Nghiên Cứu Tác Động Của Aspergillus Niger Đến Hoạt Động Enzym Amylase

Khám phá quy trình tạo chủng nấm mốc aspergillus niger đột biến với khả năng sinh enzym amylase cao, ứng dụng trong công nghiệp sinh học.

• Tác giả: Leâ Trung Phöông
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Thanh
• Trường học: Trường Đại Học Mở – Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Động Của Aspergillus Niger Đến Hoạt Động Enzym Amylase
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2000 - 2004
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tác Động Của Aspergillus Niger Đến Enzym Amylase

Nghiên cứu về Aspergillus niger và tác động của nó đến hoạt động của enzym amylase đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh học phân tử. Aspergillus niger là một loại nấm mốc phổ biến, được biết đến với khả năng sản xuất enzym amylase, một enzym quan trọng trong quá trình phân giải tinh bột thành đường. Việc hiểu rõ về mối quan hệ này không chỉ giúp cải thiện quy trình sản xuất enzym mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và y tế.

1.1. Định Nghĩa Về Aspergillus Niger Và Enzym Amylase

Nấm Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc phổ biến nhất, có khả năng sinh sản nhanh chóng và sản xuất nhiều loại enzym, trong đó có amylase. Enzym amylase là một loại enzym thủy phân, có vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường đơn giản như glucose và maltose.

1.2. Vai Trò Của Enzym Amylase Trong Công Nghiệp

Enzym amylase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm để sản xuất đường từ tinh bột. Nó cũng có ứng dụng trong ngành dược phẩm, nơi nó được sử dụng để sản xuất các sản phẩm như dung dịch tiêm truyền glucose.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tác Động Của Nấm

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về Aspergillus niger, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc tối ưu hóa quy trình sản xuất enzym amylase. Các yếu tố như điều kiện môi trường, nguồn dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy đều ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất enzym. Việc tìm ra các điều kiện tối ưu là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả sản xuất.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hoạt Động Của Enzym

Nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ chất dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzym amylase. Việc xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của Aspergillus niger là rất quan trọng để nâng cao hiệu suất sản xuất enzym.

2.2. Thách Thức Trong Việc Tinh Chế Enzym

Quá trình tinh chế enzym amylase từ Aspergillus niger có thể gặp nhiều khó khăn, bao gồm việc loại bỏ các tạp chất và tối ưu hóa quy trình thu hồi. Điều này đòi hỏi các phương pháp tinh chế hiệu quả và tiết kiệm chi phí.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Động Của Aspergillus Niger

Để nghiên cứu tác động của Aspergillus niger đến hoạt động của enzym amylase, các phương pháp thí nghiệm được áp dụng bao gồm nuôi cấy nấm trong các điều kiện khác nhau và đo lường hoạt động enzym. Các thí nghiệm này giúp xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất enzym.

3.1. Phương Pháp Nuôi Cấy Nấm

Nấm Aspergillus niger được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa sự phát triển và sản xuất enzym amylase. Các điều kiện như nhiệt độ, pH và nồng độ chất dinh dưỡng được điều chỉnh để đạt được hiệu suất cao nhất.

3.2. Phương Pháp Đo Lường Hoạt Động Enzym

Hoạt động của enzym amylase được đo lường thông qua các phương pháp phân tích hóa học, cho phép xác định hiệu suất và khả năng thủy phân của enzym trong các điều kiện khác nhau.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Tác Động Của Aspergillus Niger

Kết quả nghiên cứu cho thấy Aspergillus niger có khả năng sản xuất enzym amylase cao trong các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Các thí nghiệm cho thấy rằng việc điều chỉnh pH và nhiệt độ có thể làm tăng đáng kể hoạt động của enzym, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất.

4.1. Kết Quả Về Hoạt Động Enzym

Các thí nghiệm cho thấy rằng enzym amylase sản xuất từ Aspergillus niger có hoạt động cao nhất ở pH 5.5 và nhiệt độ 30 độ C. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để cải thiện quy trình sản xuất đường từ tinh bột, từ đó nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

V. Kết Luận Về Tác Động Của Aspergillus Niger Đến Enzym Amylase

Nghiên cứu về Aspergillus niger và tác động của nó đến enzym amylase đã chỉ ra rằng nấm này có khả năng sản xuất enzym cao trong các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Việc hiểu rõ về mối quan hệ này không chỉ giúp cải thiện quy trình sản xuất enzym mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và y tế.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Aspergillus Niger

Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để tối ưu hóa sản xuất enzym amylase từ Aspergillus niger, cũng như khám phá các ứng dụng mới trong các lĩnh vực khác nhau.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Enzym Amylase Trong Ngành Công Nghiệp

Enzym amylase đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp, từ thực phẩm đến dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất enzym này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả và giảm chi phí trong sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu hàng năm tiêu thụ hàng chục vạn tấn chế phẩm sinh học, trong đó nhóm enzyme thủy phân amylase chiếm tỷ trọng trên 30% tổng sản lượng thương mại. Mặc dù khoa học hiện đại đã ghi nhận hơn 2.000 loại enzyme khác nhau, chỉ có khoảng 200 loại được tinh chế và sản xuất ở quy mô công nghiệp phục vụ đời sống. Phương pháp truyền thống trích ly amylase từ mô động vật và thực vật bộc lộ nhiều hạn chế về chi phí cao, nguồn nguyên liệu phân tán và hiệu suất thu hồi thấp. Do đó, việc khai thác vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm, trở thành hướng tiếp cận đột phá nhờ tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng tiết enzyme ngoại bào dồi dào.

Nghiên cứu tập trung giải quyết bài toán nâng cao hoạt lực sinh tổng hợp enzyme amylase của chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập từ tự nhiên. Mục tiêu trọng tâm bao gồm: phân lập dòng nấm thuần khiết, ứng dụng phương pháp đột biến thực nghiệm bằng bức xạ tử ngoại kết hợp hóa chất hỗ trợ, khảo sát động học lên men trên cơ chất phụ phẩm nông nghiệp và tối ưu hóa quy trình tinh sạch chế phẩm enzyme thu hồi.

Phạm vi thực nghiệm được triển khai đồng bộ tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh phối hợp cùng Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở – Bán công Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn 2000 - 2004. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn sâu sắc khi nâng cao hoạt độ thủy phân tinh bột của chủng nấm đột biến lên 1,5 đến 2,2 lần so với chủng ban đầu, đồng thời giảm 35% đến 40% chi phí nguyên liệu nuôi cấy thông qua tận dụng 85% cám gạo và 15% trấu thô, mở ra triển vọng tự chủ nguồn men đường hóa chất lượng cao cho thị trường trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết enzyme học hiện đại và di truyền học vi sinh vật ứng dụng:

1. Lý thuyết xúc tác sinh học và động học phức hợp enzyme - cơ chất: Enzyme có bản chất là protein với phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000 Da. Quá trình xúc tác tuân theo mô hình ba giai đoạn: tạo phức hợp enzyme - cơ chất trung gian với năng lượng hoạt hóa thấp, biến đổi liên kết hóa học và giải phóng sản phẩm cùng enzyme tự do. Tốc độ phản ứng phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ tối ưu 40°C đến 50°C và vùng pH tối thích từ 4,5 đến 6,5.
2. Cơ chế thủy giải của hệ enzyme amylase: Hệ enzyme bao gồm endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase (α-amylase, EC 3.2.1.1) thủy phân ngẫu nhiên liên kết alpha-1,4-glucosid giải phóng maltose và dextrin, kết hợp cùng glucoamylase (EC 3.2.1.3) cắt liên kết alpha-1,4 và alpha-1,6 từ đầu không khử để tạo glucose.
3. Nguyên lý đột biến bức xạ vật lý và cảm ứng sinh học: Chiếu xạ tia cực tím gây đứt gãy hoặc bắt cặp sai lệch trên chuỗi DNA, thúc đẩy đột biến cấu trúc gen điều hòa sinh tổng hợp enzyme. Song song đó, việc bổ sung cơ chất cảm ứng tinh bột trong môi trường kích thích tế bào tăng cường phiên mã và bài xuất enzyme ra ngoại bào.

Phương pháp nghiên cứu

Thực nghiệm lựa chọn 6 mẫu nấm mốc thu thập từ không khí và nông sản, tiến hành thanh lọc và tuyển chọn 1 dòng thuần Aspergillus niger có khả năng sinh amylase vượt trội. Quy trình phân tích định lượng dựa trên phương pháp Heinkel đo độ giảm mật độ quang của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 560 nm trên máy quang phổ, đối chiếu qua đường chuẩn hồi quy tuyến tính $y = 5,4045x$. Phương pháp này được lựa chọn vì độ lặp lại cao, phản ánh chính xác khối lượng tinh bột bị thủy giải sau 30 phút ở 30°C mà không bị ảnh hưởng bởi đường khử.

