MỞ ĐẦU Tay Chân Miệnglà bệnh truyền nhiễm lây từ ngƣời sang ngƣời, dễ gây thành dịch. Bệnh do các vi rút đƣờng ruột (enterovirus) gây ra. Trong những năm gần đây, bệnh Tay Chân Miệng là một trong những bệnh truyền nhiễm mới nổi và đƣợc đặc biệt quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Các vụ dịch Tay Chân Miệng thƣờng xảy ra hằng năm trên toàn quốc bao gồm cả hai miền Bắc và Nam từ tháng 3 đến tháng 11.
Các biến chứng nhƣ: hôn mê, co giật, phù phổi cấp, viêm cơ tim nếu không đƣợc điều trị kịp thời sẽ có tỷ lệ tử vong cao. Hơn nữa, các biến chứng thần kinh do EV71 gây nên kéo theo di chứng tàn tật suốt đời cho trẻ sẽ là gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội. Xét nghiệm chẩn đoán xác định vi rút EV71 bằng phƣơng pháp nuôi cấy, phân lập thƣờng đòi hỏi thời gian và kỹ thuật cao. Tại Việt Nam chỉ có một vài đơn vị có đủ điều kiện thực hiện đƣợc kỹ thuật này.
Vì vậy, rất khó thực hiện rộng rãi tại các cơ sở y tế và bệnh viện, gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên mới cho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và bệnh Tay Chân Miệng nói riêng. Công nghệ chẩn đoán dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng công nghệ Taqman probe chẩn đoán đặc hiệu EV71 không những cho kết quả nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định đƣợc từ bệnh phẩm là vết loét trên bệnh nhân[50]. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật PCR thông thƣờng.
Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩn đoán các ca bệnh ở giai đoạn sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm so với phƣơng pháp PCR thông thƣờng và các phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên - kháng thể. Với những đặc điểm nổi trội nhƣ vậy, kỹ thuật này nên đƣợc áp dụng ở các bệnh viện đặc biệt là ở các bệnh viện có khoa truyền nhiễm, viện vệ sinh phòng dịch, giúp chẩn đoán sớm và định hƣớng cho điều trị bệnh nhân, tránh đƣợc những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễ trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra việc chẩn đoán bệnh sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, giám sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra. Việc phòng chống bệnh Tay Chân Miệng đã đƣợc Bộ Y tế chính thức đƣa vào nhóm các bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo.
Và trong những năm gần đây, số ca mắc, chết do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hiện nay ở Việt Nam, việc chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng đều sử dụng các bộ kit thƣơng mại thƣờng đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài, có giá thành cao và nhiều khi chẩn đoán không chính xác các chủng vi rút đang lƣu hành ở Việt Nam. Ở trong nƣớc chƣa có đơn vị nào xây dựng và phát triển quy trìnhkỹ thuật One-Step Realtime RT - PCR chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng. Đây là một hạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống dịch bệnh trong nƣớc, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân.
Các bộ kit thƣơng mại sử dụng test nhanh cho tỉ lệ dƣơng tính giả hoặc âm tính giả cao và chỉ xét nghiệm đƣợc ở bệnh phẩm là máu. Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy và phân lập chỉ đƣợc thực hiện ở một vài cơ sở có phòng xét nghiệm an toàn cấp 3. Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR là một bƣớc tiến trong công nghệ chẩn đoán giúp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân. Đề tài nghiên cứu sẽ tập trung vào mục tiêu:Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Để đạt đƣợc các mục tiêu trên, góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh kịp thời dịch bệnh Tay Chân Miệng do EV71 gây nên, chúng tôi tiến hành đề tài với các mục tiêu nghiên cứu sau: - Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trƣng của vi rút EV71 bằng kỹ thuật Realtime RT - PCR. -Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime RT - PCR. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng Bệnh Tay Chân Miệng là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút gây nên, hay gặp ở trẻ em. Bệnh lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, có thể lây do tiếp xúc trực tiếp với niêm mạc, nƣớc bọt và phân của ngƣời bệnh. Đặc điểm thƣờng thấy của bệnh bao gồm sốt, phát ban dạng phỏng nƣớc ở tay, chân và trong niêm mạc miệng. Bệnh có thể tự hồi phục, tuy nhiên trong các vụ dịch có một tỷ lệ ngƣời bệnh có bệnh cảnh lâm sàng nặng, với các biến chứng về thần kinh, tim mạch và dẫn đến tử vong nhanh sau vài giờ cho đến vài ngày.
Bệnh Tay Chân Miệng do một nhóm vi rút thuộc chi Enterovirus gây nên.Enteroviruslà thành viên của họ Picornaviridae. Chi Enterovirus bao gồm Enterovirus 68 đến 71, Coxsackie A vi rút (CA), Coxsackie B vi rút (CB), polio vi rút và echo vi rút. Tác nhân thƣờng gặp nhất là Coxsackie A16 (CA16) và Enterovirus 71 (EV71), chúng là tác nhân gây nên các đại dịch Tay Chân Miệng lớn ở các nƣớc trên thế giới.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam 1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới Trong những năm gần đây, các vụ dịch Tay Chân Miệng do EV71 đã đƣợc ghi nhận ở Trung Quốc, Hồng Kông, Macao, Đài Loan, Mông Cổ, Việt Nam, Malaysia và Singapore.
