Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Quá trình đông máu là một phản ứng sinh lý quan trọng giúp duy trì trạng thái thể dịch của máu và ngăn ngừa sự mất máu khi mạch máu bị tổn thương thông qua việc chuyển fibrinogen hòa tan thành mạng lưới sợi fibrin không hòa tan dưới sự xúc tác của thrombin. Trạng thái sinh lý bình thường được duy trì nhờ sự cân bằng giữa quá trình đông máu và quá trình chống đông - tiêu sợi huyết. Khi sự cân bằng này bị phá vỡ do tăng hoạt hóa đông máu, giảm ức chế đông máu hoặc suy giảm hoạt tính tiêu sợi huyết, tình trạng tăng đông sẽ xuất hiện, dẫn tới sự hình thành huyết khối tại động mạch, tĩnh mạch và các vi quản. Các bệnh lý huyết khối như nhồi máu cơ tim, đột quỵ não và thuyên tắc phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu hiện nay. Đặc biệt, tình trạng tăng đông và biến cố huyết khối cũng là các biến chứng nguy hiểm liên quan đến đại dịch COVID-19 và việc tiêm chủng một số loại vắc xin.
Các thuốc chống đông và chống kết tập tiểu cầu của y học hiện đại (như heparin, thuốc kháng vitamin K, clopidogrel, các thuốc chống đông đường uống thế hệ mới) có hiệu quả điều trị rõ rệt nhưng tồn tại nhiều hạn chế như chi phí điều trị cao và nguy cơ gây xuất huyết nghiêm trọng. Do đó, việc nghiên cứu các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nhằm tìm kiếm giải pháp hỗ trợ phòng ngừa và điều trị huyết khối an toàn, ít tác dụng không mong muốn khi sử dụng dài ngày là nhu cầu thực tiễn cấp thiết.
Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Sieb. et Zucc.) Kitagawa) là cây thuốc di thực vào Việt Nam từ những năm 1990. Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra cao chiết cồn của rễ củ Đương quy Nhật Bản có tác dụng chống đông máu và chống kết tập tiểu cầu in vitro trên máu người tình nguyện, tác dụng chống đông máu của loài này trên các mô hình gây đông máu thực nghiệm in vivo vẫn chưa được làm sáng tỏ. Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Võ Thị Bích Ngọc (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2022) được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm cho chế phẩm Angobin của Viện Dược liệu (SĐK: V55-H12-16) với hai mục tiêu cụ thể:
- Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro của cao chiết cồn Đương quy Nhật Bản di thực (cao Angobin) trên máu thỏ.
- Đánh giá tác dụng chống đông máu in vivo của thuốc Angobin từ Đương quy Nhật Bản di thực.
Nghiên cứu được thực hiện trên hai mẫu thử chính do Viện Dược liệu cung cấp: cao cồn ethanol 80% rễ củ Đương quy Nhật Bản di thực (cao Angobin) đạt tiêu chuẩn cơ sở và viên nén bao đường Angobin (SĐK: V55-H12-16). Đối tượng thực nghiệm bao gồm máu thỏ chủng Newzealand White (1,8 - 2,2 kg) cho thử nghiệm in vitro và chuột nhắt trắng chủng Swiss albino (đực, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 g) cho thử nghiệm in vivo. Nghiên cứu được triển khai tại Khoa Dược lý - Sinh hóa (Viện Dược liệu), Bộ môn Dược học cổ truyền (Trường Đại học Dược Hà Nội) phối hợp với Bộ môn Sinh lý (Trường Đại học Y Hà Nội) trong năm 2022.