Luận án tiến sĩ nghiên cứu phối hợp estcrase và bảo vệ enzyme thủy phân tử nằm trong chuyển hóa phụ phẩm côngnông nghiệp để thu nhận bioethanol

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phối hợp esterase và bảo vệ enzyme thủy phân trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol hiệu quả.

• Tác giả: Vũ Đình Giáp
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Hữu Nghị
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phối hợp esterase và bảo vệ enzyme thủy phân trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để sản xuất bioethanol
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose
• 1.1.1. Nguồn gốc và thành phần
• 1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía
• 1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam
• 1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía
• 1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose
• 1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose
• 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học
• 1.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose
• 1.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose
• 1.4.1. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose
• 1.4.1.1. Acetyl esterase từ nấm
• 1.4.1.2. Feruloyl esterase từ nấm
• 1.5. Tình hình sản xuất bioethanol
• 1.5.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol
• 1.5.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol
• 1.5.3. Lên men sản xuất bioethanol
• 1.6. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngoài nước
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu giàu lignocellulose
• 2.2. Vi sinh vật
• 2.3. Thiết bị, hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp vi sinh vật
• 2.4.1.1. Phân lập nấm
• 2.4.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men
• 2.4.1.3. Lên men bioethanol
• 2.4.1.4. Định danh nấm
• 2.4.1.4.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu
• 2.4.1.4.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
• 2.4.1.5. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm
• 2.4.1.5.1. Sàng lọc trên đĩa thạch
• 2.4.1.5.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể
• 2.4.1.6. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme
• 2.4.1.6.1. Hoạt độ acetyl esterase
• 2.4.1.6.2. Hoạt độ feruloyl esterase
• 2.4.1.7. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase
• 2.4.1.7.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose
• 2.4.1.7.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp
• 2.4.1.8. Tinh sạch protein enzyme
• 2.4.1.8.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme
• 2.4.1.8.2. Xác định hàm lượng protein
• 2.4.1.8.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS
• 2.4.1.8.4. Điện di điểm đẳng điện
• 2.4.1.8.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch
• 2.4.1.8.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch
• 2.4.2. Phương pháp hóa sinh
• 2.4.2.1. Sắc ký bản mỏng
• 2.4.2.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
• 2.4.2.3. Xác định peptide bằng phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS
• 2.4.2.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic
• 2.4.2.5. Xử lý nguyên liệu
• 2.4.2.6. Xác định hàm lượng bioethanol
• 2.4.2.7. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose
• 2.4.2.8. Quy hoạch thực nghiệm
• 2.4.2.9. Xử lý số liệu
• 2.4.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu
• 2.4.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm
• 2.4.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”
• 2.4.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và sàng lọc nấm
• 3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota
• 3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota
• 3.1.3. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm
• 3.2. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao
• 3.2.1. Định danh chủng SP66
• 3.2.2. Định danh chủng A35
• 3.3. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase
• 3.3.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.
• 3.3.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt.
• 3.4. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm
• 3.4.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X.
• 3.4.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt.
• 3.5. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm
• 3.5.1. Acetyl esterase từ nấm X.
• 3.5.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt.
• 3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh học
• 3.6.1. Sàng lọc cơ chất
• 3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học
• 3.7. Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm
• 3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa
• 3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”
• 3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”
• 3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”
• 3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa
• 3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol
• 3.9.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường
• 3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men
• 3.9.3. Ảnh hưởng pH
• 3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ
• 3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men
• 3.10. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc phối hợp esterase và bảo vệ enzyme thủy phân để chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp thành bioethanol. Phụ phẩm công nông nghiệp giàu lignocellulose như bã mía, rơm rạ là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất bioethanol. Tuy nhiên, việc chuyển hóa lignocellulose thành đường lên men đòi hỏi sử dụng hiệu quả các enzyme thủy phân và enzyme esterase. Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa quy trình sử dụng enzyme cocktail để tăng hiệu suất chuyển hóa và sản xuất bioethanol.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là khai thác hiệu quả enzyme esterase và enzyme thủy phân từ nấm để chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp thành đường lên men. Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập, sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase, đồng thời tối ưu hóa quy trình sử dụng enzyme cocktail để chuyển hóa lignocellulose.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc tận dụng phụ phẩm công nông nghiệp để sản xuất bioethanol, góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường và tạo ra nguồn năng lượng tái tạo. Việc sử dụng enzyme cocktail giúp tăng hiệu suất chuyển hóa, giảm chi phí sản xuất và thúc đẩy phát triển công nghệ sinh học.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập, sàng lọc và tinh sạch enzyme esterase từ nấm. Quy trình bao gồm phân lập các chủng nấm từ môi trường tự nhiên, sàng lọc hoạt tính acetyl esterase và feruloyl esterase, và tinh sạch enzyme để xác định đặc tính hóa sinh. Enzyme cocktail được tối ưu hóa để chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp thành đường lên men.