Timeline thực nghiệm kéo dài qua 5 giai đoạn liên tục:

• Giai đoạn 1: Phân lập dòng thuần trên thạch nghiêng Sabouraud trong 2 đến 3 ngày.
• Giai đoạn 2: Đột biến mẫu huyền phù mật độ $10^7$ bào tử/ml bằng đèn UV bước sóng 254 nm ở khoảng cách 5 cm với 6 mốc thời gian (1, 2, 3, 4, 5, 6 phút), kết hợp 3 nồng độ chất phân tán Tween 80 (0,1%, 0,01%, 0,001%).
• Giai đoạn 3: Sàng lọc sơ bộ qua đường kính vòng phân giải tinh bột sau 10 đến 15 giờ xử lý dung dịch Lugol 1%.
• Giai đoạn 4: Lên men bán rắn trên khay chứa 85% cám gạo và 15% trấu ở độ ẩm 60% đến 65% trong 96 giờ tại nhiệt độ 28°C đến 32°C.
• Giai đoạn 5: Thử nghiệm tinh sạch bằng phương pháp kết tủa cồn 96 độ tỷ lệ 1:3, kết tủa muối amoni sulfat 70% và sắc ký hấp phụ trên natri alginate 2%, sau đó sấy đông khô để bảo quản hoạt tính.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được 4 phát hiện khoa học quan trọng:

1. Quy luật bất hoạt và tần số đột biến tối ưu: Khi chiếu xạ UV ở khoảng cách 5 cm, thời gian chiếu từ 4 đến 5 phút với nồng độ Tween 80 0,1% đem lại hiệu quả chọn lọc tốt nhất. Tỷ lệ bào tử sống sót giảm còn khoảng 0,01% đến 0,05%, tạo ra các biến chủng có đường kính vòng thủy giải mở rộng từ 18 mm lên 28 đến 32 mm, tương ứng mức tăng 55% đến 77% so với chủng ban đầu.
2. Năng suất sinh tổng hợp amylase cực đại: Trong hệ thống nuôi cấy bán rắn 96 giờ, chủng đột biến đạt hoạt độ cực đại 8,5 đến 9,2 UI/ml, tăng vượt bậc 65% so với mức 5,1 đến 5,5 UI/ml của dòng Aspergillus niger hoang dã.
3. Hiệu quả tinh sạch của hạt mang Natri Alginate: Phương pháp sắc ký hấp phụ chọn lọc trên gel natri alginate 2% kết tủa bằng $CaCl_2$ 0,7 M và giải hấp bằng dung dịch glucose 1 M giúp tăng độ tinh sạch của enzyme lên 4,2 lần. Kết quả này vượt trội hơn hẳn phương pháp kết tủa cồn 96 độ (tăng 2,1 lần) và tủa muối amoni sulfat 70% (tăng 2,8 lần).
4. Đảm bảo an toàn độc tố sinh học: Thử nghiệm trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt AFPA trong 5 đến 7 ngày cho thấy mặt sau khuẩn lạc không xuất hiện màu vàng cam đặc trưng, khẳng định 100% chủng đột biến không sản sinh độc tố aflatoxin.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng hoạt tính sinh học của biến chủng được lý giải bởi tác động cộng hưởng của tia UV 254 nm lên các chuỗi nucleotide kiểm soát biểu hiện gen amylase, trong khi chất hoạt động bề mặt Tween 80 nồng độ 0,1% giúp phân tán đồng đều cụm bào tử, tăng khả năng tiếp xúc bức xạ. Môi trường bán rắn chứa cám gạo cung cấp dồi dào khoáng chất (magie, photpho, canxi) và vitamin nhóm B đóng vai trò then chốt làm coenzyme kích hoạt trung tâm hoạt động của protein enzyme.

Động học quá trình lên men được biểu diễn trực quan qua đồ thị biểu diễn biến thiên hoạt độ theo thời gian. Đường cong sinh trưởng cho thấy hoạt độ enzyme tăng chậm từ 0 đến 24 giờ, bùng nổ mạnh mẽ trong giai đoạn 48 đến 72 giờ và đạt đỉnh ở 96 giờ, hoàn toàn trùng khớp với thời điểm nấm mốc hình thành đính bào tử dày đặc màu đen. Bảng số liệu đối chiếu hiệu suất thu hồi khẳng định cơ chế bắt giữ phân tử của mạng lưới alginate giúp loại bỏ triệt để protein tạp mà không làm biến tính tâm xúc tác. So với các báo cáo trong nước cùng thời kỳ, nghiên cứu đã rút ngắn 24 giờ thời gian lên men và nâng cao 25% hiệu suất thu hồi chế phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, 4 giải pháp công nghệ mang tính ứng dụng cao được đề xuất:

1. Chuẩn hóa quy trình tạo giống đột biến quy mô pilot: Phòng nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học cần thiết lập quy trình chiếu xạ UV kết hợp nồng độ Tween 80 0,1% tự động hóa trong các bình phản ứng kín 50 lít, đặt mục tiêu nâng hoạt độ ngoại bào vượt mốc 12,0 UI/ml trong vòng 6 đến 12 tháng tới.
2. Tối ưu hóa công thức cơ chất phụ phẩm nông nghiệp: Các đơn vị sản xuất men vi sinh nên triển khai công thức lên men bán rắn phối trộn 80% cám gạo, 15% vỏ trấu và 5% bột ngô, duy trì độ ẩm 62% đến 65% nhằm hạ giá thành nguyên liệu 30% trong lộ trình 3 tháng.
3. Ứng dụng công nghệ tinh sạch dòng liên tục: Kỹ sư vận hành xưởng chế phẩm sinh học cần tích hợp hệ thống hấp phụ hạt natri alginate tuần hoàn có khả năng tái sử dụng chất mang từ 3 đến 5 chu kỳ, cam kết đạt hiệu suất thu hồi enzyme trên 85% trong khung thời gian 9 tháng.
4. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng dược dụng: Ban quản lý chất lượng và các viện nghiên cứu dược liệu cần phối hợp hoàn thiện bộ tiêu chuẩn cơ sở về hoạt độ men, độ tinh khiết và giới hạn kim loại nặng, hướng tới đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất GMP trong 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng:

1. Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Vi sinh, Công nghệ Sinh học: Tiếp cận quy trình bài bản từ khâu phân lập, kỹ thuật gây đột biến bức xạ tử ngoại, định lượng quang phổ Heinkel đến xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng.
2. Kỹ sư vận hành tại các nhà máy bia, rượu, cồn và chế biến tinh bột: Ứng dụng nguồn giống nấm mốc biến dị có hoạt lực cao để tự sản xuất chế phẩm men dịch hóa và đường hóa, tiết kiệm 20% đến 35% chi phí mua enzyme thương phẩm nhập ngoại.
3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Khai thác dữ liệu kiểm định môi trường AFPA và phương pháp sấy đông khô để bào chế men tiêu hóa dạng bột đạt độ ổn định hoạt tính trên 90% sau 12 tháng bảo quản.
4. Các chuyên gia nghiên cứu công nghệ enzyme và protein học: Sử dụng khung lý thuyết về sắc ký hấp phụ trên chất mang polymer tự nhiên để mở rộng ứng dụng trên các hệ enzyme công nghiệp khác như protease, cellulase và pectinase.

Câu hỏi thường gặp

Tia UV bước sóng 254 nm mang lại ưu thế gì trong quá trình gây đột biến vi nấm? Bức xạ tử ngoại 254 nm tác động trực tiếp lên cấu trúc nucleic acid, tạo liên kết dimer thymine gây biến đổi cấu trúc operon mã hóa enzyme. Nghiên cứu thực nghiệm chứng minh thời gian chiếu 4 đến 5 phút tạo ra các thể đột biến sinh enzyme vượt trội với tỷ lệ sống sót ổn định từ 0,01% đến 0,05%.

Phương pháp định lượng Heinkel có ưu điểm gì so với các kỹ thuật so màu khác? Phương pháp Heinkel định lượng dựa trên mức độ suy giảm cường độ màu xanh tím của phức hợp tinh bột - iod ở bước sóng 560 nm. Phương pháp này có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng với hệ số đường chuẩn chuẩn xác, hạn chế tối đa sai số do sản phẩm đường khử sinh ra trong phản ứng.

Vì sao môi trường lên men bán rắn cám gạo kết hợp vỏ trấu lại đạt hiệu quả kinh tế cao? Cám gạo cung cấp nguồn carbon, nitơ hữu cơ, vitamin nhóm B và khoáng chất dồi dào, trong khi trấu 15% tạo độ xốp thông khí tối ưu cho sợi nấm hiếu khí. Môi trường này giúp giảm hơn 35% chi phí so với môi trường tổng hợp nhưng vẫn đạt hoạt độ 8,5 đến 9,2 UI/ml.

Mục đích của việc kiểm tra nấm mốc trên môi trường chẩn đoán AFPA là gì? Môi trường AFPA chứa sắt amino citrat và kháng sinh chuyên biệt để phát hiện độc tố aflatoxin nguy hiểm từ nấm mốc. Chủng nấm mốc Aspergillus niger đột biến trong nghiên cứu hoàn toàn không làm đổi màu môi trường sang vàng cam, chứng minh an toàn tuyệt đối cho chế biến thực phẩm.

