ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật đa dạng và chứa nhiều công dụng. Tác dụng chữa bệnh của cây chính là do các hợp chất tự nhiên có chứa ở trong chúng quyết định. Đã có một thời, các sản phẩm hóa dược chiếm ưu thế trên thị trường, còn các cây thuốc, bài thuốc dân tộc có lúc chỉ được quan tâm rất ít hoặc gần như không được coi trọng. Nhưng sau nhiều năm sử dụng, một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc tổng hợp đã bộc lộ những nhược điểm, như gây ra những tai biến hoặc tác dụng phụ có hại về lâu dài…Nên xu hướng chung của thế giới, trước hết là các nước đang phát triển quay trở lại với cây cỏ làm thuốc.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể. Một xu hướng quan trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc mới. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc.
Chính vì thế, dược phẩm với hoạt chất từ nguồn thiên nhiên đã trở thành đề tài nghiên cứu hàng đầu được các nhà khoa học quan tâm và ứng dụng rộng rãi. Berberin là alkaloid đã được phát hiện đầu tiên ở các loài Hoàng liên thuộc chi Hoàng liên gai (Berberis) và trong họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) - phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm cả Trung Quốc và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây phân bố chủ yếu trên những vùng núi cao Sa Pa tỉnh Lào Cai. Trước đây, hoàng liên gai được sử dụng ngâm rượu trị đau răng, huyết áp cao, đau đầu, chóng mặt, đau ngang lưng, SVTH: LÊ NGỌC HÂN 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.
NGUYỄN MINH HOÀNG đau bụng hoặc sắc thuốc uống, ngày nay berberin điều trị đau bụng, chống ung thư, làm giảm lượng cholesterol, kháng nấm, kháng virus (Đỗ Tất Lợi, 2004). Nhiều công ty dược trong nước đã sản xuất thuốc từ berberin như berberin-10 (công ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long – Vĩnh Long), Hoàng liên ĐY (công ty cổ phần Dược phẩm Đại Y- Hà Nội),… Các sản phẩm đang được tiêu thụ khá nhiều trên thị trường. Tuy nhiên, loại thuốc chứa berberin được bày bán trên thị trường hiện nay phần lớn đều nhập từ Trung Quốc nên không chủ động trong việc quản lý nguồn nguyên liệu, hoạt tính không kiểm soát được, trong khi nguồn dược liệu cây hoàng liên gai ở nước ta khá phong phú. Vì vậy, vấn đề đặt ra ở đây là phải nghiên cứu, xây dựng một quy trình chiết xuất berberin từ hoàng liên gai đạt hiệu quả cao, có khả năng ứng dụng trong công nghiệp để tận dụng nguồn dược liệu có sẵn của nước nhà.
Từ đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất tối ưu berberin từ cây Hoàng liên gai (Berberis wallichiana D. Đây sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên với độ tinh sạch, hoạt tính cao trong việc phòng và chữa bệnh. Mục tiêu đề tài: - Nghiên cứu quy trình chiết xuất berberin từ Hoàng liên gai. - Cô lập và tinh sạch hợp chất berberin thu được.
SVTH: LÊ NGỌC HÂN 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG 1. Tổng quan về hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC) 1. Đặc điểm Cây hoàng liên gai có tên khoa học là Berberis wallichiana DC, thuộc họ hoàng liên gai Berberidaceae.
Hoàng liên gai còn có tên gọi khác là hoàng mù- hoàng mộc, hoàng liên ba gai, tiểu la tán, tiểu nghiệt (Đỗ Tất Lợi, 2004). Ngoài ra còn có tên nước ngoài Wallich’s barberry, Wallich’s berberis. Hoàng liên gai (Berberis wallichiana DC) Cây bụi gai, cao 2-3 m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài 1-1,5 cm. Lá mọc thành chùm 3-4 lá, có khi đến 8 lá trên cùng mốt đốt.
Cuống lá dạng ngắn 0,5-1 cm, phiến lá nguyên có hình mác, mép có răng cưa to, cứng dài. SVTH: LÊ NGỌC HÂN 12 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG Hoa có màu vàng, mọc thành chùm. Quả mọng hình trái xoan, mọc trên cuống khi chính có màu tím đen bên trong có chứa hạt (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Phân bố và sinh thái Cây hoàng liên gai phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới châu Á, bao gồm Trung Quốc và Ấn độ, và một số nước cộng hòa Liên Xô. Ở Việt Nam, cây phát triển chủ yếu ở vùng núi cao Lào Cai. Hoàng liên gai là cây ưa sáng, ẩm và có khí hậu mát quanh năm. Cây thường mọc lẫn với các loại cây bụi khác trên núi đá với độ cao 1600-1700 m (Đỗ Huy Bích, 2004).
Thành phần hóa học Rễ hoàng liên gai chứa alkaloid berberin với hàm lượng 3 - 4%. Ngoài ra, vỏ rễ còn chứa alkaloid (Đỗ Huy Bích, 2004). Tác dụng dược lý Hoàng liên gai được dùng làm thuốc chữa đi lỵ, đau mắt, ăn uống khó tiêu. Hoàng liên gai có thể dùng ngâm rượu chữa những triệu chứng của huyết áp cao như hoa mắt, nhức đầu, đau ngang lưng.
