Nghiên cứu quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus nghiên cứu xây dựng quy trình realtime rt pcr chẩn đoán vi rút ev71 gây bệnh tay chân miệng ở, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Trần Văn Thịnh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hội
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng
• 1.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam
• 1.2.1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới
• 1.2.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam
• 1.3. Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71
• 1.3.1. Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.4. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe để khuếch đại gen đặc trưng của Vi rút EV71
• 2.4.1. Các nguyên tắc thiết kế mồi
• 2.4.2. Các nguyên tắc thiết kế Probe
• 2.4.3. Các phần mềm sử dụng
• 2.5. Phương pháp tiến hành
• 2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71
• 2.5.2. Phản ứng Realtime RT-PCR
• 2.5.3. Phương pháp điện di
• 2.6. Tối ưu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng
• 2.6.1. Phương pháp RT-PCR nhân gen đặc trưng của virus EV71
• 2.6.2. Tối ưu nhiệt độ kéo dài
• 2.6.3. Tối ưu nồng độ Magie
• 2.7. Xác định độ nhạy của phản ứng Realtime RT-PCR
• 2.7.1. Phương pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid
• 2.7.2. Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR
• 2.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng trên các chủng vi rút khác nhau
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân tích, so sánh trình tự bằng phần mềm ClustalX
• 3.2. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò
• 3.3. Kết quả khảo sát hoạt động của hệ mồi trên thực nghiệm
• 3.4. Kết quả tối ưu nhiệt độ của phản ứng RT-PCR
• 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ Magie của phản ứng RT-PCR
• 3.6. Kết quả khuếch đại và đường chuẩn của phản ứng RT-PCR
• 3.7. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng
• 3.8. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên virut EV71 nuôi cấy
• 3.9. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime RT-PCR trên các chủng vi rút khác nhau
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình Realtime RT PCR chẩn đoán vi rút EV71

Bệnh tay chân miệng (TCM) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là do vi rút EV71 gây ra. Việc chẩn đoán sớm và chính xác là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng. Quy trình Realtime RT-PCR đã được phát triển như một phương pháp hiệu quả để xác định sự hiện diện của vi rút EV71 trong mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

1.1. Khái niệm về Realtime RT PCR và ứng dụng trong chẩn đoán

Realtime RT-PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát hiện và định lượng RNA của vi rút trong thời gian thực. Kỹ thuật này sử dụng Taqman probe để khuếch đại gen đặc trưng của vi rút EV71, giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của vi rút trong mẫu bệnh phẩm. Việc áp dụng Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh tay chân miệng đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

1.2. Tại sao Realtime RT PCR là phương pháp ưu việt

Phương pháp Realtime RT-PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi rút. Đầu tiên, thời gian thực hiện xét nghiệm ngắn hơn, chỉ mất vài giờ thay vì vài ngày. Thứ hai, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cao hơn, giúp giảm thiểu tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả. Cuối cùng, kỹ thuật này có thể phát hiện vi rút ở giai đoạn sớm, từ đó giúp điều trị kịp thời và hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán bệnh tay chân miệng

Bệnh tay chân miệng do vi rút EV71 gây ra đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là ở trẻ em dưới 5 tuổi. Việc chẩn đoán chính xác là một thách thức lớn do sự đa dạng của các chủng vi rút và sự tương đồng giữa các triệu chứng lâm sàng. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như nuôi cấy vi rút thường tốn thời gian và yêu cầu kỹ thuật cao, trong khi các bộ kit thương mại thường không chính xác và có giá thành cao.

2.1. Những khó khăn trong việc chẩn đoán vi rút EV71

Việc chẩn đoán vi rút EV71 gặp nhiều khó khăn do sự tương đồng giữa các vi rút đường ruột khác. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh tay chân miệng có thể giống với nhiều bệnh khác, dẫn đến việc chẩn đoán sai. Hơn nữa, các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi rút thường yêu cầu thời gian dài và kỹ thuật cao, khiến cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn hơn.

2.2. Tác động của việc chẩn đoán chậm đến sức khỏe trẻ em

Việc chẩn đoán chậm có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như viêm não, phù phổi cấp và thậm chí tử vong. Trẻ em mắc bệnh tay chân miệng có thể phải chịu đựng các di chứng lâu dài nếu không được điều trị kịp thời. Do đó, việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe trẻ em.