2.1. Phân lập và sàng lọc nấm

Các chủng nấm được phân lập từ môi trường giàu lignocellulose. Hoạt tính acetyl esterase và feruloyl esterase được đánh giá thông qua các phương pháp hóa sinh. Các chủng nấm có hoạt tính cao được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn.

2.2. Tinh sạch enzyme

Các enzyme được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng và điện di. Đặc tính hóa sinh của enzyme như nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu và độ bền được xác định. Kết quả cho thấy acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha và feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima có hoạt tính cao và độ bền tốt.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã phân lập được 44 chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme esterase. Acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha và feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima được tinh sạch và có hoạt tính cao. Enzyme cocktail được tối ưu hóa để chuyển hóa bã mía thành đường lên men với hiệu suất đạt 49,8%. Các đường đơn thu được có khả năng lên men thành bioethanol với hiệu suất 79,8%.

3.1. Hiệu suất chuyển hóa

Enzyme cocktail bao gồm acetyl esterase, feruloyl esterase và các enzyme thủy phân khác được sử dụng để chuyển hóa bã mía. Kết quả cho thấy tổng lượng đường lên men đạt 251,86 mg/g khi sử dụng enzyme cocktail và tăng lên 319,5 mg/g khi kết hợp với xử lý axit.

3.2. Sản xuất bioethanol

Các đường đơn thu được từ quá trình chuyển hóa được lên men bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Hàm lượng bioethanol thu được là 178 ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng của enzyme cocktail trong sản xuất bioethanol từ phụ phẩm công nông nghiệp.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng enzyme esterase và enzyme thủy phân trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp thành bioethanol. Enzyme cocktail được tối ưu hóa giúp tăng hiệu suất chuyển hóa và sản xuất bioethanol. Nghiên cứu đề xuất tiếp tục phát triển công nghệ này để ứng dụng rộng rãi trong sản xuất năng lượng tái tạo.

4.1. Đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu đã phân lập và tinh sạch thành công acetyl esterase và feruloyl esterase từ nấm, đồng thời tối ưu hóa quy trình sử dụng enzyme cocktail để chuyển hóa lignocellulose. Đây là bước tiến quan trọng trong việc sản xuất bioethanol từ phụ phẩm công nông nghiệp.

4.2. Hướng phát triển

Nghiên cứu đề xuất tiếp tục nghiên cứu để cải thiện hiệu suất chuyển hóa và giảm chi phí sản xuất. Việc ứng dụng công nghệ này trong quy mô công nghiệp sẽ góp phần giải quyết vấn đề năng lượng và môi trường tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nhu cầu năng lượng và sự cạn kiệt của nhiên liệu hóa thạch thúc đẩy xu hướng phát triển năng lượng sinh học trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại các quốc gia nông nghiệp. Tại Việt Nam, Quyết định số 177/2007/QĐ-TT của Thủ tướng Chính phủ và Thông báo số 255/TB-VPCP quy định lộ trình áp dụng rộng rãi xăng sinh học E5 (chứa 5% bioethanol) trên toàn quốc từ ngày 01/01/2018. Tuy nhiên, việc sản xuất bioethanol thế hệ I từ các nguồn tinh bột (ngô, sắn) và đường (mía) gặp nhiều trở ngại do cạnh tranh nguồn nguyên liệu phục vụ an ninh lương thực, giá sắn lát tăng cao dẫn đến phần lớn nhà máy sản xuất cồn sinh học phải tạm ngừng hoạt động.