Tại Singapore, tỷ lệ mắc Tay Chân Miệng tăng dần theo từng năm.790 trƣờng hợp mắc và đã tăng lên đến 16.228 trƣờng hợp vào năm 2002 [40]. Theo các báo cáo, chỉ trong vòng 8 tháng năm 2008, Singapore có 29.686 ca bệnh, trong đó có 4 trƣờng hợp viêm não và 1 trƣờng hợp tử vong [47]. Tại Đài Loan, trong vụ dịch năm 1998, có 129.106 trƣờng hợp mắc với 405 ca nặng và 78 ca tử vong [7],[11],[28]. Năm 2006-2007, tại Đài Loan cũng xảy ra một vụ dịch với tỷ lệ tử vong cao [21].
Tại Malaysia, trƣờng hợp Tay Chân Miệng phát hiện đầu tiên vào năm 1997, tại Sarawak. Các vụ dịch do EV71 cũng xảy ra vào năm 1997, 2000, 2003 và 2006.875 ca mắc với 13 ca tử vong [39].000 bệnh nhân chủ yếu từ 1-3 tuổi bị bệnh tay chân nhập viện ở Trung Quốc [29]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các số liệu nghiên cứu cho thấy trẻ em dƣới 5 tuổi có nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất. Trẻ trai thƣờng có tỷ lệ mắc cao hơn trẻ gái.
Một nghiên cứu ở Singapore cho thấy có 1/124 (0,8%) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng EV71 ở trẻ từ 1-23 tháng và tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính tăng lên 12%/năm ở trẻ từ 2-5 tuổi, điều này gợi ý rằng hầu hết các trƣờng hợp bị nhiễm đều xảy ra ở trẻ trong độ tuổi trƣớc khi đi học[25]. Một số nghiên cứu đã tìm hiểu về các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nặng của bệnh. Nghiên cứu tại Singapore trong vụ dịch năm 2000 cho thấy các dấu hiệu: nôn, bạch cầu tăng và một số biểu hiện không điển hình khác nhƣ phát ban trên da nhƣng không loét miệng, sốt, tiêu chảy có liên quan với tình trạng nặng [30],[36],[37]. Một nghiên cứu ở Đài Loan cho thấy có sự khác biệt lâm sàng giữa EV71 với CA16 [12].
Kể từ lần đầu tiên đƣợc phân lập tại Mỹ năm 1969, EV71 đã đƣợc xác định là một căn nguyên phổ biến của bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em và trẻ nhỏ. Các vụ dịch lớn liên quan đến EV71 đã đƣợc công bố ở Mỹ, châu Âu, Úc, châu Á đã cho thấy vai trò quan trọng của vi rút này đối với vấn đề sức khỏe toàn cầu [6],[50].Mặc dù nhiễm trùng do EV71 hầu hết biểu hiện ở dạng nhẹ, tự khỏi với biểu hiện là sốt, tổn thƣơng dạng nốt phỏng ở tay, chân, niêm mạc họng miệng. Một tỷ lệ nhất định các trƣờng hợp cấp tính có liên quan đến các tổn thƣơng hệ thần kinh, thậm chí gây tử vong nhƣ viêm não, viêm màng não vô khuẩn, hội chứng liệt giống bại liệt [9], [10], [13], [17], [24], [40], [52]. Những tổn thƣơng nặng nhƣ vậy đã đƣợc báo cáo lần đầu tiên tại Bulgari vào năm 1975 và Hungary năm 1978 [32].
Tuy nhiên, các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao xuất hiện vào những năm 1990 nhƣ ở Malaysia năm 1997 [3],[11],[18],[30].Vụ dịch tại Đài Loan năm 1998 đƣợc coi là vụ dịch lớn với hơn 100.000 ngƣời mắc, hơn 400 trẻ phải nhập viện với các biến chứng ở hệ thần kinh trung ƣơng, 78 trẻ tử vong [7], [17]. Nhƣ vậy, với tất cả các vụ dịch xảy ra ở vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng trong 10 năm qua do các dƣới nhóm EV71 gây ra làm tăng sự lo ngại về nguồn gốc, đặc điểm di truyền và dịch tễ học của vi rút này. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam Bệnh Tay Chân Miệng đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 2003 [4]. Năm 2008, Bộ Y tế chính thức đƣa bệnh Tay Chân Miệng vào nhóm các 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo và số ca mắc, chết do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng.
Theo số liệu của Bộ Y tế, năm 2006 có 2.284 trƣờng hợp, năm 2007 có 2.988 trƣờng hợp, và chỉ trong 4 tháng đầu năm 2008 đã có gần 3.000 trƣờng hợp mắc bệnh. Ở Việt Nam, bệnh Tay Chân Miệng xảy ra rải rác quanh năm nhƣng cao điểm nhất là vào mùa hè và mùa thu [1]. Bệnh thƣờng xảy ra ở trẻ dƣới 6 tuổi [25], tỷ lệ nam nhiều hơn nữ 1,5 lần, biểu hiện lâm sàng nhẹ, có thể tự khỏi và còn ít đƣợc quan tâm. Tại Bệnh Viện Bệnh nhiệt đới TPHCM, năm 2008 có 328 ca, năm 2009 có 255 ca nhập viện điều trị.
Tỷ lệ các biến chứng chiếm 15-40% số trƣờng hợp, bao gồm viêm não - màng não, phù phổi cấp, sốc, liệt mềm,… Một nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 vào năm 2005 [43] cho thấy: trong số 764 trẻ nhập viện với chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng có 53.