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận dựa trên lý thuyết sinh lý đông cầm máu gồm 4 giai đoạn chính: giai đoạn thành mạch (co mạch phản xạ và thể dịch), giai đoạn tiểu cầu (dính, hoạt hóa, ngưng tập tạo nút tiểu cầu), giai đoạn đông máu huyết tương (hình thành thrombokinase nội sinh/ngoại sinh, hình thành thrombin, hình thành fibrin) và giai đoạn tiêu sợi huyết (plasminogen chuyển thành plasmin dưới tác động của t-PA để phân hủy fibrin). Các yếu tố đông máu huyết tương được phân nhóm chức năng gồm nhóm tiếp xúc (yếu tố XI, XII, prekallikrein, HMWK), nhóm prothrombin phụ thuộc vitamin K (yếu tố II, VII, IX, X) và nhóm fibrinogen (yếu tố I, V, VIII, XIII). Về hóa thực vật, rễ Đương quy Nhật Bản chứa tinh dầu với thành phần chính là ligustilide, butylidenephthalide và hàm lượng coumarin toàn phần khoảng 1,21% (gồm umbelliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinellin, bergapten, bergaptol) cùng các acid hữu cơ, polyacetylen, sterol và polysaccharid. Nhóm coumarin có cấu trúc cạnh tranh với vitamin K, làm suy giảm phản ứng carboxyl hóa các yếu tố đông máu II, VII, IX, X tại gan.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo hai hệ thống thử nghiệm:
-
Thử nghiệm in vitro: Đánh giá ảnh hưởng của cao Angobin ở các nồng độ 1,25 mg/mL; 2,5 mg/mL; 5 mg/mL trên huyết tương nghèo tiểu cầu tách từ máu thỏ (ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, ống chứa natri citrat 3,8%). Thí nghiệm gồm 5 lô: Lô chứng sinh học (NaCl 0,9%), 3 lô mẫu thử cao Angobin, và Lô chứng dương (heparin 1,5 UI/mL), tiến hành lặp lại 4 lần ($n = 4$). Các thông số đo bao gồm: thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần (APTT, APTTb-c) nhằm đánh giá con đường đông máu nội sinh và thời gian prothrombin (PT, PT%, PT-INR) nhằm đánh giá con đường đông máu ngoại sinh, sử dụng bộ hóa chất Dade® Actin FSL, Thromborel® S và dung dịch $\text{CaCl}_2\ 0,025\text{ mol/L}$ trên máy xét nghiệm đông máu bán tự động Sysmex CA-50 (Nhật Bản).
-
Thử nghiệm in vivo: Sử dụng mô hình gây huyết khối động mạch cảnh trái bằng $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trên chuột nhắt trắng Swiss albino. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 6 lô ($n = 10/\text{lô}$):
- Lô chứng sinh lý: uống nước cất $10\text{ mL/kg/ngày}$.
- Lô chứng bệnh lý: uống nước cất $10\text{ mL/kg/ngày}$, có gây mô hình $\text{FeCl}_3$.
- Lô chứng dương 1: tiêm màng bụng heparin $200\text{ UI/kg}$ duy nhất trước khi gây mô hình 15 phút.
- Lô chứng dương 2: uống clopidogrel $50\text{ mg/kg/ngày}$ trong 7 ngày liên tục.
- Lô mẫu thử 1: uống viên Angobin liều $1,8\text{ viên/kg/ngày}$ ($900\text{ mg/kg/ngày}$) trong 7 ngày liên tục.
- Lô mẫu thử 2: uống viên Angobin liều $3,6\text{ viên/kg/ngày}$ ($1800\text{ mg/kg/ngày}$) trong 7 ngày liên tục.
Sau 1 giờ kể từ liều uống cuối cùng vào ngày thứ 7, chuột được gây mê bằng cloralhydrat ($350\text{ mg/kg}$), phẫu thuật bộc lộ động mạch cảnh chung trái và áp mảnh giấy lọc ($2\times 2\text{ mm}$) tẩm $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trực tiếp lên bề mặt mạch máu trong 3 phút để gây tổn thương oxy hóa khử nội mô và hình thành huyết khối cục bộ. Thời gian chảy máu được đo bằng phương pháp cắt đuôi chuột tại vị trí cách chóp đuôi $4\text{ mm}$ và nhúng vào nước muối sinh lý $37^\circ\text{C}$. Sau 8 phút tính từ lúc bắt đầu gây mô hình, máu động mạch cảnh được thu thập vào ống chống đông natri citrat 3,8% để ly tâm lấy huyết tương nghèo tiểu cầu, tiến hành xác định các chỉ số APTT, PT và thời gian thrombin (TT) trên máy Sysmex CA-50.
Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình kèm sai số chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SE}$). Thuật toán Student's t-Test được áp dụng cho dữ liệu in vitro và phân tích phương sai một chiều (One-way ANOVA) cho dữ liệu in vivo, với ngưỡng ý nghĩa thống kê được xác lập tại $p < 0,05$.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương này hệ thống hóa toàn diện cơ sở lý thuyết về sinh lý hệ đông cầm máu, phân loại các thuốc tác dụng lên quá trình đông máu và phân tích các mô hình thực nghiệm gây huyết khối phổ biến. Tác giả trình bày chi tiết vai trò của nội mạc, tiểu cầu, các yếu tố đông máu huyết tương và cơ chế hoạt động của 4 giai đoạn đông máu. Phần thuốc tác dụng lên quá trình đông máu phân tích cơ chế của các thuốc ức chế kết tập tiểu cầu (aspirin, clopidogrel qua thụ thể $\text{P2Y}_{12}$, thuốc ức chế GP IIb/IIIa, dipyridamol) và các nhóm thuốc chống đông đường tiêm (heparin không phân đoạn, heparin phân tử lượng thấp, fondaparinux) cùng thuốc chống đông đường uống (kháng vitamin K, dabigatran, rivaroxaban, apixaban).
Bên cạnh đó, chương tổng quan phân tích ưu - nhược điểm của 4 mô hình gây đông máu thực nghiệm: mô hình lipopolysaccharid (gây đông máu toàn thân qua kích hoạt cả hai con đường và tiêu thụ tiểu cầu/fibrinogen), mô hình tiêm tĩnh mạch thrombin, mô hình gây viêm mạch nội mô bằng k-carrageenan và mô hình gây tổn thương mạch máu cục bộ bằng $\text{FeCl}_3$ do phản ứng oxy hóa khử tạo gốc tự do gây peroxy hóa lipid màng tế bào nội mô. Về dược liệu, chương này trình bày vị trí phân loại của Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Sieb. et Zucc.) Kitagawa, họ Hoa tán Apiaceae), đặc điểm hình thái thực vật, vùng phân bố di thực tại Hà Giang, Lào Cai, Hà Nội; tổng hợp các nhóm thành phần hóa học (tinh dầu, coumarin, acid béo, acid hữu cơ, polyacetylen, polysaccharid) và tổng quan các nghiên cứu dược lý đã công bố về tác dụng trên hệ tuần hoàn, miễn dịch, thần kinh, chống viêm, giảm đau và chống lão hóa.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết thông số kỹ thuật của nguyên liệu nghiên cứu, động vật thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và các quy trình thao tác thực nghiệm. Cao cồn 80% Đương quy Nhật Bản di thực (cao Angobin) và thuốc viên nén bao đường Angobin (khối lượng trung bình $500\text{ mg/viên}$) được kiểm soát nguồn gốc từ Viện Dược liệu. Công thức của viên Angobin được ghi nhận rõ ràng gồm: cao Đương quy di thực $0,13\text{ g}$, bột Đương quy di thực $0,14\text{ g}$, tinh dầu lá Đương quy di thực $0,0013\text{ g}$ cùng các tá dược (bột talc, magnesi carbonat, titan dioxyd, HPMC, CMC, gelatin, đường). Động vật thí nghiệm gồm chuột nhắt trắng Swiss albino đực ($20 \pm 2\text{ g}$) và thỏ Newzealand White ($1,8 - 2,2\text{ kg}$) được nuôi ổn định 7 ngày ở điều kiện tiêu chuẩn ($25 \pm 1^\circ\text{C}$).
Chương này trình bày chi tiết các sơ đồ quy trình: quy trình pha nồng độ dung dịch gốc cao Angobin ($60\text{ mg/mL}$) và các nồng độ thử nghiệm ($5\text{ mg/mL}$; $2,5\text{ mg/mL}$; $1,25\text{ mg/mL}$); quy trình ủ mẫu với huyết tương thỏ, thuốc thử Dade® Actin FSL, Thromborel® S và $\text{CaCl}_2$ để đo APTT và PT; quy trình ngoại suy liều tương đương từ người sang chuột nhắt trắng (tỷ lệ $1:12$) để xác định mức liều thử nghiệm in vivo ($1,8\text{ viên/kg/ngày}$ và $3,6\text{ viên/kg/ngày}$); các bước phẫu thuật bộc lộ động mạch cảnh chuột, quy trình tẩm $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trong 3 phút, kỹ thuật cắt đuôi đo thời gian chảy máu và phương pháp lấy máu động mạch cảnh tại thời điểm 8 phút sau gây mô hình để xác định đồng thời 3 thông số APTT, PT, TT trên máy Sysmex CA-50.