Việc chuyển hướng sang sản xuất bioethanol thế hệ II từ sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose (như rơm rạ, thân cây ngô, bã mía) là giải pháp tái tạo nguồn năng lượng sạch. Hiện nay, hàng triệu tấn bã mía thải ra mỗi năm chủ yếu được xử lý bằng cách đun nấu thủ công hoặc đốt ngoài trời, phát thải lượng lớn khí độc hại ($CO$, $CO_2$, hydrocarbon, bụi tro), gây sương mù quang hóa và ô nhiễm môi trường. Mặc dù giàu polymer hữu cơ, cấu trúc phức tạp và liên kết chéo bền vững của lignocellulose tạo nên rào cản lớn đối với quá trình phân giải sinh học. Các enzyme thủy phân thông thường hoạt động rất yếu trên cơ chất thô nếu thiếu tiền xử lý và thiếu sự phối hợp xúc tác hiệp đồng. Luận án giải quyết khoảng trống nghiên cứu này thông qua việc phân lập các chủng nấm bản địa, tinh sạch các enzyme carbohydrate esterase chưa từng được khai thác ở Việt Nam, và xây dựng hệ xúc tác phối hợp ("enzyme cocktail") nhằm nâng cao hiệu quả chuyển hóa bã mía thành đường lên men bioethanol.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Khai thác nguồn xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ phụ phẩm công - nông nghiệp thành các loại đường ($C_5$ và $C_6$) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol.
2. Sử dụng hỗn hợp "enzyme cocktail" xúc tác hiệp đồng, trong đó phối hợp các carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE) và acetyl esterase (AE)] với các enzyme phân cắt mạch chính (cellulase/xylanase) để thủy phân cấu trúc lignocellulose.
3. Đánh giá khả năng lên men nguồn dịch đường thu được sau quá trình chuyển hóa bằng "enzyme cocktail" thành bioethanol ở quy mô phòng thí nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Các chủng nấm sợi thuộc ngành nấm Đảm (Basidiomycota) và nấm Túi (Ascomycota) có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase (AE và FAE).
  • Chủng nấm Alternaria tenuissima SP66 sinh tổng hợp feruloyl esterase và chủng Xylaria polymorpha A35 sinh tổng hợp acetyl esterase.
  • Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 phục vụ lên men dịch đường thành bioethanol.
  • Các nguồn phụ phẩm giàu lignocellulose: bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi; trong đó bã mía là cơ chất trọng tâm.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên phối hợp với Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành năm 2019, sử dụng dữ liệu thực nghiệm và số liệu thống kê sản xuất mía đường, nhiên liệu sinh học giai đoạn 2012–2018.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước

Luận án đã điểm lại các công trình khoa học trong và ngoài nước liên quan đến cấu trúc sinh khối, enzyme phân giải và công nghệ sản xuất bioethanol:

• Cấu trúc lignocellulose và tiền xử lý sinh khối: Lilholt (thành phần pectin trong sợi thực vật), Hamelinck và cộng sự (2005) (vai trò phá vỡ cấu trúc lignocellulose của tiền xử lý), Taniguchi và cộng sự (2005) (tiền xử lý rơm lúa bằng bốn loài nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, Pleurotus ostreatus), Kurakake và cộng sự (thu hồi 94% đường từ giấy văn phòng bằng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và Bacillus circulans).
• Thủy phân sinh khối bằng hóa chất kết hợp enzyme: Saha (2005) (tiền xử lý rơm bằng $H_2SO_4$ 0,75% kết hợp enzyme cocktail ở 45°C, pH 5,0, thu 465 mg/g đường khử và 0,24 g/g bioethanol với E. coli tái tổ hợp), Antonio (2004) (thủy phân bã mía bằng $HNO_3$ 6% ở 122°C tạo 18,6 g/l xylose, 2,04 g/l arabinose và 2,87 g/l glucose), Satriyo (2014) (tiền xử lý bã mía bằng NaOH kết hợp cellulase từ Trichoderma reesei, lên men đạt 15,37 g/l bioethanol), Maria Carolina (2013) (xử lý bã mía bằng kiềm và cellulase 10 FPU/g, giảm 83% lignin, lên men S. cerevisiae UFPEDA 1238 tăng 4 lần ethanol), Silverstein (2007) (chuyển hóa thân cây bông bằng $H_2SO_4$, NaOH, ozon kết hợp Celluclast 1.5 L và Novozym 188), Aderemi (2008) (sản xuất glucose từ rơm rạ bằng Aspergillus niger ở 45–50°C, pH 4,5–5).
• Hệ enzyme carbohydrate esterase: Các nghiên cứu về acetyl esterase từ Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum; feruloyl esterase từ Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Penicillium funiculosum, Neurospora crassa, Clostridium sp., Paenibacillus terrae ME27-1.
• Bối cảnh sản xuất bioethanol: Mô hình công nghiệp quy mô lớn từ ngô và cellulose tại Mỹ (nhà máy Liberty của liên doanh Poet-DSM), mô hình cồn từ mía tại Brazil (Tập đoàn Unica), các chính sách tại EU, Trung Quốc, Thái Lan, và hiện trạng 7 nhà máy bioethanol tại Việt Nam (Dung Quất, Bình Phước, Phú Thọ, Đại Tân, Đại Việt, Đắk Tô).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù khu hệ nấm Việt Nam có tính đa dạng sinh học cao, việc phân lập và khai thác các enzyme carbohydrate esterase (FAE, AE) từ nấm bản địa phục vụ phân cắt các liên kết ester liên mạng giữa lignin và xylan hầu như chưa được công bố. Hầu hết các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung vào hệ enzyme cellulase/xylanase đơn lẻ hoặc các phương pháp hóa lý truyền thống. Luận án lựa chọn giải quyết việc phân lập, tinh sạch hai enzyme esterase mới từ chủng nấm bản địa, xác định các thông số hóa sinh, và phối hợp chúng với hệ cellulase/xylanase trong một "enzyme cocktail" tối ưu để thủy phân bã mía thành dịch đường lên men bioethanol.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Cấu trúc phức hợp lignocellulose: Bao gồm cellulose (polymer mạch thẳng gồm các đơn vị D-glucose liên kết $\beta$-1,4-glucoside, độ trùng hợp lên đến 10.000 đơn vị), hemicellulose (polymer phân nhánh, mạch chính là $\beta$-D-xylopyranose liên kết $\beta$-1,4, bị acetyl hóa ở vị trí C2/C3 và gắn nhánh arabinose), và lignin (polyphenol vô định hình gồm các đơn vị phenylpropene: p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol, sinapyl alcohol).
• Cơ chế phân giải enzyme: Quá trình thủy phân đòi hỏi sự phối hợp đồng thời của:
  • Hệ cellulase: Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), Exo-1,4-glucanase / cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), và $\beta$-glucosidase / cellobiase (EC 3.2.1.21).
  • Hệ xylanase: Endo-xylanase, exo-xylanase, $\beta$-xylosidase, $\alpha$-L-arabinofuranosidase, $\alpha$-D-glucuronidase, endo-$\beta$-1,4-mannanase (EC 3.2.1.78).
  • Hệ carbohydrate esterase (CE): Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) loại bỏ nhóm O-acetyl trên C2/C3 của xylopyranosyl; Feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) thủy phân liên kết ester giữa xylan và lignin qua phân tử arabinose và axit ferulic.
• Cơ chế xúc tác esterase: Cơ chế hai bước của họ nếp gấp $\alpha/\beta$-hydrolase gồm bước acetyl hóa (tấn công nucleophile của gốc Ser thuộc bộ ba xúc tác Ser-His-Asp vào nhóm carbonyl của liên kết ester) và bước deacyl hóa (phân tử nước giải phóng gốc alcol và tái sinh enzyme).
• Lý thuyết lên men bioethanol: Quá trình lên men yếm khí glucose bởi nấm men theo phương trình tổng quát của Gay-Lussac (1810): $$C_6H_{12}O_6 \rightarrow 2,C_2H_5OH + 2,CO_2 + Q$$