Cơ chế tinh sạch enzyme bằng hạt gel Natri Alginate diễn ra như thế nào? Natri alginate 2% liên kết đặc hiệu với phân tử amylase tạo phức bền, sau đó được kết tủa bằng $CaCl_2$ 0,7 M. Khi bổ sung glucose 1 M, liên kết bị phá vỡ để giải phóng enzyme tinh khiết vào dung dịch, giúp tăng độ tinh sạch lên 4,2 lần so với dịch thô ban đầu.

Kết luận

• Phân lập thành công chủng Aspergillus niger thuần chủng và xác định điều kiện đột biến tối ưu bằng bức xạ tử ngoại UV 254 nm trong 4 đến 5 phút với chất phân tán Tween 80 0,1%.
• Nâng cao hoạt độ sinh tổng hợp enzyme amylase ngoại bào của chủng đột biến đạt 8,5 đến 9,2 UI/ml, tăng hơn 65% so với chủng đối chứng chưa đột biến.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình lên men bán rắn trên 85% cám gạo và 15% trấu ở độ ẩm 60% trong 96 giờ, giúp tận dụng triệt để nguồn phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ.
• Ứng dụng thành công công nghệ tinh sạch enzyme bằng sắc ký hấp phụ trên natri alginate 2%, nâng độ sạch lên 4,2 lần và giữ vững hơn 90% hoạt lực sau khi sấy đông khô.
• Chứng minh 100% dòng nấm đột biến âm tính với độc tố aflatoxin trên môi trường AFPA, bảo đảm tiêu chuẩn an toàn sinh học công nghiệp.

Luận văn đã đóng góp một giải pháp công nghệ sinh học hoàn chỉnh từ khâu tuyển chọn giống đến tinh chế sản phẩm men đường hóa. Trong lộ trình 12 tháng tới, các cơ sở sản xuất cần nhanh chóng mở rộng thử nghiệm ở quy mô pilot 500 lít. Độc giả và các đơn vị sản xuất quan tâm hãy kết nối hợp tác chuyển giao công nghệ để đưa chế phẩm sinh học chất lượng cao này vào ứng dụng sản xuất thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOÄ GIAÙO DUÏC & ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TPHCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC ÑEÀ TAØI : TAÏO CHUÛNG NAÁM MOÁC ASPERGILLUS NIGER ÑOÄT BIEÁN COÙ KHAÛ NAÊNG SINH ENZYM AMYLASE CAO LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC CHUYEÂN NGAØNH : VI SINH Giaûng Vieân Höôùng Daãn : PGS. NGUYEÃN VAÊN THANH DS. LEÂ THÒ THANH THAÛO Sinh Vieân Thöïc Hieän : LEÂ TRUNG PHÖÔNG Khoùa Hoïc : 2000 - 2004 Lôøi caûm ôn Em xin caûm ôn thaày PGS. Nguyeãn Vaên Thanh vaø DS.

Leâ Thò Thanh Thaûo ñaõ taän tình höôùng daãn em trong suoát thôøi gian laøm ñeà taøi ñeå em coù theå hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Em xin caûm ôn caùc thaày coâ trong phoøng thí nghieäm boä moân Vi – Kí sinh, Khoa Döôïc Tröôøng Ñaïi Hoïc Y Döôïc ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi ñeå em coù theå ñöôïc thöïc taäp vaø hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Vaø em xin caûm ôn thaày coâ khoa Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng ÑH Môû- Baùn Coâng Tp. HCM ñaõ taïo moïi ñieàu kieän cho em ñöôïc hoïc taäp taïi tröôøng trong suoát thôøi gian qua.

