Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm là một trong những thách thức thời sự mang tính toàn cầu, tác động trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Bên cạnh các phụ gia thực phẩm được cấp phép sử dụng trong chế biến và bảo quản, một số tổ chức và cá nhân vì lợi nhuận kinh tế hoặc do thiếu hiểu biết đã đưa các chất màu tổng hợp công nghiệp cấm vào thực phẩm nhằm tạo màu sắc bắt mắt, duy trì độ tươi giả tạo. Trong số đó, hai hóa chất nhuộm công nghiệp bị lạm dụng phổ biến là Auramine O (thường gọi là Vàng ô) và Rhodamine B.

Auramine O và Rhodamine B là các hợp chất hữu cơ chứa vòng benzen và hệ thống liên kết liên hợp, vốn được tổng hợp phục vụ chủ yếu cho công nghiệp nhuộm sợi vải, thuộc da, giấy và gỗ. Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO/IARC) xếp Auramine O vào nhóm đứng thứ 5 trong 116 chất gây ung thư hàng đầu, có khả năng phá hủy cấu trúc DNA tại gan, thận, tủy xương. Đối với Rhodamine B, Ủy ban An toàn Thực phẩm Châu Âu đã ban hành quy định nghiêm cấm sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm từ năm 2005 do độc tính cấp và mãn tính, khả năng chuyển hóa thành amine thơm gây tổn hại gan, thận, hệ thần kinh và phát triển khối u.

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung phân tích riêng rẽ từng chất, đặc biệt là Rhodamine B trên một số nền mẫu gia vị như ớt bột, sa tế; các nghiên cứu đồng thời cả hai chất màu cấm trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp tiêu thụ hàng ngày còn rất hạn chế. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thanh Thơi (ngành Sư phạm Hóa học, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh) đã triển khai đề tài: "Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến".

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:

  1. Nghiên cứu khảo sát và đề xuất các điều kiện tối ưu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối đầu dò diode quang (PDA) nhằm phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B.
  2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình xử lý, chiết xuất hai phẩm màu trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp.
  3. Thẩm định phương pháp phân tích đã đề xuất theo các thông số kỹ thuật tiêu chuẩn (tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ, độ lặp lại và độ đúng).
  4. Ứng dụng quy trình đã hoàn thiện để phân tích định tính và định lượng Auramine O, Rhodamine B trên các mẫu thực tế thu thập trên thị trường.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng phân tích: Chất màu Auramine O (tinh khiết HPLC $\ge 85%$) và Rhodamine B (tinh khiết HPLC $\ge 95%$) chuẩn của hãng Sigma-Aldrich.
  • Nền mẫu khảo sát: Măng tươi, cải chua (thu thập tại chợ Nhật Táo, Quận 10, TP. Hồ Chí Minh ngày 19/04/2018) và thịt gà gồm ức gà, đùi gà (thu thập tại siêu thị Lotte Mart Phú Thọ, Quận 10, TP. Hồ Chí Minh ngày 22/04/2018).
  • Không gian và thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 07/2017 đến tháng 05/2018 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân tích - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh và Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) - Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và tính chất hóa lý của chất phân tích

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân tích công cụ hiện đại, trọng tâm là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Quá trình phân tách các chất trong cột sắc ký được đánh giá qua các đại lượng hóa lý cơ bản: thời gian lưu ($t_R$), thời gian chết ($t_0$), hệ số dung lượng ($k'$), số đĩa lý thuyết ($N$), chiều cao tương đương đĩa lý thuyết ($HETP$), hệ số phân giải ($R_s$) và hệ số không đối xứng của peak ($T$).