III. Phương pháp Realtime RT PCR trong chẩn đoán vi rút EV71

Phương pháp Realtime RT-PCR được xây dựng dựa trên nguyên lý khuếch đại gen đặc trưng của vi rút EV71. Quy trình này bao gồm các bước tách chiết RNA, thiết kế cặp mồi và mẫu dò Taqman, và thực hiện phản ứng PCR. Kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện vi rút mà còn định lượng nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị.

3.1. Quy trình tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm

Quy trình tách chiết RNA là bước đầu tiên trong phương pháp Realtime RT-PCR. Mẫu bệnh phẩm được xử lý để loại bỏ các tạp chất và thu nhận RNA tinh khiết. Việc tách chiết RNA chất lượng cao là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy của phản ứng PCR. Các phương pháp tách chiết hiện nay đã được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao nhất.

3.2. Thiết kế cặp mồi và mẫu dò Taqman

Thiết kế cặp mồi và mẫu dò Taqman là bước quan trọng trong quy trình Realtime RT-PCR. Cặp mồi phải đặc hiệu cho gen của vi rút EV71, đảm bảo không phản ứng với các vi rút khác. Mẫu dò Taqman giúp phát hiện sự khuếch đại của gen trong thời gian thực, cho phép theo dõi quá trình phản ứng một cách chính xác. Việc tối ưu hóa các thông số thiết kế là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của Realtime RT PCR

Nghiên cứu về quy trình Realtime RT-PCR đã cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc chẩn đoán vi rút EV71. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể phát hiện vi rút trong các mẫu bệnh phẩm từ giai đoạn sớm của bệnh. Việc áp dụng Realtime RT-PCR trong các cơ sở y tế sẽ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh tay chân miệng, từ đó giảm thiểu tỷ lệ biến chứng và tử vong.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy của phương pháp Realtime RT-PCR đạt trên 90%, trong khi độ đặc hiệu cũng cao, lên tới 95%. Điều này cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện chính xác vi rút EV71 trong các mẫu bệnh phẩm, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả.

4.2. Ứng dụng Realtime RT PCR trong các cơ sở y tế

Việc áp dụng Realtime RT-PCR trong các cơ sở y tế sẽ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh tay chân miệng. Các bệnh viện có thể nhanh chóng xác định sự hiện diện của vi rút EV71, từ đó có các biện pháp điều trị kịp thời. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ biến chứng mà còn góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 đã mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị bệnh tay chân miệng. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp này hứa hẹn sẽ trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán vi rút EV71. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các bộ kit chẩn đoán trong nước để giảm chi phí và nâng cao khả năng tiếp cận cho các cơ sở y tế.

5.1. Tương lai của phương pháp Realtime RT PCR

Phương pháp Realtime RT-PCR có tiềm năng lớn trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác. Việc phát triển các bộ kit chẩn đoán trong nước sẽ giúp giảm chi phí và nâng cao khả năng tiếp cận cho các cơ sở y tế. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong công tác phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình Realtime RT-PCR, từ đó nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Ngoài ra, việc nghiên cứu các chủng vi rút mới và sự biến đổi gen của vi rút EV71 cũng rất cần thiết để đảm bảo khả năng chẩn đoán chính xác trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tay chân miệng là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu ở trẻ em, lây lan nhanh qua đường tiêu hóa và tiếp xúc trực tiếp. Theo số liệu từ Cục Y tế Dự phòng thuộc Bộ Y tế, chỉ trong 9 tháng đầu năm 2011, cả nước đã ghi nhận 61.805 trường hợp mắc bệnh tại 61 tỉnh thành, trong đó có 114 ca tử vong. Trên bình diện quốc tế, vụ dịch tại Đài Loan năm 1998 đã ghi nhận 129.106 ca mắc với 78 trường hợp tử vong do tổn thương hệ thần kinh trung ương. Trong số các căn nguyên gây bệnh, vi rút Enterovirus 71 (EV71) thuộc chi Enterovirus là tác nhân nguy hiểm nhất, thường xuyên gây ra các biến chứng nghiêm trọng như viêm não màng não, phù phổi cấp và viêm cơ tim. Một khảo sát tại Bệnh viện Nhi đồng 1 cho thấy trong số trẻ nhiễm EV71, có đến 29,5% trường hợp xuất hiện biến chứng thần kinh nặng.

Thực trạng chẩn đoán hiện nay đối mặt với nhiều rào cản kỹ thuật. Phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút truyền thống đòi hỏi thời gian kéo dài từ 5 đến 7 ngày và phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp 3. Các xét nghiệm nhanh tìm kháng thể IgM thường cho tỷ lệ dương tính giả hoặc âm tính giả cao. Trong khi đó, các bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử thương mại phần lớn phải nhập khẩu với chi phí đắt đỏ và chưa được tối ưu hóa cho các phân nhóm gen EV71 lưu hành tại Việt Nam.