MUÏC LUÏC Lôøi caûm ôn Muïc luïc YÙ kieán giaùo vieân Lôøi môû ñaàu Phaàn I : Toång quan taøi lieäu 1. Khaùi nieäm chung .1 Ñònh nghóa enzym .2 Nguoàn nguyeân lieäu ñeå thu enzym .3 Tính chaát hoùa lyù .1 Trung taâm hoaït ñoäng enzym .2 Cöôøng löïc xuùc taùc .2 Tính ñaëc hieäu xuùc taùc cuûa enzym .4 Cô cheá taùc duïng cuûa enzym .5 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym .1 Noàng ñoä cô chaát vaø enzym .3 Chaát hoaït hoùa .5 pH moâi tröôøng .4 Xaùc ñònh ñoä hoaït ñoäng enzym .2 Ñôn vò hoaït ñoä cuûa enzym .5 Phöông phaùp taùch vaø laøm saïch enzym. Toång quan veà amylase .1 Ñònh nghóa veà amylase 3.4 Dextrinase tôùi haïn .3 Caùc vi sinh vaät sinh amylase .4 Sinh toång hôïp amylase ôû vi sinh vaät .1 AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn moâi tröôøng tôùi sinh toång hôïp amylase .2 Nguoàn nitô dinh döôõng .3 Caùc acid amin .4 Nguoàn khoaùng dinh döôõng.2 Ñieàu kieän nuoâi vi sinh vaät tôùi sinh toång hôïp amylase.1 Haøm aåm cuûa moâi tröôøng .3 pH moâi tröôøng .4 Thôøi gian nuoâi caáy ñeå coù löôïng enzym amylase cöïc ñaïi .5 Chaát caûm öùng .5 ÖÙng duïng cuûa enzym amylase. Toång quan Aspergillus niger .1 Vò trí phaân loaïi Aspergillus niger .3 Ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa A.4 Taùc haïi cuûa naám moác A.5 ÖÙng duïng cuûa A.

21 Phaàn 2 : Vaät lieäu – phöông phaùp nghieân cöùu .1 Moâi tröôøng thí nghieäm .1 Moâi tröôøng giöõ goác naám moác thaïch nghieâng Sabouraud .2 Moâi tröôøng phaân laäp .3 Moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác sinh amylase .1 Moâi tröôøng baùn raén .2 Moâi tröôøng loûng .4 Moâi tröôøng AFPA .2 Vaät lieäu thöû hoaït tính sinh hoïc .3 Vaät lieäu ñoät bieán .4 Vaät lieäu taùch chieát enzym amylase. Duïng cuï thí nghieäm. Boá trí thí nghieäm.1 Phaân laäp doøng thuaàn .3 Thöû hoaït ñoä tröôùc vaø sau ñoät bieán .4 Nuoâi caáy doøng ñoät bieán coù hoaït ñoä amylase cao .5 Chieát taùch, thu vaø tinh saïch enzym amylase. Phöông phaùp .1 Phöông phaùp phaân laäp vaø phaùt hieän chuûng naám moác coù amylase ngoaïi baøo.2 Caùch tieán haønh .2 Phöông phaùp tieán haønh ñoät bieán baèng tia UV.3 Phöông phaùp ñoät bieán hoùa hoïc baèng taùc nhaân chaát dinh döôõng .2 Tieán haønh .4 Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä thuûy phaân tinh boät .2 Tieán haønh .3 Caùch tính keát quaû .4 Laäp ñoà thò chuaån.5 Phöông phaùp nuoâi caáy doøng ñoät bieán .1 Nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng baùn raén .2 Nuoâi caáy trong moâi tröôøng loûng .6 Phöông phaùp thöû khaû naêng sinh aflatoxin naám moác .1 Caùch tieán haønh .2 Ñoïc keát quaû .7 Phöông phaùp chieát taùch, thu vaø tinh saïch enzym amylase .1 Phöông phaùp haáp phuï treân Na-alginate .1 Nuoâi caáy beà maët .2 Nuoâi caáy loûng .2 Phöông phaùp thu nhaän cheá phaåm enzym thoâ töø canh tröôøng naám moác vôùi taùc nhaân tuûa laø coàn 96o .3 Phöông phaùp thu nhaän cheá phaåm enzym thoâ töø canh tröôøng naám moác vôùi taùc tuûa laø muoái amoni sunfat .8 Baûo quaûn enzym baèng phöông phaùp ñoâng khoâ.

34 Phaàn 3 : Keát quaû – bieän luaän 1. Phaân laäp chuûng naám Aspergillus niger ñeå nghieân cöùu. Keát quaû khaûo saùt hoaït tính sinh amylase tröôùc khi ñoät bieán cuûa chuûng A theo thôøi gian. Keát quaû ñoät bieán .1 Ñoät bieán naám moác theo noàng ñoä Tween 80 vaø thôøi gian chieáu tia UV .2 Thöû sô boä hoaït ñoä thuûy phaân tinh boät .1 ÔÛ noàng ñoä Tween 80 0,1 % .2 ÔÛ noàng ñoä Tween 80 0,01 % .3 ÔÛ noàng ñoä Tween 80 0,001 % .3 Nhaän xeùt chung.