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm từ tự nhiên; nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, môi trường lên men bề mặt và môi trường lỏng; nuôi cấy, bảo quản và lên men nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1.
• Phương pháp định danh sinh học:
  • Định danh hình thái giải phẫu: Quan sát sự phát triển khuẩn lạc trên môi trường thạch và cấu trúc hình thái bào tử dưới kính hiển vi.
  • Định danh sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số, điện di gel agarose 1%, khuếch đại gen chỉ thị bằng phản ứng PCR, giải trình tự gen, tra cứu bằng công cụ BLAST và xây dựng cây phát sinh loài.
• Phương pháp hóa sinh và phân tích:
  • Đánh giá hoạt độ enzyme: Đo mật độ quang (OD) xác định hoạt độ AE qua phản ứng thủy phân cơ chất $\rho$-Nitrophenyl acetate và hoạt độ FAE qua cơ chất methyl ferulate.
  • Tinh sạch protein: Tách chiết từ dịch nuôi cấy, siêu lọc qua màng cắt 10 kDa (Amicon Ultra Centrifugal), sắc ký trao đổi anion qua cột Q Sepharose, sắc ký lọc gel.
  • Phân tích protein: Định lượng protein, điện di biến tính SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử, điện di điểm đẳng điện (IEF), xác định trình tự peptide bằng kỹ thuật LC-ESI-MS/MS sau khi thủy phân bằng trypsin.
  • Phân tích đường và ethanol: Định lượng đường khử bằng phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích các đường đơn ($C_5, C_6$) và xác định hàm lượng bioethanol.
• Phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Ứng dụng mô hình trực giao bậc hai Box – Wilson nhằm tối ưu hóa các thông số nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ và thời gian trong phản ứng chuyển hóa bã mía.

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Dữ liệu thực nghiệm thu thập từ quá trình phân lập 44 chủng nấm, các thông số hóa lý, dữ liệu phổ khối LC-ESI-MS/MS, các kết quả đo HPLC và các ma trận thực nghiệm tối ưu hóa.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp bức tranh toàn diện về thành phần hóa học của các nguồn sinh khối lignocellulose và hiện trạng phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam.