Chương 3: Thực nghiệm, kết quả
Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các thử nghiệm in vitro và in vivo, kèm theo các bảng tổng hợp và phân tích thống kê so sánh giữa các lô nghiên cứu.
1. Tác dụng chống đông máu in vitro của cao Angobin trên máu thỏ
Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao Angobin lên con đường đông máu nội sinh (APTT) và ngoại sinh (PT) trên huyết tương máu thỏ khỏe mạnh ($n = 4$):
| STT |
Thuốc thử / Nồng độ |
APTT (s) |
APTTb-c |
PT (s) |
PT (%) |
PT-INR |
| 1 |
Chứng sinh học (NaCl 0,9%) |
$16,35 \pm 0,39$ |
$0,61 \pm 0,01$ |
$7,70 \pm 0,17$ |
$247,20 \pm 11,54$ |
$0,67 \pm 0,01$ |
| 2 |
Heparin 1,5 UI/mL |
$37,45 \pm 2,35^{**}$ |
$1,39 \pm 0,09^{**}$ |
$9,10 \pm 0,23^{**}$ |
$171,68 \pm 9,20^{**}$ |
$0,79 \pm 0,02^{**}$ |
| 3 |
Cao Angobin 1,25 mg/mL |
$16,75 \pm 0,37^{*}$ |
$0,62 \pm 0,01^{*}$ |
$8,03 \pm 0,43$ |
$230,80 \pm 23,47$ |
$0,69 \pm 0,04$ |
| 4 |
Cao Angobin 2,5 mg/mL |
$19,80 \pm 1,02^{*}$ |
$0,73 \pm 0,04^{*}$ |
$8,38 \pm 0,32$ |
$207,75 \pm 17,24$ |
$0,72 \pm 0,03$ |
| 5 |
Cao Angobin 5 mg/mL |
$20,73 \pm 0,10^{**}$ |
$0,74 \pm 0,02^{**}$ |
$8,03 \pm 0,29$ |
$227,95 \pm 18,85$ |
$0,69 \pm 0,02$ |
*(Ghi chú: So với lô chứng sinh học: $^p < 0,05$; $^{**}p < 0,01$)
Kết quả cho thấy cao Angobin ở cả 3 mức nồng độ đều làm kéo dài có ý nghĩa thống kê thời gian đông máu nội sinh APTT và làm tăng chỉ số APTTb-c so với chứng sinh học. Ngược lại, các chỉ số đông máu ngoại sinh (PT, PT%, PT-INR) của các lô thử cao Angobin không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học ($p > 0,05$).
2. Tác dụng chống đông máu in vivo của viên Angobin trên mô hình gây đông máu bằng FeCl3
- Thời gian chảy máu: Thời gian chảy máu của lô bệnh lý ngắn hơn có ý nghĩa so với lô chứng sinh lý ($p < 0,05$). Viên Angobin ở cả hai mức liều $1,8\text{ viên/kg/ngày}$ ($p < 0,01$) và $3,6\text{ viên/kg/ngày}$ ($p < 0,001$) đều làm kéo dài thời gian chảy máu rõ rệt so với lô bệnh lý, tương tự như tác dụng của thuốc chống kết tập tiểu cầu clopidogrel $50\text{ mg/kg}$ ($p < 0,001$), trong khi heparin $200\text{ UI/kg}$ không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian chảy máu ($p > 0,05$).
