ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ hiện mắc và tỷ lệ mắc mới bệnh gút đang gia tăng ở nhiều nước phát triển. Ước tính tỷ lệ lưu hành bệnh gút được báo cáo trên toàn thế giới dao động từ 0,1% đến xấp xỉ 10%, tỷ lệ mắc bệnh từ 0,3 đến 6 trường hợp trên 1.000 người/ năm và có sự khác nhau giữa các khu vực trên thế giới, các nước phát triển nói chung có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn các nước đang phát triển [58]. Tại Việt Nam, theo thống kê của chương trình định hướng cộng đồng về kiểm soát bệnh thấp khớp (COPCORD), tỷ lệ mắc bệnh gút khoảng 0,14%. Bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng do mức sống tăng dẫn đến lối sống ít vận động, ăn nhiều protein, uống rượu bia [43].
Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa các base purin [77]. Khi acid uric trong máu tăng cao vượt quá độ bão hòa, có thể gây ra cơn gút cấp. Hoặc acid uric kết tinh lại thành các tinh thể urat lắng đọng tại khớp gây nên bệnh khớp mạn tính do urat; lắng đọng tại da, mô mềm tạo thành các hạt tôphi; hoặc lắng đọng tại thận gây ra sỏi thận. Bệnh gút tuy không nằm trong nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu như ung thư, tim mạch nhưng lại ảnh hưởng không nhỏ đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân [9].
Vì vậy, kiểm soát nồng độ acid uric chính là mục tiêu điều trị của bệnh. Các thuốc hạ acid uric được chia thành 3 nhóm theo các cơ chế: giảm tổng hợp acid uric, tăng thải trừ acid uric qua thận và nhóm tiêu hủy acid uric [36]. Tuy nhiên, các thuốc tân dược lại có nhiều tác dụng không mong muốn ảnh hưởng tới sức khỏe của người bệnh. Ví dụ như Allopurinol được coi là 1 trong những thuốc đầu tay điều trị bệnh gút lại gây nguy cơ bị phản ứng có hại trên da (SCAR) đối với người mang kiểu gen HLA-B*58:01 [56].
Hiện nay, việc điều trị gút bằng y học cổ truyền đã được thế giới hướng tới với hiệu quả điều trị lâu dài và ít tác dụng không mong muốn. Có rất nhiều vị thuốc có tác dụng hạ acid uric máu như: Hoàng bá, Hy thiêm, Thương truật. đã được nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị gút [57], [64]. Tam diệu hoàn (DĐTQ 2015) có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, dùng trong điều trị chứng phong thấp nhiệt tý, tương đương với điều trị thể viêm khớp cấp tính, bệnh gút.
Vị thuốc Hoàng bá là vị quân, là vị thuốc chính quyết định tác dụng của phương thuốc với thành phần hoạt chất chính là berberin; Thương truật là vị thần có tác dụng hỗ trợ, tăng cường tác dụng của Hoàng bá trong việc làm giảm nồng độ acid uric huyết; Ngưu tất giúp tăng cường hiệu quả điều trị ở chi dưới [94]. Tan thống phong được thiết kế dựa trên sự gia giảm từ phương thuốc Tam diệu hoàn, chú trọng tăng cường hiệu quả điều trị bệnh gút. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá về chất lượng và tác dụng dược lý trên mô hình động vật thực nghiệm của cao đặc phương thuốc. 1 Từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết trên thực nghiệm của cao đặc Tan thống phong” được thực hiện với mục tiêu sau: 1.
Định tính các vị thuốc thành phần bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng berberin hydroclorid trong cao đặc Tan thống phong bằng HPLC. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết trên thực nghiệm của cao đặc Tan thống phong. Phương pháp định tính dược liệu bằng SKLM 1. Phương pháp SKLM Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách.
Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [10]. Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi [10]: a Rf = b Trong đó: a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích (cm). b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu (cm). Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Ứng dụng của SKLM Phương pháp SKLM là phương pháp được tiến hành đơn giản, thời gian triển khai nhanh, lượng mẫu phân tích cần ít và khả năng phân tách tốt. Vì vậy, SKLM là phương pháp được sử dụng chủ yếu hiện nay để phát hiện, theo dõi các chất trong hỗn hợp khi yêu cầu phân tích không đòi hỏi các phương pháp hiện đại hơn [8]. Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để định lượng hoặc bán định lượng hoạt chất [10]. - Định tính: Dựa vào trị số Rf và màu sắc của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
- Thử tinh khiết: Mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở việc có hay không các vết lạ trên sắc ký đồ. - Bán định lượng: Dựa vào cường độ màu (trước hoặc sau khi phun thuốc thử) được thực hiện tự động bằng thiết bị điện tử chuyên dụng. - Định lượng: Có hai cách để định lượng các chất trong vết sắc ký là tách chiết 3 chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp rồi định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp hoặc đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký [7] 1. Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC 1.