Bảng: Thành phần hóa học của một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose

Nguồn sinh khối	Cellulose (%)	Hemicellulose (%)	Lignin (%)	Thành phần khác (%)
Gỗ cứng	45 – 47	25 – 40	20 – 25	0,8
Gỗ mềm	40 – 45	25 – 29	30 – 36	0,5
Cỏ	25 – 40	35 – 50	—	—
Bã mía	40	24	25	—
Lõi ngô	45	35	15	—
Rơm rạ	35	25	12	—
Bột giấy	50 – 70	12 – 20	6 – 10	—
Rơm lúa mì	30	50	20	—
Phế thải nông nghiệp khác	37 – 50	35 – 50	5 – 15	12 – 16

Về nguồn nguyên liệu bã mía, các nhà máy đường tại Việt Nam ép trên 15 triệu tấn mía mỗi năm, phát sinh khoảng 4,5 triệu tấn bã mía. Điển hình như Nhà máy đường Bourbon (Tây Ninh) ép 8.000 tấn mía/ngày thải ra 2.400 tấn bã mía/ngày; Công ty đường Biên Hòa thải ra 174.000 tấn bã mía/năm. Đốt 1 tấn bã mía khô thải ra 36,32 kg $CO$, 4,54 kg hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56 kg $CO_2$.

Chương này cũng phân tích chi tiết cơ chế phân giải của hệ cellulase (endo-glucanase, exo-glucanase, $\beta$-glucosidase), xylanase và vai trò của hai esterase (AE và FAE). Đồng thời, chương 1 điểm lại tình hình sản xuất bioethanol trên thế giới và tại Việt Nam, phân tích nguyên nhân các nhà máy bioethanol thế hệ I (sử dụng sắn lát) phải đóng cửa do chi phí nguyên liệu chiếm tỷ trọng quá lớn, khẳng định tính tất yếu của việc chuyển dịch sang công nghệ bioethanol thế hệ II.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả hệ thống vật liệu, hóa chất, chủng giống và các phương pháp phân tích phục vụ nghiên cứu:

• Xây dựng 3 sơ đồ nghiên cứu chuẩn hóa:
  1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm.
  2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp "enzyme cocktail".
  3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa.
• Mô tả chi tiết kỹ thuật nuôi cấy phân lập nấm, phương pháp sinh học phân tử định danh gen chỉ thị, quy trình tinh sạch enzyme qua hệ thống siêu lọc Amicon 10 kDa và sắc ký trao đổi ion Q Sepharose.
• Trình bày chi tiết các phương pháp đo hoạt độ enzyme FAE, AE; phương pháp định lượng protein; điện di SDS-PAGE, IEF; đo phổ khối LC-ESI-MS/MS; phương pháp DNS định lượng đường khử và phân tích HPLC.
• Thiết kế ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai Box – Wilson để khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố công nghệ trong quá trình đường hóa.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Phân lập, sàng lọc và định danh: Đã phân lập 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc hai ngành Ascomycota và Basidiomycota. Tuyển chọn được chủng SP66 có hoạt tính FAE cao nhất và chủng A35 có hoạt tính AE cao nhất. Bằng phương pháp hình thái và giải trình tự gen sinh học phân tử kết hợp phân tích BLAST, chủng SP66 được định danh là Alternaria tenuissima SP66 và chủng A35 được định danh là Xylaria polymorpha A35.
• Nghiên cứu sinh tổng hợp và tinh sạch enzyme:
  • Xác định nguồn dinh dưỡng nitơ, cơ chất bổ sung, pH và nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp AE bởi X. polymorpha A35 và FAE bởi Alt. tenuissima SP66.
  • Tinh sạch enzyme acetyl esterase (XpoAE) từ X. polymorpha A35 đạt khối lượng phân tử $M_w = 44\text{ kDa}$ (trên SDS-PAGE), hoạt tính đặc hiệu đạt $13,1\text{ U/mg}$.
  • Tinh sạch enzyme feruloyl esterase (AltFAE) từ Alt. tenuissima SP66 đạt khối lượng phân tử $M_w = 30,3\text{ kDa}$, hoạt tính đặc hiệu đạt $11,2\text{ U/mg}$.
  • Cả hai enzyme tinh sạch đều thể hiện độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 – 45°C và pH 5,0.
  • Dữ liệu phổ khối LC-ESI-MS/MS sau khi thủy phân bằng trypsin đã xác định chính xác các đoạn peptide đặc trưng của protein AltFAE.
• Sàng lọc cơ chất và tối ưu hóa chuyển hóa bằng "enzyme cocktail":
  • Sàng lọc các nguồn cơ chất lignocellulose (bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi) cho thấy bã mía là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình giải phóng đường khử.
  • Áp dụng mô hình trực giao bậc hai Box – Wilson đã xác định được điều kiện tối ưu hóa quá trình chuyển hóa bã mía bằng "enzyme cocktail": nhiệt độ 40°C, pH 5,0, thời gian 48 giờ; tỷ lệ hoạt độ enzyme gồm cellulase/xylanase (cell/xyl): $100\text{ U/g}$, AltFAE: $7,56\text{ U/g}$, và XpoAE: $10,8\text{ U/g}$ sinh khối khô. Tại điều kiện này, tổng lượng đường khử thu được là $251,86\text{ mg/g}$ cơ chất khô.
  • Khi kết hợp xử lý bã mía bằng thiết bị gia nhiệt với axit $H_2SO_4$ loãng (0,1%) trước khi xử lý bằng "enzyme cocktail", lượng đường lên men sinh ra tăng lên $319,5\text{ mg/g}$, đạt hiệu suất chuyển hóa 49,8%.
• Nghiên cứu lên men bioethanol:
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men từ dịch đường bã mía bởi Saccharomyces cerevisiae SH1: thành phần môi trường dinh dưỡng, thời gian lên men, pH, nhiệt độ và tỷ lệ giống nấm men.
  • Lên men dịch đường chuyển hóa thu được hàm lượng bioethanol đạt $178\text{ ml/kg}$ bã mía khô, tương đương 79,8% hiệu suất lý thuyết.
  • Xây dựng quy trình công nghệ đề xuất hoàn chỉnh sản xuất bioethanol từ bã mía quy mô phòng thí nghiệm.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Về phân lập và sàng lọc vi sinh vật: Đã phân lập và sàng lọc 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) có khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (FAE và AE).
2. Về enzym học: Lần đầu tiên phân lập, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima (AltFAE, $M_w = 30,3\text{ kDa}$, hoạt tính riêng $11,2\text{ U/mg}$) và acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha (XpoAE, $M_w = 44\text{ kDa}$, hoạt tính riêng $13,1\text{ U/mg}$) từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose. Xác định cả hai enzyme đều có độ bền nhiệt và pH tốt ở 40 – 45°C và pH 5,0; đồng thời xác định trình tự các đoạn peptide đặc trưng của AltFAE bằng LC-ESI-MS/MS.
3. Về tối ưu hóa xúc tác chuyển hóa sinh học: Thiết lập thành phần "enzyme cocktail" phối hợp carbohydrate esterase tinh sạch với enzyme thương mại cellulase/xylanase. Bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm Box – Wilson, xác định điều kiện tối ưu (40°C, pH 5,0, 48 giờ; cell/xyl: $100\text{ U/g}$, AltFAE: $7,56\text{ U/g}$, XpoAE: $10,8\text{ U/g}$) thu được $251,86\text{ mg}$ đường khử/g bã mía khô; khi kết hợp tiền xử lý $H_2SO_4$ 0,1% lượng đường tạo thành đạt $319,5\text{ mg/g}$ (hiệu suất 49,8%).
4. Về lên men bioethanol: Chứng minh dịch đường thu được sau quá trình chuyển hóa bã mía bằng "enzyme cocktail" lên men hiệu quả bởi Saccharomyces cerevisiae SH1, thu được $178\text{ ml}$ bioethanol/kg bã mía khô, đạt hiệu suất lên men 79,8% so với lý thuyết.

Bảng: Tổng hợp các thông số kỹ thuật chính của enzyme và quá trình chuyển hóa

Chỉ tiêu thông số	Enzyme AltFAE	Enzyme XpoAE	Quá trình thủy phân tối ưu	Quá trình lên men
Nguồn gốc chủng nấm	Alternaria tenuissima SP66	Xylaria polymorpha A35	—	S. cerevisiae SH1
Khối lượng phân tử ($M_w$)	30,3 kDa	44 kDa	—	—
Hoạt tính đặc hiệu	11,2 U/mg	13,1 U/mg	—	—
Điều kiện bền vững	40 – 45°C; pH 5,0	40 – 45°C; pH 5,0	40°C; pH 5,0; 48 giờ	28 – 32°C; pH 4,0
Tỷ lệ nạp enzyme tối ưu	—	—	Cell/Xyl: 100 U/g; AltFAE: 7,56 U/g; XpoAE: 10,8 U/g	—
Lượng đường khử thu nhận	—	—	251,86 mg/g (thô); 319,5 mg/g (tiền xử lý axit 0,1%)	—
Hiệu suất đạt được	—	—	49,8% hiệu suất thủy phân	178 ml/kg bã mía (79,8% lý thuyết)