Trước bối cảnh đó, luận văn tập trung vào mục tiêu xây dựng hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật One-Step Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman probe đặc hiệu nhằm phát hiện nhanh và chính xác vi rút EV71. Đề tài được triển khai thực nghiệm và ứng dụng đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm thu thập trong năm 2016 tại Bệnh viện Đa khoa Đống Đa, Hà Nội. Kết quả nghiên cứu xác lập giới hạn phát hiện đạt 100 bản sao trên một mililit cùng độ đặc hiệu 100%, đóng góp công cụ đắc lực phục vụ công tác điều trị sớm và giám sát dịch tễ học trong y tế công cộng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng di truyền học phân tử và vi sinh học hiện đại, tập trung vào cấu trúc bộ gen của vi rút EV71 thuộc họ Picornaviridae. Bộ gen của EV71 là một phân tử RNA sợi đơn dương có kích thước xấp xỉ 7.400 nucleotide, chứa một khung đọc mở mã hóa cho polyprotein gồm 2.194 acid amin. Polyprotein này được phân cắt thành 4 protein cấu trúc từ VP1 đến VP4 và 7 protein không cấu trúc. Trong đó, gen VP1 mã hóa protein kháng nguyên bề mặt vỏ capsid, đóng vai trò then chốt trong tính sinh miễn dịch, thụ thể gắn kết tế bào chủ và độc lực gây bệnh.

Kỹ thuật Realtime RT-PCR một bước (One-Step) dựa trên nguyên lý tích hợp quá trình phiên mã ngược từ RNA thành cDNA và khuếch đại chuỗi polymerase trong cùng một phản ứng kín. Phản ứng ứng dụng công nghệ mẫu dò Taqman probe, là một đoạn oligonucleotide đặc hiệu mang chất phát huỳnh quang ở đầu 5 nguyên thủy và chất hấp thụ huỳnh quang ở đầu 3 nguyên thủy. Hoạt tính 5-3 exonuclease của enzyme Platinum Taq DNA polymerase sẽ thủy giải mẫu dò trong quá trình kéo dài chuỗi, giải phóng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao tích lũy. Động học khuếch đại được phân tích thông qua chu kỳ ngưỡng Ct và mô hình hồi quy tuyến tính đường chuẩn nhằm xác định hiệu suất khuếch đại E và hệ số tương quan R bình phương.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu nghiên cứu bao gồm 36 trình tự gen VP1 của các chủng EV71 thu thập từ ngân hàng gen quốc tế NCBI, 10 chủng vi rút EV71 nuôi cấy chuẩn từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, plasmid tái tổ hợp pCR2.1 mang đoạn gen đích, cùng 5 chủng vi sinh vật đối chứng âm tính gồm Cytomegalovirus, Herpes simplex virus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii và Escherichia coli do Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương cung cấp.

Về cỡ mẫu thực nghiệm lâm sàng, nghiên cứu đã thu thập 69 mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng từ 69 bệnh nhân nghi ngờ mắc tay chân miệng điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Đống Đa trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2016. Phương pháp chọn mẫu được thực hiện theo hình thức chọn mẫu thuận tiện có chủ đích dựa trên tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng bệnh truyền nhiễm.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích One-Step Realtime RT-PCR là nhằm tích hợp enzyme phiên mã ngược SuperScript III và Taq polymerase trong một ống phản ứng duy nhất, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống dưới 120 phút, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo giữa các giai đoạn và cho phép xử lý đồng thời nhiều loại bệnh phẩm. Quy trình thiết kế mồi và mẫu dò được thực hiện qua các phần mềm sinh học tin học ClustalX 2.0, BioEdit, Primer BLAST và Oligo Analyzer 3.1, kiểm soát nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi trong khoảng 55 đến 65 độ C và nồng độ GC từ 40% đến 60%. Nồng độ plasmid được định lượng chuẩn xác bằng máy huỳnh quang Qubit 2.0 trước khi thiết lập dải pha loãng chuẩn độ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu gồm mồi xuôi EV71F dài 18 nucleotide, mồi ngược EV71R dài 22 nucleotide và mẫu dò Taqman EV71 dài 27 nucleotide, định vị chính xác tại vùng gen VP1 với kích thước sản phẩm khuếch đại đặc trưng là 103 cặp base (bp).