- Các thông số đông máu huyết tương in vivo ($n = 10$ chuột/lô):
| Lô nghiên cứu |
APTT (s) |
APTTb-c |
PT (s) |
PT (%) |
PT-INR |
TT (s) |
| Chứng sinh lý |
$17,24 \pm 0,56$ |
$0,63 \pm 0,02$ |
$7,35 \pm 0,05$ |
$271,67 \pm 4,25$ |
$0,64 \pm 0,01$ |
$12,67 \pm 0,55$ |
| Chứng bệnh lý |
$20,81 \pm 0,38^{\Delta\Delta\Delta}$ |
$0,77 \pm 0,01^{\Delta\Delta\Delta}$ |
$7,88 \pm 0,10^{\Delta\Delta}$ |
$234,93 \pm 6,33^{\Delta\Delta}$ |
$0,68 \pm 0,01^{\Delta\Delta}$ |
$15,66 \pm 1,11^{\Delta}$ |
| Heparin 200 UI/kg |
$25,18 \pm 0,84^{***}$ |
$0,93 \pm 0,03^{***}$ |
$8,36 \pm 0,14^{*}$ |
$207,29 \pm 7,54^{*}$ |
$0,72 \pm 0,01^{*}$ |
$19,94 \pm 1,09^{*}$ |
| Clopidogrel 50 mg/kg |
$21,66 \pm 0,62$ |
$0,80 \pm 0,02$ |
$8,02 \pm 0,12$ |
$226,66 \pm 7,58$ |
$0,69 \pm 0,01$ |
$16,37 \pm 0,92$ |
| Angobin 1,8 viên/kg |
$23,23 \pm 0,70^{*}$ |
$0,86 \pm 0,03^{*}$ |
$7,58 \pm 0,11$ |
$256,08 \pm 7,62$ |
$0,65 \pm 0,01$ |
$16,76 \pm 0,88$ |
| Angobin 3,6 viên/kg |
$23,49 \pm 0,94^{*}$ |
$0,87 \pm 0,04^{*}$ |
$7,94 \pm 0,15$ |
$232,68 \pm 9,81$ |
$0,69 \pm 0,01$ |
$17,58 \pm 1,04$ |
(Ghi chú: So với lô chứng sinh lý: $^{\Delta}p < 0,05$, $^{\Delta\Delta}p < 0,01$, $^{\Delta\Delta\Delta}p < 0,001$; So với lô bệnh lý: $^p < 0,05$, $^{}p < 0,001$)
Kết quả thực nghiệm in vivo chứng minh viên Angobin liều $1,8$ và $3,6\text{ viên/kg/ngày}$ làm kéo dài APTT và tăng APTTb-c có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý ($p < 0,05$), nhưng không làm thay đổi các thông số của con đường đông máu ngoại sinh (PT, PT%, PT-INR) và con đường chung (TT) với $p > 0,05$.
Chương 4: Bàn luận
Chương bàn luận phân tích và lý giải các phát hiện thực nghiệm trên cơ sở đối chiếu với các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước. Kết quả in vitro của đề tài tương đồng với nghiên cứu của Lê Thị Kim Loan và cộng sự (2001) trên máu người khi chứng minh Đương quy Nhật Bản có tác dụng ức chế đông máu nội sinh. Tuy nhiên, trong khi nghiên cứu năm 2001 thử nghiệm ở các nồng độ rất cao ($25\text{ mg/mL}$, $50\text{ mg/mL}$, $100\text{ mg/mL}$) và thấy ức chế cả hai con đường đông máu, đề tài này đã thử nghiệm ở dải nồng độ thấp hơn nhiều ($1,25 - 5\text{ mg/mL}$, thấp hơn đến 20 lần) và chứng minh tác dụng ức chế chọn lọc trên con đường nội sinh xuất hiện ngay từ nồng độ thấp.
Về phương diện phương pháp luận, tác giả khẳng định đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam thiết lập và ứng dụng thành công mô hình gây huyết khối động mạch cảnh bằng $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trên chuột nhắt trắng. So với các mô hình gây đông máu toàn thân (như LPS, thrombin, k-carrageenan), mô hình $\text{FeCl}_3$ tạo huyết khối cục bộ tại vị trí mạch máu tiếp xúc nhờ cơ chế oxy hóa khử phá hủy tế bào nội mô, rất phù hợp để đánh giá tác dụng dự phòng huyết khối tắc mạch của các chế phẩm dược liệu. Độ tin cậy của mô hình được khẳng định thông qua sự phản hồi đặc hiệu của hai thuốc đối chứng: clopidogrel làm kéo dài thời gian chảy máu mà không đổi PT, APTT, TT; trong khi heparin làm kéo dài APTT, PT, TT mà không đổi thời gian chảy máu.