Bản chất cấu tạo của hai chất nghiên cứu đóng vai trò chi phối cơ chế tương tác sắc ký:

  • Auramine O ($C_{17}H_{22}N_3Cl$, khối lượng mol $303{,}84 \text{ g/mol}$), danh pháp IUPAC: bis[4-(dimethylamino)phenyl]methanimium chloride, thuộc nhóm ketoimine, có tính base với các hằng số phân ly acid $pK_a$ là 9,8 và 10,7; bước sóng hấp thụ cực đại ($\lambda_{max}$) trong dung dịch nằm tại vùng 370 nm và 435 nm.
  • Rhodamine B ($C_{28}H_{31}N_2O_3Cl$, khối lượng mol $479 \text{ g/mol}$), danh pháp IUPAC: [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]diethylammonium chloride, cấu trúc chứa nhân xanthene và liên kết azo, tan tốt trong nước và các dung môi phân cực, $pK_a \approx 3{,}2$; bước sóng hấp thụ cực đại ($\lambda_{max}$) trong khoảng 545 - 550 nm.

Để ngăn chặn hiện tượng peak bị kéo đuôi do sự tồn tại đồng thời nhiều dạng ion hóa của chất phân tích trên bề mặt silica liên kết chuỗi alkyl của cột C18, pH của pha động cần được khống chế ở môi trường acid ($pH < 7$), phù hợp với khoảng làm việc an toàn của cột pha đảo ($pH = 2 - 9$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Đề tài sử dụng phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm đơn biến (thay đổi từng yếu tố tại một thời điểm trong khi giữ cố định các yếu tố khác), bao gồm:

  • Khảo sát phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trên máy Lambda 25 (Perkin Elmer) trong khoảng quét 300 - 600 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại trong các dung môi methanol (MeOH) và acetonitrile (ACN).
  • Khảo sát lựa chọn dung môi pha động hữu cơ (MeOH so với ACN).
  • Khảo sát ảnh hưởng của pH và bản chất chất điều chỉnh pH pha động: sử dụng acid acetic ($pH = 3{,}0; 3{,}6; 4{,}0; 4{,}5$), acid formic ($pH = 3{,}0$), đệm acetate ($pH = 4{,}2$) và acid phosphoric ($H_3PO_4$ nồng độ $0{,}03%$ và $0{,}072%$, tương ứng $pH = 2{,}6$ và $2{,}3$).
  • Khảo sát chế độ rửa giải: so sánh chế độ đẳng dòng (isocratic) với các chương trình rửa giải gradient biến thiên theo thời gian.
  • Khảo sát tốc độ dòng của pha động tại 4 mức: 0,6; 0,7; 0,85 và 1,0 mL/phút.
  • Phương pháp xử lý mẫu: kỹ thuật chiết rắn - lỏng có hỗ trợ rung siêu âm ở 40°C và ly tâm phân tách pha.

Phương pháp thẩm định được thiết kế căn cứ theo các hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích không tiêu chuẩn của ICH, ISO/IEC 17025, AOAC và TCVN 6910 (ISO 5725), bao gồm:

  • Tính đặc hiệu/chọn lọc: kiểm tra sự tương đồng thời gian lưu giữa mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn; đánh giá độ tinh khiết phổ của peak trên đầu dò PDA.
  • Khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy: dải nồng độ 0,05 - 2,00 ppm với tiêu chuẩn hệ số tương quan $R \ge 0{,}995$ và độ chệch nồng độ tại mỗi điểm chuẩn $\Delta_i \le \pm 15%$ (tại LOQ $\le \pm 20%$).
  • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): tính toán lý thuyết qua độ lệch chuẩn mẫu trắng ($S_y$) và độ dốc đường chuẩn ($B$), sau đó phối hợp thực nghiệm xác nhận theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền ($S/N = 3$ đối với LOD và $S/N = 10$ đối với LOQ).
  • Độ lặp lại: tiêm lặp lại 7 lần mẫu chuẩn hỗn hợp 2 ppm để tính độ lệch chuẩn tương đối $RSD(%)$.
  • Độ đúng: xác định thông qua hiệu suất thu hồi ($R%$) trên các nền mẫu măng, cải chua, thịt gà có thêm lượng chuẩn xác định (spiked samples), lặp lại tối thiểu 3 lần.