Khaûo saùt hoaït tính sinh enzym amylase sau ñoät bieán theo thôøi gian baèng phöông phaùp Heinkel ôû noàng ñoä Tween 80 0,1 %. Khaûo saùt hình thaùi cuûa chuûng ñoät bieán so vôùi chuûng ban ñaàu. So saùnh cuûa ñoät bieán UV vaø ñoät bieán dinh döôõng. Tinh cheá vaø baûo quaûn enzym amylase .1 So saùnh tinh saïch baèng natri alginate vaø caùc phöông phaùp tinh saïch thoâng thöôøng khaùc (coàn, muoái sunfat) .2 Baûo quaûn enzym amylase baèng phöông phaùp ñoâng khoâ.

Thöû hoaït tính aflatoxin cuûa chuûng ñoät bieán coù khaû naêng sinh enzym amylase cao. 47 Phaàn 4 : Keát luaän – ñeà nghò. 49 Hình aûnh minh hoïa Taøi lieäu tham khaûo DANH MUÏC BAÛNG TRONG LUAÄN VAÊN Phaàn 2 Trang Baûng 4.1 : Ñoà thò tieâu chuaån ñeå ñònh löôïng tinh boät .1 : Hoaït löïc cuûa caùc chuûng naám moác baét ñöôïc .1 : Hoaït löïc sinh enzym amylase cuûa chuûng naám moác choïn ñeå nghieân cöùu .1 : Keát quaû soá baøo töû soáng soùt sau khi ñoät bieán theo thôøi gian chieáu tia UV vaø noàng ñoä Tween 80 .2 : Keát quaû thöû voøng thuûy giaûi tinh boät ôû noàng ñoä Tween 0,1% .3 : Keát quaû thöû voøng thuûy giaûi tinh boät ôû noàng ñoä Tween 0,01% .1 : Hoaït ñoä thuûy phaân tinh boät cuûa caùc chuûng naám theo thôøi gian ôû noàng ñoä Tween 80 0,1 % .1 : Hoaït ñoä cuûa amylase sau khi tinh saïch .2 : Hoaït tính saûn phaåm enzym tröôùc vaø sau khi ñoâng khoâ .1 : Khaû naêng sinh ñoäc toá aflatoxin cuûa chuûng ñoät bieán. 47 DANH MUÏC BIEÅU ÑOÀ Phaàn 2 : Trang Bieåu ñoà 4.1: Ñöôøng chuaån ñònh löôïng tinh boät.

30 Phaàn 3 : Bieåu ñoà 1.1 : Hoaït löïc cuûa caùc chuûng naám moác baét ñöôïc .1 : Hoaït löïc sinh amylase cuûa chuûng naám moác choïn ñeå nghieân cöùu .1 : Hoaït ñoä thuûy phaân tinh boät cuûa caùc chuûng naám theo thôøi gian ôû noàng ñoä Tween 80 0,1 % .1 : Hoaït ñoä cuûa amylase sau tinh saïch. 45 DANH MUÏC HÌNH MINH HOÏA Phaàn 2 : .1 : Giai maãu ñeå xaùc ñònh ñöôøng chuaån .1 : Maët treân vaø döôùi cuûa Aspergillus niger treân moâi tröôøng Sabouraud .2 : Aspergillus niger nhìn döôùi kính hieån vi (X40) .1 : Maët treân vaø maët döôùi khuaån laïc cuûa chuûng ñoät bieán .2 : Chuûng ñoät bieán nhìn döôùi kính hieån vi (X40) .1 : Thöû aflatoxin cuûa chuûng naám ñoät bieán treân moâi tröôøng AFPA. 47 YÙ kieán cuûa giaùo vieân --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------- ĐẶT VAN ĐỀ Ñeå thuùc ñaåy caùc quaù trình phaân giaûi vaø toång hôïp hoaït chaát sinh hoïc, ngaøy nay ngöôøi ta coù xu höôùng söû duïng xuùc taùc sinh hoïc thay cho chaát xuùc taùc hoùa hoïc vaø vaät lyù, maø trong ñoù chuû yeáu laø söû duïng enzym vi sinh vaät. Enzym coù hieäu löïc xuùc taùc raát lôùn, ôû ñieàu kieän thích hôïp caùc phaûn öùng coù enzym xuùc taùc xaûy ra nhanh gaáp nhieàu laàn nhöõng phaûn öùng cuøng loaïi khoâng söû duïng enzym.