Tác dụng chống đông in vivo của viên Angobin trên mô hình $\text{FeCl}_3$ thể hiện qua việc vừa kéo dài thời gian chảy máu (tác động lên giai đoạn cầm máu ban đầu và tiểu cầu), vừa kéo dài APTT (ức chế đông máu nội sinh), trong khi không ảnh hưởng đến PT và TT. Sự đồng nhất giữa kết quả in vitro (cao Angobin) và in vivo (viên Angobin) chứng minh hoạt tính chống đông bắt nguồn trực tiếp từ cao chiết Đương quy Nhật Bản chứ không bị chi phối bởi các tá dược trong dạng bào chế viên nén. Cơ chế chống đông này được giải thích là do sự hiện diện của nhóm coumarin (chiếm $1,21%$ trong dược liệu), với cấu trúc tương tự vitamin K giúp ức chế enzyme vitamin K-epoxide-reductase, làm giảm carboxyl hóa các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K. Kết quả này củng cố bằng chứng cho các thử nghiệm lâm sàng trước đây của Lê Tùng Châu (1998) với bài thuốc hoạt huyết CM3 khi thay thế Đương quy Trung Quốc bằng Đương quy Nhật Bản, đồng thời gợi mở tiềm năng ứng dụng của Angobin trong việc dự phòng biến cố tắc mạch não và huyết khối liên quan đến COVID-19.
Kết quả và đóng góp
Khóa luận đã đạt được các kết quả cụ thể và mang lại những đóng góp khoa học - thực tiễn sau:
1. Kết quả định lượng chính
- Tác dụng in vitro của cao Angobin: Ở các nồng độ $1,25\text{ mg/mL}$, $2,5\text{ mg/mL}$ và $5\text{ mg/mL}$, cao chiết làm kéo dài thời gian APTT trên máu thỏ lần lượt đạt $16,75 \pm 0,37\text{ s}$ ($p < 0,05$), $19,80 \pm 1,02\text{ s}$ ($p < 0,05$) và $20,73 \pm 0,10\text{ s}$ ($p < 0,01$) so với chứng sinh học ($16,35 \pm 0,39\text{ s}$). Các chỉ số PT, PT% và PT-INR không thay đổi có ý nghĩa thống kê ($p > 0,05$).
- Tác dụng in vivo của viên Angobin: Trên mô hình chuột gây huyết khối bằng $\text{FeCl}_3\ 7,5%$, viên Angobin liều $1,8\text{ viên/kg/ngày}$ và $3,6\text{ viên/kg/ngày}$ làm kéo dài thời gian chảy máu rõ rệt ($p < 0,01$ và $p < 0,001$ so với lô bệnh lý). Đồng thời, thuốc kéo dài thời gian đông máu nội sinh APTT lên $23,23 \pm 0,70\text{ s}$ và $23,49 \pm 0,94\text{ s}$ so với lô bệnh lý ($20,81 \pm 0,38\text{ s}$, $p < 0,05$), không làm thay đổi các chỉ số PT và TT ($p > 0,05$).
2. Đóng góp khoa học và thực tiễn
- Lần đầu tiên triển khai, chuẩn hóa và đánh giá thành công mô hình gây huyết khối động mạch cảnh bằng dung dịch $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trên chuột nhắt trắng tại Việt Nam, cung cấp một quy trình thực nghiệm tin cậy cho các nghiên cứu sàng lọc thuốc chống đông cục bộ.
- Cung cấp bằng chứng thực nghiệm in vivo đầu tiên chứng minh tác dụng ức chế đông máu nội sinh và kéo dài thời gian chảy máu của viên Angobin bào chế từ Đương quy Nhật Bản di thực, khẳng định giá trị khoa học cho việc sử dụng Đương quy Nhật Bản thay thế Đương quy Trung Quốc trong phòng ngừa và điều trị các bệnh lý huyết khối tắc mạch.