Quá trình tối ưu hóa các thông số phản ứng mang lại các kết quả nổi bật:

• Về nhiệt độ bắt cặp và kéo dài: Trong 4 mức nhiệt độ khảo sát từ 52 độ C, 55 độ C, 58 độ C đến 60 độ C, mức nhiệt 55 độ C cho cường độ huỳnh quang cao nhất và đường cong khuếch đại dạng sigmoid chuẩn mực.
• Về nồng độ ion Magie: Nồng độ MgSO4 ở mức 5 mM mang lại hiệu quả vượt trội, đưa chu kỳ ngưỡng Ct xuất hiện sớm ở mức 27,6 chu kỳ, rút ngắn hơn 3,1 chu kỳ so với nồng độ 4 mM (Ct đạt 30,7) và sớm hơn nồng độ 6 mM (Ct đạt 30,2).
• Về độ nhạy và đường chuẩn: Thử nghiệm pha loãng bậc 10 từ 10 mũ 6 đến 10 mũ 0 bản sao trên mililit đối với cả plasmid pCR2.1 mang gen đích và RNA vi rút nuôi cấy đều xác lập giới hạn phát hiện thấp nhất (LOD) đạt 100 bản sao trên một mililit. Đường chuẩn đạt độ tuyến tính tuyệt đối với hệ số R bình phương bằng 0,999 và hiệu suất khuếch đại E đạt 99%.
• Về độ đặc hiệu: Phản ứng đạt độ đặc hiệu tuyệt đối 100%, chỉ phát hiện tín hiệu dương tính trên EV71 và hoàn toàn không xảy ra phản ứng chéo với 5 chủng vi khuẩn, vi rút đối chứng.
• Về ứng dụng lâm sàng: Phân tích 69 mẫu dịch ngoáy họng ghi nhận 21 mẫu dương tính với EV71, chiếm tỷ lệ 30,4%. Trong số 21 ca dương tính, có 11 bệnh nhi nam (chiếm 52,4%) và 10 bệnh nhi nữ (chiếm 47,6%). Phân bố độ tuổi cho thấy 85% bệnh nhi dưới 6 tuổi, trong đó nhóm trẻ 1 đến 2 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất với 50%.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm có thể được mô tả và minh chứng trực quan thông qua biểu đồ khuếch đại huỳnh quang thời gian thực với các đường cong tín hiệu tách biệt rõ ràng so với đường nền, kết hợp bảng ma trận giá trị chu kỳ ngưỡng Ct giảm đều đặn khoảng 3,3 chu kỳ qua mỗi độ pha loãng bậc 10. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% nhuộm GelRed xác nhận sự hiện diện của một vạch sản phẩm duy nhất có kích thước chính xác 103 bp, không xuất hiện hiện tượng mồi dimer hay sản phẩm phụ không đặc hiệu.

Hiệu năng của quy trình hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế của tác giả Tan E. năm 2008 tại Singapore, tác giả Hwang S. năm 2013 tại Hàn Quốc và tác giả Zhang S. năm 2014 tại Trung Quốc khi cùng khẳng định tính ưu việt của kỹ thuật Realtime RT-PCR khuếch đại đoạn gen VP1. So với nghiên cứu của tác giả Niu P. năm 2016 ghi nhận tỷ lệ dương tính 21% bằng Realtime RT-PCR thông thường và 41% bằng kỹ thuật lồng (nested PCR), tỷ lệ phát hiện 30,4% trong nghiên cứu này phản ánh độ nhạy cao và tính ổn định của hệ hóa chất tối ưu. Tỷ lệ nhiễm bệnh tập trung 85% ở trẻ dưới 6 tuổi hoàn toàn phù hợp với các báo cáo dịch tễ học của Tổ chức Y tế Thế giới, giải thích bởi sự suy giảm lượng kháng thể bảo vệ truyền từ mẹ sau 6 tháng tuổi và hành vi tiếp xúc đồ chơi, sàn nhà ở lứa tuổi biết đi.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn của quy trình xét nghiệm, nghiên cứu đưa ra 4 nhóm khuyến nghị trọng tâm:

1. Triển khai chuyển giao công nghệ quy trình One-Step Realtime RT-PCR: Ban Giám đốc các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh và các bệnh viện chuyên khoa nhi, nhiệt đới trên toàn quốc cần đầu tư phê duyệt quy trình vào danh mục kỹ thuật xét nghiệm thường quy trong vòng 6 đến 12 tháng tới, hướng đến mục tiêu rút ngắn thời gian trả kết quả chẩn đoán xác định căn nguyên EV71 xuống dưới 120 phút.
2. Chuẩn hóa quy trình lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm dịch ngoáy họng: Khoa Xét nghiệm phối hợp Khoa Khám bệnh và Khoa Truyền nhiễm xây dựng bảng hướng dẫn thao tác chuẩn (SOP) về thu thập mẫu bệnh phẩm sớm trong 3 ngày đầu khởi phát, bảo quản trong môi trường vận chuyển vi rút ở nhiệt độ âm 80 độ C, nhằm duy trì độ toàn vẹn của RNA và giảm tỷ lệ âm tính giả xuống dưới 1%.
3. Phát triển sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán đa mồi (Multiplex PCR) nội địa: Nhóm nghiên cứu tại các viện dịch tễ cần chủ động liên kết với các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế để mở rộng hệ mồi tích hợp phát hiện đồng thời cả EV71 và Coxsackievirus A16 trong vòng 18 đến 24 tháng, giúp giảm ít nhất 30% chi phí xét nghiệm so với sinh phẩm nhập ngoại.
4. Tăng cường hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử: Cục Y tế Dự phòng cần thiết lập mạng lưới giải trình tự gen và theo dõi định kỳ hàng quý sự biến đổi các phân nhóm gen C4, C5 của EV71 tại 63 tỉnh thành, kết hợp chia sẻ dữ liệu chu kỳ ngưỡng Ct để chủ động dự báo nguy cơ bùng phát các ổ dịch nặng trong cộng đồng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ lâm sàng và chuyên viên xét nghiệm tại các bệnh viện: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn từ khâu tách chiết RNA, thiết lập phản ứng đến phân tích chu kỳ ngưỡng Ct, phục vụ chẩn đoán phân biệt sớm các thể tay chân miệng có nguy cơ biến chứng thần kinh.
2. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp thiết kế mồi, mẫu dò Taqman trên phần mềm chuyên dụng, kỹ thuật tối ưu hóa nồng độ co-factor và tính toán đường chuẩn định lượng bản sao gen.
3. Các đơn vị nghiên cứu và công ty sản xuất sinh phẩm y tế (IVD): Nguồn dữ liệu kỹ thuật tin cậy để nghiên cứu phát triển các bộ kit Realtime RT-PCR sản xuất trong nước đạt tiêu chuẩn kiểm định chất lượng, thay thế nguồn kit nhập khẩu.
4. Cán bộ quản lý y tế dự phòng và trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC): Cung cấp các số liệu dịch tễ học phân tử, đặc điểm phân bố bệnh theo lứa tuổi và giới tính để hoạch định chiến lược phòng ngừa, giám sát dịch tay chân miệng hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

Quy trình One-Step Realtime RT-PCR trong luận văn có ưu điểm gì vượt trội so với kỹ thuật Two-Step RT-PCR truyền thống?
Quy trình One-Step tích hợp phản ứng phiên mã ngược từ RNA thành cDNA và phản ứng khuếch đại PCR trong cùng một ống nghiệm duy nhất. Phương pháp này giảm thiểu 50% số bước thao tác pipet, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo sản phẩm giữa các ống phản ứng và rút ngắn tổng thời gian thực hiện xét nghiệm xuống chỉ còn khoảng 120 phút.

Đoạn gen nào của vi rút EV71 được lựa chọn làm đích khuếch đại và lý do khoa học là gì?
Nghiên cứu lựa chọn đoạn gen VP1 có kích thước 103 cặp base làm đích khuếch đại. Vùng gen VP1 mã hóa cho protein kháng nguyên bề mặt vỏ capsid, vừa mang tính chất bảo tồn đặc trưng để nhận diện chính xác loài Enterovirus 71, vừa cho phép phân biệt tuyệt đối với các enterovirus khác như Coxsackie A16 hay Poliovirus.

Giới hạn phát hiện thấp nhất (độ nhạy) của phản ứng Realtime RT-PCR này đạt mức bao nhiêu?
Giới hạn phát hiện thấp nhất của quy trình đạt ngưỡng 100 bản sao trên một mililit đối với cả mẫu plasmid tái tổ hợp chuẩn và mẫu RNA vi rút EV71 nuôi cấy sống. Độ nhạy này bảo đảm phát hiện chính xác các trường hợp bệnh nhân có tải lượng vi rút thấp ở giai đoạn mới khởi phát.