Ngoài ra, còn có thể chữa đau răng (Đỗ Tất Lợi, 2004). Sơ lược về berberin Berberin có tên khoa học là 5,6 dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a- azonizindeno(5,6-a) anthraacen clorid dihydrat. Một loại alkaloid chủ yếu trong hoàng liên gai, chiếm từ 3 - 4% có tác dụng kháng khuẩn, chữa lỵ, tiêu hóa kém và đau mắt. SVTH: LÊ NGỌC HÂN 13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.
NGUYỄN MINH HOÀNG Công thức cấu tạo: Hình 1. Công thức cấu tạo berberin Công thức phân tử: C20H18NO4Cl. Tính chất vật lý Berberin là alkaloid ở dạng tinh thể hay bột kết tinh có màu vàng, không mùi, có vị đắng. Berberin clorua rất ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, hầu như không tan trong cồn lạnh.
Berberin sulfat tan tốt trong nước, tan nhiều trong cồn. Nhiệt độ nóng chảy: 145oC. SVTH: LÊ NGỌC HÂN 14 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG 2.
Tính chất hóa học Hóa tính của N : N của berberin là hydroxyd amoni bậc 4 đem tính kiềm cho phân tử. Có thể cho muối cloride với HCl. Hóa tính của oxy: Có hóa chức ete có thể phân hủy cho alcol, riêng OH trong hydroxyd amoni bậc 4 : N không vững bền, trong môi trường kiềm dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal tương ứng (Từ Minh Koóng, 2007). Định tính berberin Hòa tan 10 mg chế phẩm trong 20 ml nước nóng, làm lạnh và thêm 1 ml dung dịch kali iodid 16,5 %, tủa màu vàng xuất hiện.
Hòa tan 0,1 g chế phẩm trong 20 ml mước bằng cách đun nóng, thêm 0.5 ml acid nitric đậm đặc (TT), làm lạnh, để yên 10 phút, lọc. Lấy 3 ml dịch lọc thêm 1 ml dung dịch bạc nitrat 2 % (TT), sẽ xuất hiện kết tủa trắng. Tủa này không tan trong acid nitric loãng (TT), nhưng tan được trong dung dịch amoniac (TT) quá thừa. Hòa tan 5 mg chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % (TT).
Lắc đều, thêm một ít bột cloramin B (TT) sẽ có màu đỏ anh đào (Dược điển Việt Nam IV). Hoạt tính sinh học Berberin là một loại thuốc có hoạt tính kháng sinh, chống viêm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra berberin còn chống lại nhiều vi khuẩn gram (-) và gram (+) và các vi khuẩn kháng acid khác. Trên lâm sàng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột thì berberin có hoạt tính tốt hơn furazolidon, metronidazol và quimacrin.
Berberin có tác dụng kháng khuẩn với Shigella, tụ cầu và liên cầu (Phạm Thiệp, 2002). Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với các β-lactam bán tổng hợp (ampicillin và oxacicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim) trên Staphylococcus aureus và không hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3 (Đinh Thị Liên, 2011). SVTH: LÊ NGỌC HÂN 15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG Ở nước ta, năm 1972 Phan Quốc Kinh và Đặng Thị Hồng Vân (Trường Đại học Hà Nội) đã nghiên cứu điều chế berberin từ hoàng liên gai để góp phần chủ yếu dập tắt dịch lỵ trong thời gian đó.
Có tác dụng điều trị đau mắt hột ở các giai đoạn khác nhau. Sau một đợt điều trị ba tuần bằng thuốc nhỏ mắt berberin thì đã không tìm thấy vi khuẩn Chlamydia trachomatis ở mắt bệnh nhân. Về điều này, berberin hơn hẳn sulfacetamid. Berberin có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh Streptococus pyogenes.
Các nghiên cứu mới nhất chứng minh gần, khi dùng phối hợp berberin với một số kháng sinh sẽ làm hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột (Phan Quốc Kinh, 2009). Tại Trung Quốc, năm 2006 tác giả Ben Liu và cộng sự đã tách chiết berberine từ thân rễ hoàng liên Trung Quốc sử dụng chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn (Liu, 2006). Năm 1976, các cơ sở y tế Sài Gòn, quân khu 5, xí nghiệp dược phẩm Hà Nội, Học viện Quân y nghiên cứu chiết xuất berberin hiệu quả thu được: đã chiết được hàng chục tấn berberin clorid tinh khiết. Để sản xuất ra hàng loạt viên berberin có hàm lượng 0,05 g thì 1 tấn berberin có thể sản xuất ra khoảng 20 triệu viên.
Năm 1982, Proefschrift (Hà Lan) nghiên cứu cây Coscinium fenestratum ở Indonexia. Theo tác giả so sánh cây này thấy đồng tên với cây Coscinium usitatum Pierre ở Đông Dương của Pierre tiêu bản số 1312 lưu trữ tại Leningrat, Newyork. Nghiên cứu xác định hóa học của vàng đắng thấy có 6 alkaloid: berberin, jatrorrhizin, palmatin, berberubin, magnoflorin, thalifendin. Từ alkaloid berberin có thể bán tổng hợp thành những muối khác nhau của berberin và những cộng hợp đồng phân tử (berberin sulfamid.
Berberin có tác dụng diệt khuẩn Vibrio cholerae ở nồng độ 35 µg/ml và khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 50 µg/ml. Ở nồng độ 10-25 µg/ml, berberin có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài nấm Altemaria spp.fumigatus,… SVTH: LÊ NGỌC HÂN 16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG Cả berberine sulfat và berberine cloride đều kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào Ehrlich và tế bào gây ung thư máu ( Lã Đình Mới, 2005).