3. Giải pháp và kiến nghị của tác giả
- Đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tác dụng chống kết tập tiểu cầu của Đương quy Nhật Bản trên mô hình gây đông máu bằng $\text{FeCl}_3$.
- Đề xuất mở rộng ứng dụng mô hình gây đông máu bằng $\text{FeCl}_3$ để đánh giá và sàng lọc tác dụng chống đông máu của các dược liệu và bài thuốc y học cổ truyền khác tại Việt Nam.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Khóa luận đã ghi nhận một số hạn chế khách quan dựa trên phạm vi và điều kiện thực hiện:
- Hạn chế về trang thiết bị theo dõi huyết khối trực tiếp: Do điều kiện kỹ thuật tại thời điểm nghiên cứu chưa cho phép, đề tài chưa thể thực hiện phương pháp siêu âm Doppler mạch máu để theo dõi liên tục các chỉ số huyết động học như tốc độ dòng máu, thời gian hình thành cục máu đông, thể tích khối huyết khối và thời gian tiêu tan cục máu đông tự nhiên trên động vật sống.
- Hạn chế của mô hình thực nghiệm $\text{FeCl}_3$: Thời gian hình thành huyết khối cục bộ do $\text{FeCl}_3$ diễn ra rất nhanh, đòi hỏi động vật thí nghiệm phải được cho uống thuốc dự phòng trước 7 ngày; đồng thời mô hình yêu cầu kỹ thuật phẫu thuật vi phẫu bộc lộ động mạch cảnh phức tạp hơn so với các mô hình tiêm tĩnh mạch thông thường.
- Phạm vi đánh giá cơ chế: Đề tài chủ yếu tập trung vào các chỉ số đông máu huyết tương tổng thể (APTT, PT, TT) và thời gian chảy máu, chưa tách biệt định lượng cụ thể hoạt tính của từng yếu tố đông máu nội sinh riêng lẻ hoặc hoạt tính ức chế enzyme cyclooxygenase/thromboxane synthase.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Tiến hành các thử nghiệm chuyên sâu nhằm đánh giá trực tiếp tác dụng chống kết tập tiểu cầu (in vitro và in vivo) của viên Angobin trên mô hình $\text{FeCl}_3$.
- Triển khai ứng dụng mô hình gây huyết khối bằng $\text{FeCl}_3$ để khảo sát hoạt tính chống đông trên các đối tượng dược liệu tiềm năng khác.
Giá trị tham khảo
Công trình khóa luận tốt nghiệp này mang lại giá trị tham khảo hữu ích cho nhiều đối tượng trong lĩnh vực y dược học:
- Sinh viên và học viên chuyên ngành Dược lý - Dược lâm sàng, Dược học cổ truyền: Là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp bố trí thí nghiệm đông máu in vitro (chuẩn bị huyết tương nghèo tiểu cầu, ủ mẫu, đo APTT, PT) và phương pháp đánh giá dược lý thực nghiệm in vivo.
- Các nghiên cứu viên phát triển thuốc từ dược liệu: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm về mối liên hệ liều - đáp ứng của Đương quy Nhật Bản di thực, quy trình quy đổi liều giữa người và động vật thí nghiệm, cũng như cơ chế tác dụng của nhóm coumarin tự nhiên lên các con đường đông máu.
- Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình phẫu thuật và thiết lập mô hình gây huyết khối động mạch cảnh bằng $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ trên chuột nhắt trắng (Chương 2), cùng các bảng số liệu so sánh chi tiết giữa thuốc thử Angobin với hai thuốc đối chứng chuẩn Heparin và Clopidogrel (Chương 3 và Chương 4).
Câu hỏi thường gặp
1. Thành phần công thức của một viên nén bao đường Angobin (500 mg) gồm những gì?
Theo hồ sơ công bố của Viện Dược liệu (SĐK: V55-H12-16) được trích dẫn trong khóa luận, một viên Angobin chứa: cao Đương quy di thực $0,13\text{ g}$, bột Đương quy di thực $0,14\text{ g}$, tinh dầu lá Đương quy di thực $0,0013\text{ g}$ và các tá dược (bột talc, magnesi carbonat, titan dioxyd, hydroxypropylmethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, gelatin, đường) vừa đủ $500\text{ mg}$.