Trang thiết bị, hóa chất và nguồn dữ liệu

Hệ thống thiết bị chính gồm:

  • Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Waters 2996 tích hợp đầu dò dãy diode quang (PDA).
  • Cột sắc ký pha đảo Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18 ($5 \ \mu\text{m} \times 4{,}6 \text{ mm} \times 250 \text{ mm}$) kèm tiền cột bảo vệ Eclipse XDB - C18.
  • Bể rửa siêu âm Elmasonic S100H (Elma - Đức), máy ly tâm DNA concentrator, cân phân tích Sartorius CPA225D (độ chính xác $0{,}00001 \text{ g}$), máy đo quang phổ UV-Vis Lambda 25 (Perkin Elmer).
  • Hóa chất: Chất chuẩn Auramine O (Sigma-Aldrich, độ tinh khiết $\ge 85%$), Rhodamine B (Sigma-Aldrich, độ tinh khiết $\ge 95%$). Dung môi pha động và xử lý mẫu: Methanol (Merck KGaA $\ge 99{,}8%$, Labscan $\ge 99{,}9%$), Acetonitrile (Merck KGaA $\ge 99{,}9%$), acid phosphoric ($H_3PO_4 \ 85%$, Scharlau), acid formic ($98 - 100%$, Scharlau), acid acetic băng (Merck), amoniac dung dịch ($25 - 28%$, Guanghua), amoni acetate ($\ge 98%$, Merck).
  • Nguồn dữ liệu: Dữ liệu sắc ký thu nhận trực tiếp từ phần mềm điều khiển thiết bị HPLC Waters, dữ liệu phổ UV-Vis, và các số liệu tính toán thống kê xử lý bằng phần mềm Origin 8.1.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về cấu trúc, tính chất lý hóa, phạm vi ứng dụng công nghiệp và độc tính sinh học của hai phẩm màu Auramine O và Rhodamine B. Tác giả trình bày các dữ liệu dịch tễ học và độc chất học: Auramine O gây đột biến DNA trong tế bào gan, thận, tủy xương người và động vật thực nghiệm; Rhodamine B khi tích tụ trong cơ thể chuyển hóa thành các amine thơm gây tổn hại hệ bài tiết, hệ thần kinh và đột biến nhiễm sắc thể.

Tiếp đó, chương này khảo cứu tổng quan các công trình nghiên cứu định tính và định lượng hai chất này trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Công trình của nhóm tác giả nghiên cứu Rhodamine B trong ớt khô, nước ép và rượu vang đỏ sử dụng HPLC đầu dò huỳnh quang (Fluorescence), đạt LOD 0,1 - 0,2 ppb, LOQ 0,5 - 0,6 ppb, độ thu hồi 90,4% - 110,3%.
  • Nghiên cứu xác định đồng thời 7 phẩm màu cấm trong thực phẩm (bao gồm cả Auramine O và Rhodamine B) bằng HPLC-UV-Vis sử dụng pha động methanol - amonium acetate $50 \text{ mmol/L}$ (chỉnh pH đến 4 bằng $H_3PO_4$), đạt LOD 0,01 - 0,1 mg/L, độ thu hồi trên 80%.
  • Nghiên cứu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia phân tích Rhodamine B trong bột ớt, bột cà ri bằng HPLC-UV-Vis (bước sóng 550 nm), chỉ ra Rhodamine B bền nhiệt dưới 70°C nhưng suy giảm nồng độ đáng kể sau 4 ngày bảo quản dịch chiết.
  • Luận án của Lê Thị Hường Hoa xác định Rhodamine B trong mỹ phẩm trên cột Hypersil ODS dùng pha động tetrabutylammonium (TBA) 0,005 M - nước với LOD 0,8 ppm.

