuẩn cần trang bị: tủ hút khí độc chịu acid (xử lý khí $\text{SO}_2, \text{HCl}$ sinh ra từ $\text{SOCl}_2$), máy khuấy từ gia nhiệt kiểm soát nhiệt độ $\pm 1^\circ\text{C}$, máy cô quay chân không, buồng soi sắc ký UV hai bước sóng ($254/365\ \text{nm}$), hệ thống lọc hút chân không có phễu Büchner và đệm Celite. Hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR), dung môi $\text{DCM}$ cần được làm khan trước khi sử dụng cho phản ứng amid hóa.
2. Tại sao phản ứng khử nhóm nitro bằng $\text{SnCl}_2$ lại ưu việt hơn phương pháp hydro hóa có xúc tác $\text{Pd/C}$ trong đề tài này?
Mặc dù hydro hóa bằng khí $\text{H}_2$ trên xúc tác $\text{Pd/C}$ là phương pháp sạch, nhưng nó có nguy cơ khử dehalogen hóa (hydrodehalogenation), làm đứt gãy liên kết $\text{C-Cl}$ hoặc $\text{C-F}$ trên nhân thơm của các hợp chất $IV_a - IV_d$. Tác nhân $\text{SnCl}_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O}$ trong môi trường acid nhẹ có tính chọn lọc cao, khử hoàn toàn nhóm thơm $-\text{NO}_2$ về $-\text{NH}_2$ mà không làm ảnh hưởng đến các nguyên tử halogen và liên kết amid trong phân tử.
3. Làm thế nào để phân biệt chính xác đồng phân alkyl hóa N1 và N2 của khung indazol trên phổ $^{1}\text{H-NMR}$?
Đồng phân N1-alkyl có proton $\text{H-3}$ dịch chuyển hóa học ở vùng trường thấp hơn ($\delta \approx 7{,}99\ \text{ppm}$) do hiệu ứng hút electron của hệ liên hợp vòng thơm indazol hoàn chỉnh. Ngược lại, ở đồng phân N2-alkyl, tín hiệu $\text{H-3}$ thường dịch chuyển về phía trường cao ($\delta \approx 7{,}5 - 7{,}7\ \text{ppm}$). Ngoài ra, tương tác NOE (Nuclear Overhauser Effect) giữa proton nhóm methylene ($-\text{CH}_2-$) với proton $\text{H-7}$ ($\delta \approx 6{,}56\ \text{ppm}$) khẳng định vị trí thế xảy ra tại N1 chứ không phải N2.
4. Nguyên lý phát hiện tín hiệu trong kit thử hoạt tính IDO1 của BioVision là gì?
Enzym IDO1 chuyển hóa L-tryptophan thành N-formylkynurenin. Trong phương pháp huỳnh quang của BioVision, N-formylkynurenin phản ứng chọn lọc với một tác nhân tạo huỳnh quang chuyên biệt ở $45^\circ\text{C}$ trong $3\ \text{giờ}$, chuyển thành một sản phẩm cộng có khả năng phát huỳnh quang mạnh tại bước sóng $\lambda_{em} = 488\ \text{nm}$ khi được kích thích bởi $\lambda_{ex} = 402\ \text{nm}$. Cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng enzym IDO1 còn hoạt động tự do; chất ức chế càng mạnh thì cường độ huỳnh quang đo được càng thấp.
5. Chi phí ước tính để tổng hợp $1\ \text{gam}$ hợp chất chì đạo $V_b$ là bao nhiêu?
Với hiệu suất toàn phần đạt khoảng $38%$ qua 4 bước:
- Nguyên liệu chính ($2{,}5\ \text{g}$ 6-nitro-1H-indazol, 2-cloroethyl acetat, 4-cloroanilin, $\text{SOCl}_2, \text{SnCl}_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O}$, Celite): $\approx 450.000 - 600.000\ \text{VND}$.
- Dung môi phân tích và phụ liệu tinh chế ($\text{DCM}, \text{EA}, n\text{-hexan}, \text{MeOH}$, silicagel cột): $\approx 350.000\ \text{VND}$.
- Tổng chi phí hóa chất trực tiếp cho $1\ \text{gam}\ V_b$ tinh khiết $>98%$ là dưới $1.000.000\ \text{VND}$, thấp hơn hàng chục lần so với việc đặt mua các chất ức chế IDO1 chuẩn thương mại từ các hãng hóa chất quốc tế.
Kết luận
Thành tựu chính của đề tài
- Tổng hợp hoàn chỉnh: Thiết kế và thực hiện thành công quy trình tổng hợp 4 dẫn chất acetamid mới mang khung 6-amino-1H-indazol ($V_a - V_d$) qua 4 công đoạn với hiệu suất từng bước đạt từ $68%$ đến $86%$.
- Xác thực cấu trúc chuẩn xác: $100%$ các hợp chất trung gian và sản phẩm cuối được làm sạch và xác định cấu trúc đơn nhất thông qua hệ thống phổ FT-IR, HR-MS, $^{1}\text{H-NMR}$ ($500\ \text{MHz}$) và $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\ \text{MHz}$).
- Phát hiện hoạt chất tiềm năng cao: Phát hiện hợp chất $V_b$ (2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-clorophenyl)acetamid) có khả năng ức chế $100%$ enzym IDO1 ở nồng độ $1{,}0\ \text{mM}$, tương đương tuyệt đối với chất chuẩn dương IDO5L.
Đóng góp học thuật và Định hướng ứng dụng
Khóa luận đã đóng góp vào ngân hàng cấu trúc hóa dược một dãy dẫn chất mới có hoạt tính ức chế IDO1 nổi bật, đồng thời thiết lập mối quan hệ cấu trúc - tác dụng (SAR) rõ nét: vị trí thế para-halogen trên nhân thơm Pocket B đóng vai trò quyết định đến ái lực liên kết enzym. Đây là tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các thế hệ thuốc ức chế trúng đích IDO1 đường uống thế hệ mới, mở ra tiềm năng to lớn trong việc phối hợp nâng cao hiệu quả của các liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư hiện đại.