Ñaëc bieät enzym coù theå xuùc taùc ngay ôû nhieät ñoä thöôøng vôùi tính ñaëc hieäu cao hôn so vôùi chaát xuùc taùc hoùa hoïc. Do ñoù nhu caàu veà enzym raát lôùn. Vaø hieän nay coù raát nhieàu nghieân cöùu veà enzym ñaõ vaø ñang ñöôïc tieán haønh nhaèm ñaùp öùng roäng raõi nhu caàu naøy. Caùc enzym söû duïng phoå bieán nhaát laø thuoäc nhoùm thuûy phaân vaø trong ñoù amylase laø enzym thuûy phaân ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát.

Ngöôøi ta söû duïng amylase ñeå saûn xuaát dòch glucose, tinh theå glucose, ñöôøng maltose. Ñaëc bieät trong ngaønh y döôïc noù coù raát nhieàu öùng duïng. Ví duï, saûn xuaát glucose ñeå pha dung dòch tieâm truyeàn, chuyeån hoùa tinh boät thaønh dextrin, tinh boät tan ñeå laøm taù döôïc. Tröôùc ñaây enzym amylase chuû yeáu ñöôïc chieát xuaát töø moâ ñoäng thöïc vaät, giaù thaønh cao vaø tinh cheá khoù khaên.

Ngaøy nay, ngöôøi ta chuû yeáu duøng vi sinh vaät ñeå saûn xuaát enzym amylase. Vì vi sinh vaät coù toác ñoä sinh tröôûng maïnh, nhanh, heä enzym phong phuù, nguyeân lieäu deã kieám vaø reû tieàn, nhieàu vi sinh vaät coù enzym ngoaïi baøo neân vieäc taùch vaø tinh cheá deã daøng. Loaïi enzym naøy ñöôïc toång hôïp vôùi soá löôïng lôùn trong naám moác Aspergillus niger. Töø thöïc teá ñoù chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu ñeà taøi : “Taïo chuûng naám moác Aspergillus niger ñoät bieán coù khaû naêng sinh enzym amylase cao”.

Nhaèm goùp phaàn xaây döïng nhöõng cô sôû cho vieäc saûn xuaát enzym naøy. Ñeà taøi ñöôïc thöïc hieän vôùi caùc muïc tieâu sau : o Phaân laäp nhöõng chuûng naám moác Aspergillus niger coù khaû naêng sinh amylase. o Ñoät bieán chuûng naám moác baèng taùc nhaân laø tia UV. o Tinh saïch vaø thu amylase.

PHAÀN 1 : TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU SVTT : Leâ Trung Phöông 1. KHAÙI QUAÙT [6] Naêm 1814, Kiecgov ñaõ chöùng minh raèng nöôùc chieát töø haït luùa maïch naûy maàm coù taùc duïng chuyeån hoùa tinh boät thaønh ñöôøng ôû nhieät ñoä töø 40 – 60oC. Tieáp theo, Robiquet vaø Boutron Chalard (1830) ñaõ moâ taû taùc duïng thuûy phaân Amiladin cuûa reã haïnh nhaân ñaéng. Leuche (1851) ñaõ phaùt hieän hoaït ñoäng phaân giaûi tinh boät cuûa nöôùc boït.

Naêm 1833, Payen vaø Pepso (Phaùp) laàn ñaàu tieân taùch ñöôïc cheá phaåm amylase ôû daïng keát tuûa baèng caùch theâm coàn vaøo dòch chieát töø haït luùa naûy maàm. Naêm 1906, Otto Rohm laø ngöôøi ñaàu tieân nghieân cöùu veà vieäc söû duïng saûn phaåm enzym vaøo coâng nghieäp, oâng ñaõ duøng moâ tuyeán tuî ñeå thu nhaän trypsin söû duïng trong coâng nghieäp thuoäc da. Summer laø nhaø sinh hoùa hoïc cuûa Myõ ñaõ thaønh coâng trong vieäc taùch chieát vaø keát tinh urease daïng tinh theå töø cao moät loaïi ñaäu coù teân laø Jack- bean. Northop laø nhaø Sinh hoaù hoïc ngöôøi Myõ ñaõ thaønh coâng trong vieäc taùch chieát vaø taïo ra tinh theå pepsin vaø trypsin.

KHAÙI NIEÄM CHUNG 2. Ñònh nghóa enzym [6] Enzym hay coøn goïi laø men laø chaát xuùc taùc sinh hoïc coù baûn chaát laø protein. Döôùi taùc duïng cuûa enzym caùc phaûn öùng hoùa sinh trong cô theå xaûy ra raát nhanh khoâng caàn caùc ñieàu kieän nhieät ñoä, aùp suaát cao vaø noàng ñoä acid hay kieàm ñaëc.