Tại sao cần phải tối ưu hóa nồng độ ion Magie (MgSO4) ở mức 5 mM trong thành phần phản ứng?
Ion Magie đóng vai trò là yếu tố đồng vận cần thiết cho hoạt tính xúc tác của enzyme Platinum Taq polymerase. Khảo sát thực nghiệm chứng minh nồng độ 5 mM giúp enzyme hoạt động tối ưu nhất, đưa chu kỳ ngưỡng Ct xuất hiện sớm hơn 3,1 chu kỳ so với nồng độ 4 mM và tạo đường cong khuếch đại sắc nét.

Mẫu bệnh phẩm nào là thích hợp nhất để ứng dụng quy trình chẩn đoán Realtime RT-PCR này?
Dịch ngoáy họng và dịch nốt phỏng là hai loại bệnh phẩm tối ưu nhất do vi rút EV71 khu trú với mật độ cao tại niêm mạc hầu họng. Kết quả thử nghiệm trên 69 mẫu dịch ngoáy họng tại Bệnh viện Đa khoa Đống Đa đã khẳng định tỷ lệ phát hiện dương tính đạt 30,4% một cách an toàn, dễ lấy và không gây đau đớn cho trẻ.

Kết luận

• Thiết kế thành công hệ thống mồi EV71F, EV71R và mẫu dò Taqman probe đặc hiệu cho vùng gen VP1 với sản phẩm khuếch đại kích thước chuẩn 103 bp.
• Tối ưu hóa thành công điều kiện phản ứng với nhiệt độ bắt cặp 55 độ C và nồng độ MgSO4 5 mM, mang lại hiệu suất phản ứng đạt 99% với hệ số tương quan tuyến tính R bình phương bằng 0,999.
• Xác lập độ nhạy cao với giới hạn phát hiện đạt 100 bản sao trên một mililit và độ đặc hiệu tuyệt đối 100% không phản ứng chéo với các tác nhân vi sinh vật khác.
• Thử nghiệm lâm sàng thành công trên 69 bệnh nhân nghi nhiễm tại Bệnh viện Đa khoa Đống Đa, ghi nhận tỷ lệ dương tính đạt 30,4%, tập trung 85% ở nhóm trẻ dưới 6 tuổi.
• Tạo tiền đề kỹ thuật vững chắc giúp các cơ sở y tế trong nước chủ động sản xuất sinh phẩm chẩn đoán bệnh tay chân miệng chất lượng cao với giá thành hợp lý.

Để ứng dụng hiệu quả công trình này, các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm sinh học phân tử có thể liên hệ tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh truyền nhiễm ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tay Chân Miệnglà bệnh truyền nhiễm lây từ ngƣời sang ngƣời, dễ gây thành dịch. Bệnh do các vi rút đƣờng ruột (enterovirus) gây ra. Trong những năm gần đây, bệnh Tay Chân Miệng là một trong những bệnh truyền nhiễm mới nổi và đƣợc đặc biệt quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Các vụ dịch Tay Chân Miệng thƣờng xảy ra hằng năm trên toàn quốc bao gồm cả hai miền Bắc và Nam từ tháng 3 đến tháng 11.

Các biến chứng nhƣ: hôn mê, co giật, phù phổi cấp, viêm cơ tim nếu không đƣợc điều trị kịp thời sẽ có tỷ lệ tử vong cao. Hơn nữa, các biến chứng thần kinh do EV71 gây nên kéo theo di chứng tàn tật suốt đời cho trẻ sẽ là gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội. Xét nghiệm chẩn đoán xác định vi rút EV71 bằng phƣơng pháp nuôi cấy, phân lập thƣờng đòi hỏi thời gian và kỹ thuật cao. Tại Việt Nam chỉ có một vài đơn vị có đủ điều kiện thực hiện đƣợc kỹ thuật này.

Vì vậy, rất khó thực hiện rộng rãi tại các cơ sở y tế và bệnh viện, gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên mới cho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và bệnh Tay Chân Miệng nói riêng. Công nghệ chẩn đoán dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng công nghệ Taqman probe chẩn đoán đặc hiệu EV71 không những cho kết quả nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định đƣợc từ bệnh phẩm là vết loét trên bệnh nhân[50]. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật PCR thông thƣờng.

Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩn đoán các ca bệnh ở giai đoạn sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm so với phƣơng pháp PCR thông thƣờng và các phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên - kháng thể. Với những đặc điểm nổi trội nhƣ vậy, kỹ thuật này nên đƣợc áp dụng ở các bệnh viện đặc biệt là ở các bệnh viện có khoa truyền nhiễm, viện vệ sinh phòng dịch, giúp chẩn đoán sớm và định hƣớng cho điều trị bệnh nhân, tránh đƣợc những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễ trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra việc chẩn đoán bệnh sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, giám sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra. Việc phòng chống bệnh Tay Chân Miệng đã đƣợc Bộ Y tế chính thức đƣa vào nhóm các bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo.

Và trong những năm gần đây, số ca mắc, chết do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Hiện nay ở Việt Nam, việc chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng đều sử dụng các bộ kit thƣơng mại thƣờng đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài, có giá thành cao và nhiều khi chẩn đoán không chính xác các chủng vi rút đang lƣu hành ở Việt Nam. Ở trong nƣớc chƣa có đơn vị nào xây dựng và phát triển quy trìnhkỹ thuật One-Step Realtime RT - PCR chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng. Đây là một hạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống dịch bệnh trong nƣớc, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân.

Các bộ kit thƣơng mại sử dụng test nhanh cho tỉ lệ dƣơng tính giả hoặc âm tính giả cao và chỉ xét nghiệm đƣợc ở bệnh phẩm là máu. Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy và phân lập chỉ đƣợc thực hiện ở một vài cơ sở có phòng xét nghiệm an toàn cấp 3. Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR là một bƣớc tiến trong công nghệ chẩn đoán giúp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân. Đề tài nghiên cứu sẽ tập trung vào mục tiêu:Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Để đạt đƣợc các mục tiêu trên, góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh kịp thời dịch bệnh Tay Chân Miệng do EV71 gây nên, chúng tôi tiến hành đề tài với các mục tiêu nghiên cứu sau: - Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trƣng của vi rút EV71 bằng kỹ thuật Realtime RT - PCR. -Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime RT - PCR. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng Bệnh Tay Chân Miệng là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút gây nên, hay gặp ở trẻ em. Bệnh lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, có thể lây do tiếp xúc trực tiếp với niêm mạc, nƣớc bọt và phân của ngƣời bệnh. Đặc điểm thƣờng thấy của bệnh bao gồm sốt, phát ban dạng phỏng nƣớc ở tay, chân và trong niêm mạc miệng. Bệnh có thể tự hồi phục, tuy nhiên trong các vụ dịch có một tỷ lệ ngƣời bệnh có bệnh cảnh lâm sàng nặng, với các biến chứng về thần kinh, tim mạch và dẫn đến tử vong nhanh sau vài giờ cho đến vài ngày.

Bệnh Tay Chân Miệng do một nhóm vi rút thuộc chi Enterovirus gây nên.Enteroviruslà thành viên của họ Picornaviridae. Chi Enterovirus bao gồm Enterovirus 68 đến 71, Coxsackie A vi rút (CA), Coxsackie B vi rút (CB), polio vi rút và echo vi rút. Tác nhân thƣờng gặp nhất là Coxsackie A16 (CA16) và Enterovirus 71 (EV71), chúng là tác nhân gây nên các đại dịch Tay Chân Miệng lớn ở các nƣớc trên thế giới.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam 1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới Trong những năm gần đây, các vụ dịch Tay Chân Miệng do EV71 đã đƣợc ghi nhận ở Trung Quốc, Hồng Kông, Macao, Đài Loan, Mông Cổ, Việt Nam, Malaysia và Singapore.

Tại Singapore, tỷ lệ mắc Tay Chân Miệng tăng dần theo từng năm.790 trƣờng hợp mắc và đã tăng lên đến 16.228 trƣờng hợp vào năm 2002 [40]. Theo các báo cáo, chỉ trong vòng 8 tháng năm 2008, Singapore có 29.686 ca bệnh, trong đó có 4 trƣờng hợp viêm não và 1 trƣờng hợp tử vong [47]. Tại Đài Loan, trong vụ dịch năm 1998, có 129.106 trƣờng hợp mắc với 405 ca nặng và 78 ca tử vong [7],[11],[28]. Năm 2006-2007, tại Đài Loan cũng xảy ra một vụ dịch với tỷ lệ tử vong cao [21].

Tại Malaysia, trƣờng hợp Tay Chân Miệng phát hiện đầu tiên vào năm 1997, tại Sarawak. Các vụ dịch do EV71 cũng xảy ra vào năm 1997, 2000, 2003 và 2006.875 ca mắc với 13 ca tử vong [39].000 bệnh nhân chủ yếu từ 1-3 tuổi bị bệnh tay chân nhập viện ở Trung Quốc [29]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các số liệu nghiên cứu cho thấy trẻ em dƣới 5 tuổi có nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất. Trẻ trai thƣờng có tỷ lệ mắc cao hơn trẻ gái.