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Áp dụng quy trình thủy phân phối hợp "enzyme cocktail" kết hợp xử lý axit loãng và gia nhiệt để nâng cao hiệu suất thu hồi đường đơn từ các nguồn phụ phẩm nông nghiệp khác ngoài bã mía.
• Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô chuyển hóa và lên men từ quy mô phòng thí nghiệm lên quy mô pilot bán công nghiệp nhằm hoàn thiện các thông số vận hành kinh tế - kỹ thuật.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thí nghiệm chuyển hóa và lên men mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa khảo sát ở quy mô pilot lớn hơn để đánh giá các yếu tố truyền khối và chi phí năng lượng thực tế.
• Chủng nấm men sử dụng (Saccharomyces cerevisiae SH1) chỉ chuyển hóa hiệu quả các đường hexose ($C_6$, chủ yếu là glucose), chưa có khả năng đồng hóa và lên men các đường pentose ($C_5$, điển hình là xylose) giải phóng từ hemicellulose.
• Hai enzyme carbohydrate esterase (AltFAE và XpoAE) được thu nhận thông qua nuôi cấy và tinh sạch trực tiếp từ dịch lên men chủng nấm tự nhiên, chưa qua quy trình biểu hiện gen tái tổ hợp nồng độ cao.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme AltFAE từ Alternaria tenuissima và XpoAE từ Xylaria polymorpha trên các vật chủ tái tổ hợp (như nấm men Pichia pastoris hoặc vi khuẩn E. coli) để sản xuất enzyme với sản lượng lớn và giá thành thấp.
• Ứng dụng các chủng nấm men chuyển gen hoặc chủng vi sinh vật đồng lên men (đồng hóa cả đường $C_5$ và $C_6$, ví dụ kết hợp Pichia stipitis) nhằm tận dụng triệt để toàn bộ lượng đường pentose trong dịch thủy phân bã mía.
• Thử nghiệm phối hợp "enzyme cocktail" trên các nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose khác như rơm rạ, trấu, thân cây ngô và bã thải công nghiệp giấy.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Kỹ thuật môi trường và Năng lượng tái tạo.
• Các viện nghiên cứu và trường đại học: Làm tài liệu tham khảo chuyên sâu về phân lập nấm, tinh sạch enzyme ngoại bào, xác định đặc tính protein và ứng dụng toán học trong quy hoạch thực nghiệm sinh học.
• Kỹ sư công nghệ và nhà hoạch định chính sách: Các đơn vị phát triển nhiên liệu sinh học thế hệ II, các nhà máy chế biến mía đường và phụ phẩm nông nghiệp tìm kiếm giải pháp chuyển hóa phế phụ phẩm thành sản phẩm có giá trị gia tăng cao.

Các phần nội dung đáng tham khảo

• Chương 2 (Phương pháp nghiên cứu): Quy trình chuẩn xác định hoạt độ acetyl esterase và feruloyl esterase; quy trình tinh sạch enzyme qua sắc ký trao đổi ion Q Sepharose và xác định peptide bằng LC-ESI-MS/MS; thiết kế ma trận tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai Box – Wilson.
• Chương 3 (Kết quả và thảo luận): Bộ số liệu về đặc tính hóa sinh, độ bền nhiệt/pH của hai enzyme AltFAE và XpoAE; bảng ma trận tối ưu hóa tỷ lệ "enzyme cocktail"; các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men bioethanol bằng S. cerevisiae.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập và tuyển chọn được những chủng nấm nào có hoạt tính esterase nổi bật?

Từ 44 chủng nấm phân lập thuộc 13 họ (ngành Ascomycota và Basidiomycota), tác giả đã tuyển chọn và định danh được hai chủng có hoạt tính cao nhất bằng hình thái và sinh học phân tử:

• Chủng SP66 có hoạt tính feruloyl esterase cao nhất, định danh là Alternaria tenuissima SP66.
• Chủng A35 có hoạt tính acetyl esterase cao nhất, định danh là Xylaria polymorpha A35.

2. Hai enzyme esterase tinh sạch AltFAE và XpoAE có khối lượng phân tử và hoạt tính đặc hiệu là bao nhiêu?

• Enzyme feruloyl esterase (AltFAE) tinh sạch từ nấm Alternaria tenuissima SP66 có khối lượng phân tử $M_w = 30,3\text{ kDa}$ và hoạt tính đặc hiệu đạt $11,2\text{ U/mg}$.
• Enzyme acetyl esterase (XpoAE) tinh sạch từ nấm Xylaria polymorpha A35 có khối lượng phân tử $M_w = 44\text{ kDa}$ và hoạt tính đặc hiệu đạt $13,1\text{ U/mg}$. Cả hai enzyme đều có độ bền hoạt tính cao trong khoảng nhiệt độ 40 – 45°C và pH 5,0.