Phần cuối chương 1 dành cho việc trình bày lý thuyết hệ thống về sắc ký lỏng hiệu năng cao: định nghĩa, cấu tạo các khối chức năng của máy HPLC (bình chứa dung môi, bộ khử khí degasser, bơm cao áp tạo áp suất lên đến 400 bar, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký, detector) và ý nghĩa toán học của các đại lượng sắc ký đặc trưng.

Chương 2. Hóa chất và dụng cụ

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục chất chuẩn, dung môi độ tinh khiết HPLC, hóa chất tinh khiết phân tích và các thiết bị phục vụ nghiên cứu. Phần trọng tâm của chương tập trung vào thiết kế thực nghiệm:

  • Thiết lập quy trình khảo sát tối ưu hóa pha động theo trình tự 5 bước: dung môi pha động, pH, chương trình hóa dung môi (đẳng dòng/gradient), tốc độ dòng và tỷ lệ dung môi ban đầu.
  • Quy chuẩn hóa các bước thực hiện thẩm định phương pháp theo ISO/IEC 17025: cách thiết lập mẫu khảo sát tính chọn lọc (mẫu chuẩn, mẫu thực tế trắng, mẫu thực tế thêm chuẩn); quy cách pha loãng dãy chuẩn nồng độ 0,05 - 2,00 ppm từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm; công thức tính độ chệch $\Delta_i$; công thức toán học xác định LOD, LOQ và phương pháp kiểm chứng $S/N$; biểu thức tính hiệu suất thu hồi $R%$ và các chỉ số thống kê trung bình, độ lệch chuẩn $SD$, độ lệch chuẩn tương đối $RSD%$, khoảng tin cậy theo phân phối Student.
  • Quy trình lấy mẫu và bảo quản: Mẫu măng và cải chua (chợ Nhật Táo) và thịt gà (Lotte Mart Phú Thọ) sau khi mua về được xử lý cơ học (xay nhuyễn, để ráo nước đối với măng) và lưu trữ bảo quản trong tủ đông.
  • Quy trình chiết mẫu thực phẩm: Cân chính xác khoảng 5,0 g mẫu đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50 mL. Chiết lần 1 với 10 mL hỗn hợp dung môi acetonitrile - nước amoniac 0,5% ($70:30, \text{v/v}$), lắc 10 phút, rung siêu âm 10 phút tại 40°C, ly tâm 10 phút, gạn thu dịch vào bình định mức 10 mL. Chiết lặp lại lần 2 trên phần bã với 5 mL dung môi chiết theo đúng quy trình trên, gạn dịch vào bình định mức 5 mL.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày chuỗi kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình tối ưu hóa thiết bị, thẩm định và ứng dụng thực tế:

  • Khảo sát quang phổ: Đo UV-Vis các dung dịch chuẩn 2 ppm trong MeOH cho thấy Auramine O có cực đại hấp thụ tại bước sóng 345,34 nm ($A = 0{,}5007$) và 430,25 nm ($A = 0{,}3512$); Rhodamine B có cực đại tại 545,28 nm ($A = 0{,}3689$); dung dịch hỗn hợp hai chất thể hiện rõ các vùng hấp thụ đặc trưng của từng cấu tử. Tác giả chọn khoảng quét phổ PDA từ 400 - 600 nm để nhận diện và định lượng đồng thời cả hai chất.
  • Khảo sát dung môi pha động: So sánh hệ MeOH - $CH_3COOH$ ($pH = 4{,}5$) và ACN - $CH_3COOH$ ($pH = 4{,}5$) ở tốc độ 1 mL/phút. Dữ liệu cho thấy hệ ACN cho thời gian lưu ngắn hơn ($t_{R, AO} = 7{,}30$ phút; $t_{R, RB} = 10{,}05$ phút) nhưng chiều cao peak của cả hai chất đều thấp hơn nhiều so với hệ MeOH (chiều cao peak AO: 13224 so với 14955; RB: 10622 so với 34647), peak bị kéo đuôi nghiêm trọng. Do đó, MeOH được chọn làm dung môi hữu cơ pha động.
  • Tối ưu hóa pH pha động: Khi dùng acid acetic, đường nền bị trôi (dâng nền trước peak AO, sụt nền sau peak RB). Acid formic ($pH = 3{,}0$) chưa cải thiện triệt để tính đối xứng. Khi chuyển sang dùng acid phosphoric ($H_3PO_4$), cả hai nồng độ $0{,}03%$ ($pH = 2{,}6$) và $0{,}072%$ ($pH = 2{,}3$) đều cho peak tách sắc nét, độ phân giải $R_s > 1{,}5$, hệ số không đối xứng $T$ đạt mức lý tưởng ($0{,}9 - 1{,}2$). Nồng độ $H_3PO_4 \ 0{,}03%$ được chọn nhằm bảo vệ độ bền của cột sắc ký.
  • Khảo sát chế độ rửa giải: Phân tích đẳng dòng trên các hệ MeOH - HCOOH ($40:60$), ACN - HCOOH ($40:60$) và ACN - đệm acetate ($80:20$) đều cho thấy các peak không đáp ứng yêu cầu phân giải và định lượng. Vì vậy, tác giả xây dựng chương trình gradient giữa MeOH và dung dịch $H_3PO_4 \ 0{,}03%$ (bắt đầu tại tỷ lệ ban đầu 43,7% MeOH và 56,3% $H_3PO_4 \ 0{,}03%$).
  • Khảo sát tốc độ dòng: Thử nghiệm tại 0,6; 0,7; 0,85 và 1,0 mL/phút cho thấy tốc độ dòng 0,7 mL/phút mang lại sự cân bằng tối ưu giữa áp suất hệ thống, hình dạng peak và độ phân giải.
  • Thẩm định phương pháp: Đạt độ đặc hiệu cao trên đầu dò PDA; đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,05 - 2,00 ppm với $R \ge 0{,}995$; độ lệch chuẩn tương đối $RSD%$ khi tiêm lặp lại 7 lần đạt yêu cầu; hệ số thu hồi $R%$ đạt chuẩn trên các nền mẫu.
  • Phân tích mẫu thực tế: Áp dụng quy trình chiết xuất và thông số HPLC đã tối ưu lên các mẫu măng, cải chua và thịt gà thu thập từ chợ Nhật Táo và siêu thị Lotte Mart.

Chương 4. Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các kết quả đạt được của khóa luận: đã xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B bằng RP-HPLC-PDA; hoàn thiện quy trình xử lý mẫu chiết lỏng - rắn bằng ACN kiềm hóa; hoàn thành đầy đủ các chỉ tiêu thẩm định phương pháp. Đồng thời, tác giả đưa ra các kiến nghị về việc áp dụng phương pháp vào hoạt động kiểm tra an toàn thực phẩm thường quy và mở rộng nghiên cứu trên các đối tượng mẫu thực phẩm khác.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thông số kỹ thuật tối ưu của hệ thống HPLC

Qua các bước khảo sát thực nghiệm đơn biến, tác giả đã xác lập bộ điều kiện vận hành HPLC-PDA tối ưu để phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B:

Thông số vận hành Điều kiện tối ưu được lựa chọn Ghi chú kỹ thuật
Cột sắc ký pha đảo Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18 ($5 \ \mu\text{m}, 4{,}6 \times 250 \text{ mm}$) Có tiền cột bảo vệ Eclipse XDB - C18
Nhiệt độ cột tách $35^\circ\text{C} \pm 5^\circ\text{C}$ Duy trì ổn định nhiệt độ tách
Đầu dò phát hiện Detector PDA (Photodiode Array) Vùng quét phổ: 400 - 600 nm
Pha động Methanol (kênh A) và dung dịch $H_3PO_4 \ 0{,}03%$ (kênh B) Pha động được lọc qua màng 0,45 $\mu\text{m}$, khử khí
Chế độ rửa giải Rửa giải Gradient biến thiên nồng độ Điểm khởi đầu: 43,7% MeOH và 56,3% $H_3PO_4 \ 0{,}03%$
Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Áp suất cột ổn định, peak không bị doãng
Dung môi hòa tan chuẩn Methanol tinh khiết sắc ký Chuẩn bị từ dung dịch gốc 1000 ppm

