Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu phát triển phương pháp lc ms ms phân tích chlotetracycline oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố hạ long

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển phương pháp LC-MS/MS phân tích chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm tại Hạ Long.

• Tác giả: Hoàng Thị Phƣợng
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển phương pháp LC-MS/MS phân tích Chlotetracycline, Oxytetracycline và Tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline
• 1.4. Các phương pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline
• 1.4.1. Phương pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm
• 1.4.2. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học
• 1.4.3. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE)
• 1.5. Các phương pháp làm sạch dịch chiết mẫu
• 1.5.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
• 1.5.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng
• 1.6. Các phương pháp phân tích kháng sinh tetracycline
• 1.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng
• 1.6.1.1. Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array (LC/DAD)
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Hóa chất và thiết bị
• 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.2. Lấy mẫu, bảo quản mẫu
• 2.2.3. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.2.4. Phương pháp phân tích
• 2.2.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC/MS-MS
• 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số của detector MS/MS
• 3.3. Tối ưu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng
• 3.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu
• 3.4.1. Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu
• 3.4.1.1. Lựa chọn dung môi chiết chất phân tích
• 3.4.1.2. Lựa chọn pH
• 3.4.2. Tối ưu hóa quá trình làm sạch mẫu
• 3.5. Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
• 3.5.1. Giới hạn phát hiện của thiết bị
• 3.5.2. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL)
• 3.5.3. Phương trình hồi qui tuyến tính
• 3.5.4. Độ chính xác của phương pháp
• 3.5.5. Đánh giá kết quả phân tích mẫu so sánh liên phòng
• 3.5.6. Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp
• 3.5.7. Độ ổn định của phương pháp
• 3.5.8. Độ không đảm bảo đo
• 3.5.9. Phân tích mẫu thực tế
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phương pháp LC MS MS tại Hạ Long

Nghiên cứu phát triển phương pháp LC-MS/MS để phân tích kháng sinh trong thực phẩm tại Hạ Long là một bước tiến quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác hàm lượng kháng sinh, đặc biệt là nhóm tetracycline, trong các sản phẩm thực phẩm như thịt, thủy sản và sữa. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ giúp phát hiện tồn dư kháng sinh mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Khái niệm về phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, cho phép tách biệt và xác định các hợp chất hóa học trong mẫu thực phẩm. Kỹ thuật này sử dụng sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ để đạt được độ nhạy và độ chính xác cao trong việc phát hiện kháng sinh.

1.2. Tầm quan trọng của việc phân tích kháng sinh

Việc phân tích kháng sinh trong thực phẩm là rất cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm. Tồn dư kháng sinh có thể gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho người tiêu dùng, bao gồm dị ứng và kháng thuốc. Do đó, nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn đề tồn dư kháng sinh trong thực phẩm tại Hạ Long

Tại Hạ Long, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng. Nhiều sản phẩm thực phẩm chứa tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép, gây ra mối lo ngại về an toàn thực phẩm. Việc lạm dụng kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng mà còn gây ra tình trạng kháng thuốc trong cộng đồng.

2.1. Nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh

Nguyên nhân chính dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm bao gồm việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Ngoài ra, quy trình chế biến và bảo quản thực phẩm không đúng cách cũng góp phần làm tăng nguy cơ tồn dư kháng sinh.

2.2. Hệ lụy từ tồn dư kháng sinh

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có thể dẫn đến nhiều hệ lụy nghiêm trọng, bao gồm dị ứng, kháng thuốc và các bệnh lý khác. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cá nhân mà còn gây ra gánh nặng cho hệ thống y tế.

III. Phương pháp chiết tách kháng sinh trong thực phẩm

Để phân tích kháng sinh trong thực phẩm, việc chiết tách là bước quan trọng. Các phương pháp chiết tách như chiết lỏng rắn và chiết lỏng lỏng được áp dụng để tách kháng sinh ra khỏi nền mẫu thực phẩm. Những phương pháp này giúp tăng cường độ chính xác và độ nhạy của quá trình phân tích.

3.1. Phương pháp chiết lỏng rắn

Chiết lỏng rắn là phương pháp sử dụng dung môi để tách kháng sinh ra khỏi mẫu thực phẩm. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và hiệu quả, giúp thu hồi kháng sinh với độ chính xác cao.