Phương pháp HPLC HPLC là một kỹ thuật phân tách, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Sự phân tách các chất chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể [8], [10]. Tốc độ di chuyển của các chất khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý, thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh cho phù hợp [7].
Hệ thống HPLC [7] Trong đó: 1. Bình dung môi 3. Van kiểm tra 7. Lọc dung môi 12.
Điều hòa áp suất ngược 13. Van tiêm mẫu 15. Tới detector áp suất 1. Ứng dụng của phương pháp HPLC Hiện nay, HPLC được ứng dụng nhiều trong kiểm nghiệm, dùng để định tính, định lượng, xác định giới hạn tạp chất.
Một số ứng dụng cụ thể: - Định tính: Thông qua thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn trên sắc ký đồ. - Định lượng: Các phép định lượng bằng HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của 4 chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Các phương pháp định lượng thường được sử dụng trong HPLC là phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn, thêm đường chuẩn và chuẩn hóa diện tích [8]. - Xác định giới hạn tạp chất [7].
Định tính, định lượng BBR bằng HPLC Trong DĐVN và DĐTQ 2015 tiến hành định tính và định lượng berberin trong dược liệu Hoàng bá bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong chuyên luận Tam diệu hoàn (DĐTQ 2015) cũng tiến hành định tính và định lượng berberin bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành định tính, định lượng berberin trong cao đặc phương thuốc. Hiện nay, các nhà khoa học trên Thế giới đã sử dụng một số phương pháp hiện đại như HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS, phổ hổng ngoại gần (NIRS) hay 1H NMR để định tính, định lượng berberin trong Hoàng bá [28], [30], [60], [95].
Đề tài “Nghiên cứu bào chế và xác định một số thành phần hóa học của cao đặc phương thuốc Tam diệu thang gia giảm” (Nguyễn Thị Hương Thảo, 2013) đã định tính, định lượng berberin trong mẫu cao bằng sắc ký lớp mỏng [19]. Tổng quan về acid uric máu 1. Khái niệm về acid uric máu Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa các base purin (adenosin monophosphat (AMP), guanosin monophosphat (GMP) và acid nucleic), là sản phẩm của quá trình đào thải các chất chứa nitơ trong cơ thể con người [77]. Sinh chuyển hóa acid uric Quá trình tổng hợp acid uric Acid uric được tạo nên từ 3 nguồn [1]: - Thoái biến từ chất có nhân purin do thức ăn mang vào.
- Thoái biến từ chất có nhân purin từ trong cơ thể (các acid nhân ADN và ARN do sự phá hủy các tế bào giải phóng ra). - Tổng hợp purin từ con đường nội sinh. Ngoài sự hình thành từ ba nguồn trên còn cần có sự tham gia của các men nuclease, xanthin oxidase, hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase (HGPT). Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [67] Quá trình thải trừ acid uric ra khỏi cơ thể Thận thải trừ khoảng 70% lượng acid uric được tạo ra hàng ngày, trong khi khoảng 30% còn lại được đào thải qua đường tiêu hóa [68].
Tại thận, acid uric được lọc qua cầu thận, sau đó được bài tiết, tuy nhiên 90% được tái hấp thu và quay trở lại máu [24]. Tăng acid uric máu và các bệnh lý liên quan 1. Tăng acid uric máu Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric máu trên 7,0 mg/dL (0,42 mmol/L) đối với nam và trên 6,0 mg/dL (0,36 mmol/L) đối với nữ [16]. Tăng acid uric máu có liên quan tới một số bệnh lý sau: - Tăng acid uric máu và bệnh gút Tăng acid uric máu là yếu tố nguy cơ hàng đầu đối với sự tiến triển bệnh gút, mặc dù có khoảng 2/3 hoặc hơn các trường hợp tăng acid uric máu không có triệu chứng.
Nguy cơ bị gút tăng theo tuổi và nồng độ acid uric máu [79].