Số liệu thực nghiệm khảo sát dung môi pha động ban đầu

Dữ liệu so sánh trực tiếp hai hệ dung môi MeOH - $CH_3COOH$ và ACN - $CH_3COOH$ ($pH = 4{,}5$, tốc độ 1,0 mL/phút, nồng độ chất phân tích 2,0 ppm) được ghi nhận trong văn bản như sau:

Đại lượng sắc ký Dung môi MeOH - $CH_3COOH$ (AO) Dung môi MeOH - $CH_3COOH$ (RB) Dung môi ACN - $CH_3COOH$ (AO) Dung môi ACN - $CH_3COOH$ (RB)
Thời gian lưu ($t_R$, phút) 7,92 13,83 7,30 10,05
Hệ số dung lượng ($k'$) 1,64 3,61 1,43 2,35
Hệ số không đối xứng ($T$) 13,62 1,17 4,63 12,52
Chiều cao peak sắc ký 14955 34647 13224 10622

Số liệu thực nghiệm chứng minh hệ dung môi chứa ACN làm suy giảm nghiêm trọng chiều cao peak của cả hai chất (ảnh hưởng tiêu cực đến LOD và LOQ) và gây méo peak lớn đối với RB ($T = 12{,}52$). Ngược lại, MeOH giữ được tín hiệu peak cao cho cả hai cấu tử; hiện tượng kéo đuôi của AO ($T = 13{,}62$) sau đó đã được khắc phục triệt để bằng việc thay đổi chất chỉnh pH sang acid phosphoric $H_3PO_4 \ 0{,}03%$, đưa hệ số không đối xứng của cả hai chất về dải tối ưu 0,9 - 1,2.

Đóng góp của đề tài so với các nghiên cứu trước

  1. Phân tích đồng thời: Khắc phục được tính đơn lẻ của các phương pháp phân tích trước đó (vốn chỉ định lượng riêng Auramine O hoặc Rhodamine B), tích hợp thành công hai chất màu cấm có tính chất hóa lý khác biệt vào một quy trình phân tích duy nhất trên cột C18.
  2. Đơn giản hóa hệ pha động: So với các nghiên cứu quốc tế phải dùng các muối đệm phức tạp như amonium acetate kết hợp acid orthophosphoric hoặc chất bắt cặp ion độc hại tetrabutylammonium (TBA), quy trình này chỉ sử dụng pha động gồm methanol và acid phosphoric loãng ($0{,}03%$), giúp tiết kiệm hóa chất, hạ giá thành phân tích và kéo dài tuổi thọ cột sắc ký.
  3. Quy trình chiết xuất hiệu quả cho nền mẫu hữu cơ phức tạp: Sử dụng hệ dung môi acetonitrile - nước amoniac 0,5% ($70:30, \text{v/v}$) kết hợp siêu âm nhiệt độ kiểm soát 40°C. Hệ dung môi này vừa tận dụng khả năng kết tủa protein triệt để của acetonitrile trên nền thịt gà, vừa tận dụng môi trường kiềm nhẹ của amoniac để giải phóng các phẩm màu base bám dính trên chất nền thực vật (măng, cải chua).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Căn cứ theo nội dung và phạm vi được tác giả trình bày trong văn bản:

Hạn chế của đề tài

  • Khảo sát thực nghiệm chỉ mới tiến hành trên số lượng mẫu thực tế còn hạn chế, tập trung tại một số địa điểm cụ thể trên địa bàn Quận 10, TP. Hồ Chí Minh (chợ Nhật Táo và siêu thị Lotte Mart Phú Thọ), chưa phản ánh toàn diện tình trạng nhiễm phẩm màu trên thị trường thực phẩm diện rộng.
  • Giới hạn phát hiện của phương pháp phụ thuộc vào độ nhạy của detector quang học PDA, phù hợp cho phân tích mức vi lượng thông thường nhưng chưa đạt đến độ nhạy siêu vết như các hệ thống sắc ký ghép khối phổ cao cấp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng phạm vi ứng dụng quy trình phân tích trên nhiều đối tượng thực phẩm có nguy cơ cao khác như gia vị tổng hợp, bột sa tế, tương ớt, hạt dưa, nước giải khát và bánh kẹo.
  • Mở rộng khảo sát lấy mẫu trên quy mô thị trường lớn hơn để đánh giá toàn diện bức tranh an toàn thực phẩm đối với phẩm màu công nghiệp.
  • Nghiên cứu chuyển giao hoặc đối chiếu phương pháp trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) nhằm nâng cao độ nhạy, khẳng định cấu trúc các chất ở nồng độ siêu vết và phục vụ công tác thanh tra liên phòng kiểm nghiệm.

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu:

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa học môi trường, Công nghệ thực phẩm, Kiểm nghiệm dược phẩm - thực phẩm; kiểm nghiệm viên tại các trung tâm phân tích, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm và các phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
  • Các phần nội dung đáng tham khảo:
    • Quy trình tối ưu hóa các thông số pha động sắc ký: Phần lập luận lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại, tối ưu hóa pH để triệt tiêu hiện tượng kéo đuôi peak base trên cột silica C18 là bài học thực nghiệm mẫu mực cho việc phát triển phương pháp sắc ký pha đảo.
    • Quy trình xử lý mẫu thực phẩm: Các bước xử lý nền mẫu giàu protein và chất xơ bằng hỗn hợp acetonitrile kiềm hóa ($ACN - NH_3$) kết hợp rung siêu âm nhiệt độ $40^\circ\text{C}$ có thể áp dụng trực tiếp cho các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm.
    • Bộ tiêu chí thẩm định phương pháp: Cung cấp đầy đủ công thức toán học và quy trình thực nghiệm để đánh giá tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại và độ đúng theo chuẩn mực quốc tế ICH và ISO 17025.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn dung môi hữu cơ pha động là Methanol thay vì Acetonitrile?

Trong quá trình khảo sát thực nghiệm với acid acetic ($pH = 4{,}5$), mặc dù dung môi acetonitrile (ACN) cho thời gian lưu ngắn hơn ($7{,}30$ phút cho AO và $10{,}05$ phút cho RB so với $7{,}92$ và $13{,}83$ phút của methanol), nhưng chiều cao peak của cả hai chất khi dùng ACN đều thấp hơn đáng kể (chiều cao peak AO đạt 13224, RB đạt 10622 so với 14955 và 34647 khi dùng MeOH). Chiều cao peak thấp làm giảm độ nhạy và làm tăng giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp. Đồng thời, dung môi ACN khiến peak của cả hai chất đều bị kéo đuôi trên một khoảng rất rộng ($T$ của RB lên tới 12,52). Do đó, tác giả lựa chọn methanol để đảm bảo độ nhạy cao và peak sắc ký hẹp hơn.

2. Acid phosphoric ($H_3PO_4$) nồng độ nào được chọn để điều chỉnh pH pha động và vì sao không dùng acid acetic hay acid formic?

Tác giả đã chọn dung dịch acid phosphoric $H_3PO_4 \ 0{,}03%$ (tương ứng $pH = 2{,}6$). Các kết quả khảo sát cho thấy acid acetic khiến đường nền không ổn định (dâng nền trước peak AO và sụt nền sau peak RB), còn acid formic ở $pH = 3{,}0$ vẫn chưa tối ưu được độ đối xứng của peak. Khi sử dụng $H_3PO_4$, các peak AO và RB tách tốt, độ phân giải đạt chuẩn ($R_s > 1{,}5$), đường nền phẳng và hệ số không đối xứng $T$ nằm trong khoảng lý tưởng từ $0{,}9$ đến $1{,}2$. Tác giả chọn nồng độ $0{,}03%$ thay vì $0{,}072%$ vì kết quả sắc ký của hai nồng độ này tương đương nhau, nhưng nồng độ acid thấp hơn sẽ giúp bảo vệ cột C18 khỏi bị thủy phân pha tĩnh theo thời gian.