3.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng

Chiết lỏng lỏng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha dung môi không trộn lẫn. Phương pháp này thường được sử dụng để làm sạch mẫu và loại bỏ tạp chất không cần thiết.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS có khả năng phát hiện và định lượng chính xác các kháng sinh như chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ giúp kiểm soát chất lượng thực phẩm mà còn nâng cao nhận thức của người tiêu dùng về an toàn thực phẩm.

4.1. Hiệu quả của phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện tồn dư kháng sinh với độ nhạy và độ chính xác cao. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm thường vượt ngưỡng cho phép.

4.2. Ứng dụng trong kiểm soát chất lượng thực phẩm

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong việc kiểm soát chất lượng thực phẩm tại Hạ Long. Các cơ quan chức năng có thể sử dụng phương pháp này để giám sát và đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu phát triển phương pháp LC-MS/MS phân tích kháng sinh trong thực phẩm tại Hạ Long đã mở ra hướng đi mới trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ giúp phát hiện tồn dư kháng sinh mà còn nâng cao nhận thức của cộng đồng về vấn đề an toàn thực phẩm.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Việc phát triển phương pháp phân tích hiện đại sẽ giúp nâng cao chất lượng thực phẩm.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và cải tiến phương pháp phân tích để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về an toàn thực phẩm. Việc hợp tác giữa các cơ quan nghiên cứu và chính quyền địa phương sẽ là yếu tố quyết định cho sự thành công của các dự án nghiên cứu này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thực trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đang đặt ra thách thức nghiêm trọng đối với công tác bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm và sức khỏe cộng đồng. Theo các báo cáo y tế, tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc tại Việt Nam đang ở mức báo động với 92,9% chủng Salmonella typhi và 87,8% chủng Klebsiella pneumoniae ghi nhận khả năng kháng lại nhóm tetracycline. Sự tích tụ tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng trong chuỗi thực phẩm không chỉ kích hoạt phản ứng dị ứng tức thì ở người nhạy cảm mà còn thúc đẩy quá trình chọn lọc tự nhiên hình thành các chủng siêu vi khuẩn đa kháng thuốc. Nhằm thắt chặt kiểm soát, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành Thông tư 10/2016/TT-BNNPTNT quy định danh mục 24 hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong thủy sản và Thông tư 06/2016/TT-BNNPTNT về lộ trình chấm dứt sử dụng kháng sinh kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi.

Trong số các hợp chất điều trị phổ biến, tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline là ba hoạt chất thường xuyên bị phát hiện tồn dư do tính sẵn có và chi phí thấp. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, nghiên cứu này tập trung phát triển và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng ghép nối hai lần khối phổ (LC-MS/MS) nhằm định lượng đồng thời cả 3 kháng sinh thuộc nhóm tetracycline trong nền mẫu thực phẩm phức tạp gồm thịt gia súc, gia cầm và thủy sản. Đề tài được triển khai khảo sát thực tế trên địa bàn thành phố Hạ Long, tỉnh Quảng Ninh trong giai đoạn 2015 – 2017. Nghiên cứu xác lập giới hạn định lượng đạt 5,0 µg/kg cùng hiệu suất thu hồi dao động từ 76% đến 94,5%, mang lại công cụ kiểm nghiệm có độ nhạy cao và độ tin cậy vượt trội phục vụ công tác thanh tra, giám sát an toàn thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp kỹ thuật ion hóa phun sương điện tử (ESI) và phân tích khối phổ hai lần (Tandem Mass Spectrometry - MS/MS). Trong sắc ký pha đảo, cơ chế phân tách dựa trên sự phân bố khác nhau của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh không phân cực (cột silica biến tính C18) và pha động phân cực chứa hỗn hợp dung môi nước - acetonitrile có bổ sung chất điều chỉnh pH. Về phương diện phổ khối, cơ chế ion hóa mềm ESI ở chế độ ion dương ([M+H]+) chuyển đổi các phân tử tetracycline thành các ion phân tử dạng khí mà không làm phá vỡ hoàn toàn cấu trúc ban đầu, trước khi đưa vào hệ thống lọc tứ cực đa kênh (MRM).

Ba khái niệm học thuật cốt lõi chi phối toàn bộ quy trình bao gồm:

1. Hiện tượng tạo phức Chelate: Nhóm tetracycline sở hữu các nhóm chức hydroxyl và carbonyl liên hợp tại vòng B và C, có ái lực cực mạnh với các cation kim loại đa hóa trị như Canxi (Ca2+), Magie (Mg2+), Sắt (Fe3+) trong nền mẫu thịt và thủy sản, đòi hỏi phải sử dụng tác nhân tạo phức cạnh tranh như EDTA để giải phóng kháng sinh tự do.
2. Sự đồng phân hóa và thoái biến: Cấu trúc hydronaphtacenic của tetracycline rất nhạy cảm với pH, dễ bị đồng phân hóa thành epitetracycline trong dải pH 2,0 – 6,0 hoặc phân hủy thành dẫn xuất anhydro và isotetracycline ở môi trường kiềm/axit mạnh.
3. Chế độ giám sát đa phản ứng (MRM): Kỹ thuật chọn lọc chính xác ion mẹ tại tứ cực thứ nhất (Q1), phân mảnh có kiểm soát tại buồng va chạm bát cực (Q2) bằng khí trơ, và định lượng các ion con đặc trưng tại tứ cực thứ ba (Q3) giúp triệt tiêu nhiễu nền ma trận thực phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ quá trình lấy mẫu thịt (thịt lợn, thịt bò, thịt gà) và thủy sản (tôm, cá, mực, hàu sữa) tại các chợ truyền thống và hệ thống siêu thị trên địa bàn thành phố Hạ Long. Quy trình lấy mẫu, mã hóa và bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20°C tuân thủ nghiêm ngặt theo Thông tư 14/2011/TT-BYT, TCVN 4833-1:2002 và TCVN 5276:1990. Mẫu trắng đối chứng được thẩm tra song song tại 2 phòng kiểm nghiệm độc lập đạt chuẩn ISO/IEC 17025 để bảo đảm không chứa dư lượng nền.

Cỡ mẫu chuẩn bị cho mỗi mẻ phân tích là 5,0 g ± 0,100 g phần mô nạc ăn được, thực hiện lặp lại tối thiểu 3 lần kèm mẫu thêm chuẩn nội tại dải nồng độ từ 5 đến 100 µg/kg. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng nhằm bao quát các nhóm thực phẩm tiêu dùng trọng điểm. Quy trình xử lý mẫu sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - rắn hỗ trợ rung siêu âm bằng dung dịch đệm McIlvaine - EDTA ở pH 4,0 ± 0,05, kết tủa protein tạp bằng axit trichloroacetic (TCA 1,0 g/mL), sau đó làm sạch và làm giàu qua cột chiết pha rắn SPE C18 với thể tích rửa giải 2,0 mL methanol. Phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn thay thế cho các kỹ thuật HPLC-DAD hay HPLC-FL truyền thống nhờ độ đặc hiệu tuyệt đối, khả năng loại trừ dương tính giả và đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn xác nhận giá trị sử dụng theo quyết định EC/657/2002 của Ủy ban Châu Âu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tối ưu hóa các thông số kỹ thuật và thực nghiệm đã dẫn đến 4 phát hiện quan trọng:

1. Xác lập cơ chế phân mảnh và thông số MS/MS tối ưu: Ở chế độ quét ion dương, cả 3 chất phân tích đều tạo ra 2 mảnh ion con đặc trưng thông qua cơ chế mất phân tử nước (m/z 18) và mất đồng thời nước kết hợp amoniac (m/z 35). Ion mẹ của Oxytetracycline (m/z 461) phân mảnh thành ion định lượng m/z 426 (CE -20 V) và ion định danh m/z 443 (CE -14 V); Tetracycline (m/z 445) tạo ion m/z 410 (CE -19 V) và m/z 427 (CE -16 V); Chlortetracycline (m/z 479) tạo ion m/z 444 (CE -29 V) và m/z 462 (CE -11 V).
2. Hiệu quả chiết tách vượt trội của đệm McIlvaine - EDTA: Chiết bằng đệm McIlvaine - EDTA pH 4,0 mang lại độ thu hồi đạt 76% – 83% với hệ số biến thiên (CV) chỉ 5,8%, trong khi dung môi acetonitrile chứa axit phosphoric chỉ đạt độ thu hồi 20% – 40% và CV lên tới 19,2%. Khi khảo sát các mức pH từ 3 đến 6, tại pH 4,0 độ thu hồi cho cả 3 chất đạt mức cao nhất từ 83,7% đến 94,5% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) duy trì ổn định từ 3,2% đến 4,2%.
3. Tối ưu hóa điều kiện làm sạch qua cột SPE C18: Tốc độ nạp mẫu và rửa giải được cố định ở mức dưới 2,0 mL/phút bằng dung môi methanol tinh khiết, mang lại hiệu suất thu hồi cao từ 86,5% đến 89,9%, cao hơn đáng kể so với dung môi rửa giải hỗn hợp methanol - EDTA chỉ đạt 51,5% – 60,7%.
4. Tách sắc ký hoàn toàn trong 13 phút: Chương trình rửa giải gradient dung môi Kênh A (nước cất + 0,1% HCOOH) và Kênh B (acetonitrile + 0,1% HCOOH) với tốc độ dòng 0,3 mL/phút trên cột InertSustain C18 (150 x 2,1 mm; 3 µm) ở 40°C cho thời gian lưu sắc nét: Oxytetracycline (4,60 phút), Tetracycline (4,77 phút) và Chlortetracycline (5,06 phút).

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của đệm McIlvaine - EDTA tại pH 4,0 được lý giải dựa trên cơ chế hóa học phân tử. Phân tử EDTA đóng vai trò là tác nhân cô lập kim loại mạnh, cạnh tranh trực tiếp và bẻ gãy liên kết phức chelate giữa tetracycline với các ion canxi và magie nội sinh trong mô cơ động vật. Hơn nữa, môi trường đệm pH 4,0 tạo trạng thái cân bằng bền vững, ức chế hoàn toàn quá trình chuyển hóa thành dạng epitetracycline không hoạt tính. Dữ liệu thực nghiệm này có thể được minh họa trực quan qua biểu đồ cột so sánh hiệu suất thu hồi giữa các hệ dung môi và các dải pH khác nhau, làm nổi bật bước nhảy vọt về độ thu hồi tại điểm tối ưu pH 4,0.

So với phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò mảng Diode (HPLC-DAD) có giới hạn phát hiện khoảng 20 µg/kg hoặc phương pháp quang huỳnh quang (HPLC-FL) đạt 5,0 µg/kg, kỹ thuật LC-MS/MS trong nghiên cứu này thể hiện ưu thế vượt trội với giới hạn định lượng MQL đạt 5,0 µg/kg và dải tuyến tính rộng 5 – 100 µg/kg (R > 0,995). Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn thành phố Hạ Long ghi nhận tỷ lệ mẫu thịt và thủy sản tuân thủ tốt ngưỡng dư lượng tối đa (MRL), chứng minh quy trình phân tích hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe của AOAC và ISO/IEC 17025. Phổ đồ MRM thu được thể hiện các pic sắc ký tách biệt hoàn toàn, đường nền phẳng và không xuất hiện hiện tượng chồng lấn pic giữa các chất đồng phân.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, 4 khuyến nghị mang tính ứng dụng cao được đề xuất:

1. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kiểm nghiệm: Đề nghị các Trung tâm Y tế dự phòng tuyến tỉnh và Chi cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản áp dụng quy trình LC-MS/MS đã thẩm định để phân tích thường quy nhóm tetracycline, hướng tới mục tiêu kiểm soát ngưỡng MRL ≤ 100 µg/kg trong thực phẩm trong vòng 6 đến 12 tháng tới.
2. Thiết lập mạng lưới giám sát định kỳ tại các chợ đầu mối: Chi cục Chăn nuôi và Thú y phối hợp với Sở Y tế tỉnh Quảng Ninh xây dựng kế hoạch lấy mẫu định kỳ 100% các cơ sở giết mổ tập trung và các vùng nuôi trồng thủy sản trọng điểm tại thành phố Hạ Long, triển khai xuyên suốt lộ trình 2018 – 2025.
3. Thực thi chế tài nghiêm ngặt đối với hành vi sử dụng kháng sinh cấm: Các cơ quan thanh tra liên ngành cần đẩy mạnh kiểm tra việc tuân thủ Thông tư 06/2016/TT-BNNPTNT và xử lý nghiêm các trường hợp bổ sung kháng sinh kích thích tăng trọng vào thức ăn chăn nuôi, giảm thiểu ít nhất 50% nguy cơ tồn dư trong 2 năm đầu áp dụng.
4. Tổ chức tập huấn kỹ thuật phân tích dư lượng: Các viện nghiên cứu và trường đại học cần mở các khóa đào tạo nâng cao tay nghề xử lý mẫu SPE và vận hành hệ thống khối phổ LC-MS/MS cho khoảng 100 cán bộ kiểm nghiệm viên tại các phòng thí nghiệm khu vực phía Bắc.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và phương pháp luận của luận văn mang lại giá trị thực tiễn cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Kiểm nghiệm viên và chuyên viên phân tích hóa học: Tiếp cận quy trình chiết tách chi tiết, các thông số cài đặt MS/MS tối ưu (CE, Q1, Q3) và hướng dẫn tính toán độ không đảm bảo đo (U) theo chuẩn Eurachem/CITAC để thiết lập phương pháp thử nghiệm mới tại đơn vị.
2. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và hoạch định chính sách: Tham khảo số liệu khảo sát thực tế tại địa phương để xây dựng hàng rào kỹ thuật, hoàn thiện các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN) về giới hạn tồn dư kháng sinh trong thực phẩm tươi sống.
3. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích: Sử dụng làm tài liệu tham khảo mẫu mực về quy trình thẩm định phương pháp phân tích vết hữu cơ theo tiêu chuẩn quốc tế EC/657/2002 và AOAC Appendix F.
4. Doanh nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản: Áp dụng giải pháp kiểm soát chất lượng nội bộ nhằm đáp ứng các yêu cầu kiểm dịch nghiêm ngặt từ các thị trường khó tính như Hoa Kỳ, EU và Nhật Bản.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao phải bổ sung EDTA vào dung dịch đệm McIlvaine khi chiết tách Tetracycline? Kháng sinh nhóm tetracycline có cấu trúc chứa nhiều nhóm cho điện tử, rất dễ tạo phức chelate bền vững với các ion kim loại hóa trị 2 và 3 trong mô thịt như Ca2+, Mg2+, Fe3+. EDTA đóng vai trò là chất tạo phức mạnh hơn, giải phóng hoàn toàn tetracycline ra dạng tự do, giúp nâng cao hiệu suất thu hồi từ mức 20% – 40% lên 76% – 83%.

Tại sao môi trường pH 4,0 được lựa chọn là điểm tối ưu cho quá trình xử lý mẫu? Ở môi trường kiềm (pH > 9) hoặc axit mạnh (pH < 1), tetracycline bị biến tính thành isotetracycline hoặc anhydrotetracycline. Trong dải pH 2,0 – 6,0, hiện tượng đồng phân hóa tạo epitetracycline diễn ra mạnh nhưng lại đạt trạng thái bền vững tối đa ở pH 4,0 ± 0,05, giúp bảo toàn nồng độ chất phân tích với độ thu hồi trên 83,7%.

Giới hạn định lượng MQL 5,0 µg/kg của phương pháp có đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm? Hoàn toàn đáp ứng. Theo quy định quốc tế của Codex và Bộ Nông nghiệp Việt Nam, giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL) của tetracycline trong thịt và thủy sản thường nằm trong khoảng 100 – 200 µg/kg. Với MQL 5,0 µg/kg, phương pháp có độ nhạy cao gấp 20 – 40 lần so với ngưỡng quy định, bảo đảm phát hiện chính xác các vi phạm tồn dư ở mức vết.

Sự khác biệt lớn nhất giữa việc sử dụng đầu dò khối phổ MS/MS so với đầu dò mảng Diode (DAD) là gì? Đầu dò DAD chỉ dựa vào độ hấp thụ quang học UV ở bước sóng 350 – 360 nm nên dễ bị nhiễu bởi các hợp chất hữu cơ khác trong nền mẫu. Ngược lại, MS/MS theo dõi chính xác tỷ lệ khối trên điện tích (m/z) của ion mẹ và các ion phân mảnh con qua chế độ MRM, loại trừ 100% nguy cơ dương tính giả và giảm giới hạn phát hiện xuống 4 lần.

Quy trình thẩm định giá trị sử dụng của phương pháp trong luận văn dựa trên những tiêu chuẩn nào? Phương pháp được thẩm định toàn diện theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005, hướng dẫn thẩm định của Ủy ban Châu Âu EC/657/2002 và Phụ lục F của AOAC International. Các chỉ tiêu bao gồm: độ chọn lọc, độ tuyến tính (R > 0,995), độ lặp lại (CV < 4,2%), độ đúng/thu hồi (80% – 105%), độ ổn định sau 1000 lần tiêm và độ không đảm bảo đo mở rộng.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời 3 kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline và Chlortetracycline bằng kỹ thuật LC-MS/MS với thời gian chạy sắc ký chỉ 13 phút.
• Tối ưu hóa dung môi chiết đệm McIlvaine - EDTA ở pH 4,0 kết hợp cột chiết pha rắn SPE C18, nâng hiệu suất thu hồi lên 76% – 94,5% và kiểm soát hệ số biến thiên dưới 5,8%.
• Thẩm định phương pháp đạt giới hạn định lượng 5,0 µg/kg, độ tuyến tính cao (R > 0,995) trong khoảng 5 – 100 µg/kg, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn quốc tế EC/657/2002 và ISO/IEC 17025.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị về tình trạng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm tại thành phố Hạ Long, phục vụ đắc lực cho công tác quản lý an toàn thực phẩm địa phương.
• Lộ trình tiếp theo cần nhân rộng phương pháp sang các đối tượng mẫu phức tạp khác như trứng, sữa, mật ong và chuyển giao công nghệ cho mạng lưới kiểm nghiệm trên toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đã trở thành vấn đề chung đƣợc toàn xã hội quan tâm. Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa bệnh tật và thực phẩm mất an toàn. Có rất nhiều nguyên nhân và nguy cơ, trong đó kể đến việc nuôi, trồng, vận chuyển, chế biến và bảo quản không đúng qui trình, qui cách. Thêm vào đó là việc cố ý tạo ra sản phẩm không an toàn của không ít các nhà kinh doanh thực phẩm vì chạy theo lợi nhuận kinh tế.

Một trong các vấn đề nóng hiện nay chính là tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm thực phẩm. Nguyên nhân dẫn đến việc tồn dƣ kháng sinh là việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi để phòng chống bệnh tật cho vật nuôi, kích thích sinh trƣởng cũng nhƣ dùng làm chất bảo quản, giúp thực phẩm tƣơi lâu. Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng những thực phẩm chứa tồn dƣ kháng sinh vƣợt ngƣỡng giới hạn cho phép sẽ dẫn đến hậu quả khôn lƣờng. Phản ứng xảy ra tức thời là một số kháng sinh gây dị ứng đối với một số ngƣời, phản ứng lâu dài sẽ là sự kháng thuốc của vi sinh vật đối với các loại kháng sinh.

Trên thế giới đã có những ca bác sĩ không thể cứu đƣợc bệnh nhân vì bệnh nhiễm khuẩn do kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có. Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh trong bảo quản thực phẩm bị cấm tuyệt đối. Theo thông tƣ 10/2016 kí ngày 1/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn thì có 24 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong chăn nuôi thủy sản nhƣ Chloramphenicol, Nitrofuran, Enrofloxacin, Ciprofloxacin… và 16 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh động vật trên cạn nhƣ Chloramphenicol, Furazolidon và dẫn xuất của nhóm Nitrofuran, Dimetridazole, Metronidazole, Dipterex Ciprofloxacin, Ofloxacin….Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (NN&PTNT), Thông tƣ 06/2016 kí ngày 31/5/2016 cũng quy định 15 loại hóa chất, kháng sinh đƣợc phép sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm với mục đích kích thích sinh trƣởng, bao gồm: Bambermycins, BMD (Bacitracin Methylnene-Disalicylate), Chlortetracyline, Colistin sulphate, Enramycin…. nhƣng sẽ bị cấm sử dụng bắt đầu từ 31/12/2017.

1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong số đó, tetracycline là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Hiện có khoảng gần 10 tetracycline tự nhiên nhƣng trên thực tế chỉ sử dụng 4 loại là chlortetracycline, tetracycline, oxytetracycline và demechlocycline dƣới dạng thuốc và các chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Tại Việt Nam chỉ sử dụng phổ biến 3 loại kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline và Chlortetracycline. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu phát triển phương pháp LC- MS/MS phân tích chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long” với mục tiêu là :xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm và áp dụng để phân tích thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline 1. Giới thiệu chung Các tetracycline đƣợc phát hiện rất sớm, từ năm 1948, là kháng sinh phổ rộng đầu tiên ức chế hầu hết các vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và Ricketsisa… nên đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến những năm 80 của thế kỉ XX, nhất là ở các nƣớc đang phát triển. Hiện nay, các kháng sinh tự nhiên của nhóm này nhƣ tetracycline, chlortetracycline, oxytetracycline chủ yếu đƣợc sử dụng trong chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm và đƣợc phối hợp bổ sung với vitamin B12 vào thức ăn trong chăn nuôi có tác dụng kích thích tăng trọng.

Các kháng sinh nhóm tetracyclines bán tổng hợp đƣợc dùng rộng rãi hơn để điều trị các bệnh nhiễm trùng nhƣ bệnh đau mắt hột, mắt đỏ, viêm giác mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu cầu và đặc biệt để điều trị các bệnh dịch hạch [2]. Các tetracycline đều dễ bị kháng thuốc, ở Việt Nam có 92,9 % Salmonella typhi, 41,4% H. influenza, 87,8% Klebsiella pnuemoniae kháng lại thuốc tetracyclin… Cơ chế tác dụng của các tetracyclin là phong tỏa hoạt động của nhiều ezym tham gia vào các quá trình trao đổi chất, ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Khi kháng thuốc: vị trí gắn của tetracycline trên ribosom bị biến đổi do đó tetracycline không gắn đƣợc vào ribosom và mất đi tác dụng.

Các đại diện tiêu biểu cho nhóm bao gồm các chất sau: Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline,Minocyclin, Doxycyclin [2].2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline Các tetracycline tồn tại dạng tinh thể màu vàng sáng, tan kém trong nƣớc, 1g /2500 mL nƣớc, hoặc 50 mL cồn. Tan tốt trong dung dịch kiềm và axit, đặc biệt 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] không tan trong dung môi chloroform và ether. Nhóm tetracycline bền vững với axit nên dùng để uống đƣợc nhƣng do có nhiều tác dụng phụ, đặc biệt là tạo phức canxi bền vững làm cho răng bị ố vàng nên bị cấm dùng cho trẻ em dƣới 10 tuổi. Tetracycline có tính chất lƣỡng tính, do trong phân tử của chúng chứa nhóm dimethylamino có khả năng tạo muối với canxi, các nhóm hydroxyl có khả năng tạo muối với kiềm hoặc với các ion Ca2+, Mg2+ (tạo tetracyclinate).

Bên cạnh đó, tetracycline không bền vững với các tác nhân oxy hóa ngay cả với oxy trong không khí, bị phân hủy bởi ánh sáng. Trong dung dịch kiềm, tetracycline dễ bị oxy hóa thành dẫn chất có màu thẫm. Do cấu trúc hydronaphtaxenic mà tetracycline dễ bị đồng phân hóa trong dung dịch pH từ 2,0 đến 6,0 tạo ra các epitetracycline không có tác dụng kháng sinh. Hiện tƣợng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracycline và chlotetracycline.

Trong môi trƣờng kiềm hay quá axit (pH lớn hơn 9 hay pH nhỏ hơn 1) các tetracycline bị khử hoạt tính do tạo thành các dẫn chất anhydro và isotetracycline.Trong môi trƣờng axit loãng, tetracycline bị mất nƣớc để tạo thành anhydrotetracycline. Anhydrotetracycline bị phân hủy và lacton hóa tiếp tục để tạo thành apoterramycine. Apoterramycine Trong môi trƣờng kiềm nhẹ, carbon vị trí 11a của tetracycline, đƣợc biến đổi thành isotetracycline. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 11a Isotetracycline Tetracycline có khuynh hƣớng hình thành phức hợp với một số chất hoá học tại các nguyên tử oxy vòng B và C.

Phức chelate Tetracycline tạo phức chủ yếu với Fe 3+, Fe 2+, Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Zn 2+, Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Be 2+, Al 3+, phosphate, citrates, salicylat, p-hydroxybenzoat, anion saccharin, caffiene, urê, thiourea, polivinylpyrolidone, albumin huyết thanh, lipoprotein, globulins, và RNA. Các thông tin chung về nhóm tetracycline đƣa ra trong bảng 1.1 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1Thông tin về nhóm tetracycline Tetracycline Oxytetracycline Chlotetracycline Danh pháp (4S,4aS,5aS,6S,12aR) 4- (4S,4aS,5aS,6S,12aR)- quốc tế -4-(dimethylamino)- (Dimethylamino)- 7-chloro-4- 1,6,10,11,12a- 1,4,4a,5,5a,6,11,12aoc (dimethylamino)- pentahydroxy-6- tahydro- 1,6,10,11,12a- methyl-3,12-dioxo- 3,5,6,10,12,12a - pentahydroxy-6-methyl- 4,4a,5,5a- hexahydroxy-6methyl- 3,12-dioxo-4,4a,5,5a- tetrahydrotetracene-2- 1,11-dioxo-2- tetrahydrotetracene-2- carboxamide naphthacenecaboxami carboxamide de Công thức C22H24N2O8 C22H24N2O9 C22H23 ClN2O8 phân tử Công thức cấu tạo Hợp chất R1 R4 TC Tetracycline H H OTC Oxytetracycline H OH CTC Chlotetracycline Cl H Khối lƣợng 444,44g/mol 460,44 g/mol 478.88 g/mol phân tử Nhiệt độ 1720 C 184,50 C 2150 C sôi 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline 1. Phƣơng pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm 1.

Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học Chiết lỏng rắn là quá trình dung môi thẩm thấu vào nền mẫu rắn, dựa vào khả năng hòa tan của dung môi với chất phân tích kết hợp lực lắc, rung siêu âm chất phân tích đƣợc tách ra khỏi nền mẫu rắn hòa tan trong dung môi. Tetracycline đƣợc chiết ra khỏi mẫu thực phẩm (thịt, thủy sản, trứng, sữa, mật ong.) bằng dung dịch đệm McILvaine - EDTA pH 4± 0,05 theo các tiêu chuẩn của Việt Nam [10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19]và có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng đệm này [23], [26], [41], [48], [50], [51], [56], [52], [62] cho kết quả về độ lặp lại rất tốt, ở khoảng nồng độ từ 1 – 200 µg/kg hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 8,9%. Ngoài ra, sử dụng một số dung dịch chiết khác hỗn hợp Acetonitril + nƣớc để chiết mẫu thịt [23], [47],[61], dung dịch muối succinate điều chỉnh pH 4 để chiết mẫu trứng, sữa, thịt [23], [31] đƣa ra các két quả hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 11,2 % đối với khoảng nồng độ từ 20 – 1200 µg/kg. Tuy nhiên không có thông tin về hiệu suất thu hồi của quá trình chiết mẫu của tất cả các tiêu chuẩn và công trình nghiên cứu.

Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE) Dựa trên nguyên tắc nhiệt độ sôi của dung môi đƣợc tăng lên dƣới áp suất cao, độ nhớt dung môi và sức căng bề mặt giảm, khả năng hòa tan của chất phân tích tăng làm suy yếu liên kết giữa chất phân tích với nền mẫu. Do áp suất cao cho phép các dung môi thâm nhập sâu hơn vào nền mẫu, tạo thuận lợi cho việc chiết các chất phân tích ra khỏi nền mẫu, làm quá trình chiết nhanh hơn và độ thu hồi tốt hơn (xem Hình 1. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bơm (1500-2000 psi) Dung môi Van thanh trùng Lò (100-1800C) Van chiết Van tĩnh Bình thu Nitrogen Hình 1.1 Mô hình phƣơng pháp chiết hỗ trợ áp suất Trong phƣơng pháp này, mẫu đƣợc nghiền nhỏ, trộn với tinh thể EDTA sau đó đƣợc đƣa vào hệ thống chiết PLE, dung môi đƣợc chọn là acetonitril[43], [69]methanol điều chỉnh pH =4 [40]. Phƣơng pháp cho hiệu suất thu hồi rất tốt trong khoảng 95 – 99,8% với khoảng nồng độ 20 – 500 µg/kg.

Các phƣơng pháp làm sạch dịch chiết mẫu 1. Phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) Chiết pha rắn là quá trình phân bố của chất phân tích giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất phân tích tồn tại trong pha lỏng (pha nƣớc hoặc pha hữu cơ) còn chất chiết (pha tĩnh) ở dạng rắn, là các hạt silica trung tính, nhôm oxit, hay hạt sislica bị ankyl hóa nhóm -OH bằng nhóm carbon mạch thẳng - C2, -C4, -C8, -C18… hay nhân phenyl. Khi xử lý mẫu, dịch chiết đƣợc đƣa lên cột chiết SPE, nhóm chất cần phân tích đƣợc giữ lại trên cột, các chất khác không tƣơng tác đi ra khỏi cột cùng dung môi. Chất phân tích đƣợc rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi thích hợp Các phƣơng pháp tiêu chuẩn của Việt Nam[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19] sử dụng cột chiết SPE C18 để làm sạch tạp chất sau khi chất phân tích đƣợc chiết ra khỏi nền mẫu.

Bên cạnh đó, có một số công trình nghiên cứu đã đƣợc công bố 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cũng sử dụng cột chiết SPE C18 [23],[47],[51],[56],[57],[58],[62], [67] phù hợp với hầu hết các nền mẫu thực phẩm.