Một nghiên cứu ở Singapore cho thấy có 1/124 (0,8%) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng EV71 ở trẻ từ 1-23 tháng và tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính tăng lên 12%/năm ở trẻ từ 2-5 tuổi, điều này gợi ý rằng hầu hết các trƣờng hợp bị nhiễm đều xảy ra ở trẻ trong độ tuổi trƣớc khi đi học[25]. Một số nghiên cứu đã tìm hiểu về các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nặng của bệnh. Nghiên cứu tại Singapore trong vụ dịch năm 2000 cho thấy các dấu hiệu: nôn, bạch cầu tăng và một số biểu hiện không điển hình khác nhƣ phát ban trên da nhƣng không loét miệng, sốt, tiêu chảy có liên quan với tình trạng nặng [30],[36],[37]. Một nghiên cứu ở Đài Loan cho thấy có sự khác biệt lâm sàng giữa EV71 với CA16 [12].

Kể từ lần đầu tiên đƣợc phân lập tại Mỹ năm 1969, EV71 đã đƣợc xác định là một căn nguyên phổ biến của bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em và trẻ nhỏ. Các vụ dịch lớn liên quan đến EV71 đã đƣợc công bố ở Mỹ, châu Âu, Úc, châu Á đã cho thấy vai trò quan trọng của vi rút này đối với vấn đề sức khỏe toàn cầu [6],[50].Mặc dù nhiễm trùng do EV71 hầu hết biểu hiện ở dạng nhẹ, tự khỏi với biểu hiện là sốt, tổn thƣơng dạng nốt phỏng ở tay, chân, niêm mạc họng miệng. Một tỷ lệ nhất định các trƣờng hợp cấp tính có liên quan đến các tổn thƣơng hệ thần kinh, thậm chí gây tử vong nhƣ viêm não, viêm màng não vô khuẩn, hội chứng liệt giống bại liệt [9], [10], [13], [17], [24], [40], [52]. Những tổn thƣơng nặng nhƣ vậy đã đƣợc báo cáo lần đầu tiên tại Bulgari vào năm 1975 và Hungary năm 1978 [32].

Tuy nhiên, các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao xuất hiện vào những năm 1990 nhƣ ở Malaysia năm 1997 [3],[11],[18],[30].Vụ dịch tại Đài Loan năm 1998 đƣợc coi là vụ dịch lớn với hơn 100.000 ngƣời mắc, hơn 400 trẻ phải nhập viện với các biến chứng ở hệ thần kinh trung ƣơng, 78 trẻ tử vong [7], [17]. Nhƣ vậy, với tất cả các vụ dịch xảy ra ở vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng trong 10 năm qua do các dƣới nhóm EV71 gây ra làm tăng sự lo ngại về nguồn gốc, đặc điểm di truyền và dịch tễ học của vi rút này. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam Bệnh Tay Chân Miệng đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 2003 [4]. Năm 2008, Bộ Y tế chính thức đƣa bệnh Tay Chân Miệng vào nhóm các 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo và số ca mắc, chết do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng.

Theo số liệu của Bộ Y tế, năm 2006 có 2.284 trƣờng hợp, năm 2007 có 2.988 trƣờng hợp, và chỉ trong 4 tháng đầu năm 2008 đã có gần 3.000 trƣờng hợp mắc bệnh. Ở Việt Nam, bệnh Tay Chân Miệng xảy ra rải rác quanh năm nhƣng cao điểm nhất là vào mùa hè và mùa thu [1]. Bệnh thƣờng xảy ra ở trẻ dƣới 6 tuổi [25], tỷ lệ nam nhiều hơn nữ 1,5 lần, biểu hiện lâm sàng nhẹ, có thể tự khỏi và còn ít đƣợc quan tâm. Tại Bệnh Viện Bệnh nhiệt đới TPHCM, năm 2008 có 328 ca, năm 2009 có 255 ca nhập viện điều trị.

Tỷ lệ các biến chứng chiếm 15-40% số trƣờng hợp, bao gồm viêm não - màng não, phù phổi cấp, sốc, liệt mềm,… Một nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 vào năm 2005 [43] cho thấy: trong số 764 trẻ nhập viện với chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng có 53.