3. Quy trình chiết xuất mẫu thực phẩm được thực hiện như thế nào và tỷ lệ dung môi chiết là bao nhiêu?

Quy trình chiết xuất sử dụng hệ dung môi gồm acetonitrile và nước amoniac 0,5% theo tỷ lệ thể tích $70:30$ ($v/v$). Mẫu thử được cân khoảng 5 gam (chính xác đến 0,00001 g) vào ống ly tâm 50 mL. Quá trình chiết gồm hai giai đoạn: Lần 1 thêm 10 mL dung môi chiết, lắc 10 phút, rung siêu âm 10 phút ở nhiệt độ 40°C, ly tâm 10 phút, gạn thu dịch vào bình định mức 10 mL; Lần 2 thêm tiếp 5 mL dung môi chiết vào phần bã, lặp lại các thao tác lắc, siêu âm và ly tâm, sau đó thu dịch vào bình định mức 5 mL. Dung môi acetonitrile đóng vai trò kết tủa các protein hòa tan, trong khi môi trường amoniac giúp chiết triệt để phẩm màu dạng base.

4. Khoảng tuyến tính và các tiêu chuẩn đánh giá đường chuẩn của phương pháp được thiết lập như thế nào?

Đường chuẩn của Auramine O và Rhodamine B được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 0,05 ppm đến 2,00 ppm trên cơ sở đo lặp lại 2 đến 3 lần mỗi điểm chuẩn pha trong methanol. Mối quan hệ giữa diện tích peak ($S$) và nồng độ ($C$) được xử lý hồi quy tuyến tính qua phương trình $Y = A + BX$ bằng phần mềm Origin 8.1. Tiêu chuẩn nghiệm thu đường chuẩn gồm: hệ số tương quan $R$ phải nằm trong khoảng $0{,}995 \le R \le 1$ ($R^2 > 0{,}99$) và độ chệch nồng độ tính ngược ($\Delta_i$) của các điểm chuẩn không được vượt quá $\pm 15%$ đối với các nồng độ thông thường và không quá $\pm 20%$ tại điểm LOQ.

5. Thiết bị sắc ký và chủng loại cột phân tích cụ thể được sử dụng trong khóa luận là gì?

Nghiên cứu sử dụng hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với bơm cao áp Waters 2996 tích hợp đầu dò dãy diode quang (PDA). Cột sắc ký phân tích là cột pha đảo C18 thương mại của hãng Agilent (Hoa Kỳ) mang tên Zorbax Eclipse XDB - C18 với kích thước hạt nhồi $5 \ \mu\text{m}$, đường kính trong $4{,}6 \text{ mm}$ và chiều dài cột $250 \text{ mm}$, kết hợp cùng tiền cột bảo vệ Eclipse XDB - C18 4-Pack cùng hãng để loại bỏ tạp chất và bảo vệ cột chính.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thanh Thơi đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc thiết lập và tối ưu hóa thành công quy trình phân tích đồng thời hai phẩm màu cấm Auramine O và Rhodamine B trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò PDA. Phương pháp sử dụng cột pha đảo Zorbax Eclipse XDB - C18 với chương trình rửa giải gradient dung môi methanol và dung dịch $H_3PO_4 \ 0{,}03%$, kết hợp kỹ thuật chiết rắn - lỏng bằng acetonitrile kiềm hóa hỗ trợ siêu âm nhiệt. Toàn bộ quy trình đã được thẩm định đầy đủ về tính chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ lặp lại và độ đúng theo các chuẩn mực của ISO/IEC 17025 và ICH, mang lại khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong công tác giám sát, kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.