2. Mô hình gây huyết khối động mạch cảnh bằng FeCl3 trên chuột nhắt trắng được thực hiện với các thông số kỹ thuật nào?
Chuột được gây mê bằng cloralhydrat liều $350\text{ mg/kg}$ tiêm màng bụng, bộc lộ động mạch cảnh chung trái và lót giấy bóng đen phía dưới. Một mảnh giấy lọc kích thước $2\times 2\text{ mm}$ bão hòa dung dịch $\text{FeCl}_3\ 7,5%$ được đặt trực tiếp lên động mạch cảnh trong 3 phút, sau đó bỏ giấy lọc. Đúng 8 phút kể từ khi bắt đầu đặt $\text{FeCl}_3$, tiến hành lấy máu động mạch cảnh để phân tích các chỉ số đông máu.
3. Tại sao cao Angobin in vitro làm kéo dài APTT nhưng không làm thay đổi PT?
Xét nghiệm APTT phản ánh hoạt tính của các yếu tố tham gia con đường đông máu nội sinh (yếu tố XII, XI, IX, VIII, X, V, II, I), trong khi PT phản ánh con đường đông máu ngoại sinh (yếu tố VII, X, V, II, I). Ở dải nồng độ thử nghiệm từ $1,25\text{ mg/mL}$ đến $5\text{ mg/mL}$, các hoạt chất trong cao Angobin thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc lên các yếu tố thuộc con đường nội sinh mà chưa tác động rõ rệt lên yếu tố VII của con đường ngoại sinh.
4. Sự khác biệt về đáp ứng của hai thuốc chứng dương Heparin và Clopidogrel trên mô hình in vivo là gì?
Heparin ($200\text{ UI/kg}$) là thuốc chống đông huyết tương tác động qua antithrombin III, do đó làm kéo dài có ý nghĩa các chỉ số APTT, PT và TT ($p < 0,05$), nhưng không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian chảy máu ($p > 0,05$). Ngược lại, Clopidogrel ($50\text{ mg/kg}$) là thuốc chống kết tập tiểu cầu ức chế thụ thể $\text{P2Y}_{12}$, do đó làm kéo dài rõ rệt thời gian chảy máu ($p < 0,001$) nhưng hoàn toàn không làm thay đổi các chỉ số đông máu huyết tương APTT, PT và TT ($p > 0,05$).
5. Hoạt chất nào trong Đương quy Nhật Bản được cho là đóng vai trò chính trong tác dụng chống đông máu?
Tác giả lý giải tác dụng ức chế đông máu của Đương quy Nhật Bản có sự đóng góp quan trọng của nhóm coumarin toàn phần (định lượng đạt $1,21%$, bao gồm umbelliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinellin, bergapten, bergaptol). Nhóm chất này có cấu trúc tương tự vitamin K, cạnh tranh gắn vào enzyme vitamin K-epoxide-reductase, làm suy giảm quá trình carboxyl hóa các tiền yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K (yếu tố II, VII, IX, X) tại gan.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Võ Thị Bích Ngọc đã chứng minh toàn diện tác dụng chống đông máu của Đương quy Nhật Bản di thực (Angelica acutiloba) trên cả hai hệ thống thực nghiệm in vitro (máu thỏ) và in vivo (chuột nhắt trắng). Kết quả chỉ ra rằng cao chiết và viên nén Angobin ức chế chọn lọc con đường đông máu nội sinh (kéo dài APTT) và tác động lên giai đoạn cầm máu ban đầu (kéo dài thời gian chảy máu), mà không ảnh hưởng đến con đường ngoại sinh (PT) hay giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin (TT). Công trình cũng ghi nhận việc thiết lập thành công mô hình gây huyết khối động mạch cảnh bằng $\text{FeCl}_3$ lần đầu tiên tại Việt Nam, đóng góp cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc cho việc sử dụng chế phẩm Angobin trong dự phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh lý huyết khối tắc mạch.