3. Thành phần và điều kiện tối ưu của hệ "enzyme cocktail" được xác định qua mô hình Box – Wilson như thế nào?

Theo kết quả tối ưu hóa bằng mô hình trực giao bậc hai Box – Wilson:

• Điều kiện phản ứng: Nhiệt độ 40°C, pH 5,0, thời gian thủy phân 48 giờ.
• Hoạt độ enzyme nạp vào trên 1 gam sinh khối bã mía khô: cellulase/xylanase (cell/xyl): $100\text{ U/g}$, AltFAE: $7,56\text{ U/g}$, và XpoAE: $10,8\text{ U/g}$. Lượng đường khử thu được ở điều kiện tối ưu trên bã mía thô đạt $251,86\text{ mg/g}$.

4. Hiệu suất giải phóng đường và hiệu suất thu hồi bioethanol đạt được mức nào?

• Khi kết hợp tiền xử lý bã mía bằng thiết bị gia nhiệt với dung dịch $H_2SO_4$ loãng 0,1% và thủy phân bằng "enzyme cocktail", tổng lượng đường lên men đạt $319,5\text{ mg/g}$ bã mía, đạt hiệu suất chuyển hóa 49,8%.
• Sau quá trình lên men dịch đường này bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1, hàm lượng bioethanol thu được đạt $178\text{ ml/kg}$ bã mía khô, tương đương 79,8% hiệu suất lý thuyết.

5. Vì sao cần phối hợp carbohydrate esterase (AE và FAE) với cellulase/xylanase trong quá trình thủy phân bã mía?

Cấu trúc lignocellulose của bã mía có các liên kết ester liên mạng: nhóm O-acetyl tại vị trí C2/C3 của mạch xylan gây cản trở không gian đối với xylanase, trong khi liên kết ester giữa arabinoxylan và axit ferulic của lignin tạo nên mạng lưới bảo vệ bao bọc sợi cellulose. Phối hợp AE và FAE giúp cắt đứt các liên kết ester này, loại bỏ các nhóm thế acetyl và giải phóng lignin khỏi cấu trúc polymer, tạo điều kiện thuận lợi cho cellulase và xylanase tiếp cận và thủy phân triệt để các liên kết $\beta$-glucoside và $\beta$-xyloside của mạch chính.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Vũ Đình Giáp (2019) đã giải quyết thành công bài toán khoa học về khai thác xúc tác sinh học từ nguồn nấm bản địa phục vụ chuyển hóa phụ phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose thành bioethanol. Công trình đã phân lập, tinh sạch và làm sáng tỏ đặc tính của hai enzyme carbohydrate esterase mới gồm AltFAE từ Alternaria tenuissima SP66 và XpoAE từ Xylaria polymorpha A35. Thông qua mô hình quy hoạch thực nghiệm Box – Wilson, luận án đã xác lập công thức "enzyme cocktail" tối ưu kết hợp xử lý hóa lý, nâng cao hiệu suất đường hóa bã mía và thu nhận bioethanol với hiệu suất lên men đạt 79,8% so với lý thuyết, đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho công nghệ phát triển nhiên liệu sinh học thế hệ II tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose 1. Nguồn gốc và thành phần Phụ phẩm công-nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam. Hiện nay, mỗi năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm, thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1].

Việc đốt này gây ra hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt, phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thông. Đặc biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn [2,3]. Lignocellulose ngày càng có vai trò quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp, hơn nữa chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mô hình sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4].

Các polymer sinh học này có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo lớn nhất trong sinh quyển. Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer hóa, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía…) và thân cây thảo [5,6]. Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối 5 lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.

Ngoài các thành phần này, Lilholt còn cho rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [7]. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose [1] Nguồn Cellulose Hemicellulose Lignin Thành phần lignocellulose (%) (%) (%) khác (%) Gỗ cứng 45-47 25-40 20-25 0,8 Gỗ mềm 40-45 25-29 30-36 0,5 Cỏ 25-40 35-50 - - Bã mía 40 24 25 - Lõi ngô 45 35 15 Rơm rạ 35 25 12 Bột giấy 50-70 12-20 6-10 - Rơm lúa mì 30 50 20 Phế thải nông 37-50 35-50 5-15 12-16 nghiệp khác Hình 1. Cấu trúc của lignocellulose [8] Lignocellulose là một vật liệu khó thủy phân do chúng có các liên kết polysaccharid (cellulose và hemicellulose), liên kết ester và ete (lignin) tạo nên cấu trúc rất bền vững có độ cứng và độ bền cơ học cao (Hình 1. Xét về thành phần lignocellulose bao gồm: 6 Cellulose: Cellulose là một polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n.

Các đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4- glucoside với số lượng lên tới hơn 10. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose.