MỞ ĐẦU Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v. Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật.
Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra một loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rất quan trọng. Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.
Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1. Cấu trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO 2 NH R1 Khi thay thế các nhóm R1, R2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs khác nhau.Vì thế có cả một họ SAs. Khi R2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R2 # H, thì chất đó là tiền thuốc.
R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2-3 dị tố. Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt trong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại là Enro DC).
Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3] 1. Tính chất vật lý SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trong nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí, sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159oC – 163oC.
Metronidazol khó tan trong nước, aceton. Tính chất hoá học - SAs có tính chất lưỡng tính: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít. Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng. Có tính axít do có nguyên tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dung dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin): R R H2N SO2 N H2N SO2 N H H H2N SO2 N R Na - SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag+, và tạo phức màu kết tủa với ion Cu2+, Co2+, … - Ở nhóm amin bậc một của SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước sóng hấp thụ cực đại ở 270-273 nm.
- Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ với naphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm. Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O Muối diazoni Ở đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 của phân tử SAs. Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng. Tính chất dƣợc lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen. Ít hoặc không tác dụng trên một số vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia. Không có tác dụng đối với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại có tác dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.
Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chung đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ khác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau. Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C. perfringens), Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus.
Nó là hiệu quả đối với B. fragilis phân lập kháng với clindamycin. Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các hoạt động kháng khuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trong đường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát.
Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3] 1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs - Ức chế enzym chuyển hóa acid folic Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic. - Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com OH N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 COOH N COOH acid glutamic H2N A.PAB N N + (vitamin H ) pterin pteoryl Acid folic (acid pteoryl glutamic) Dihydrofolat syntetase (enzym) Acid Dihydrofolic Dihydrofolat sreductase (enzym) Acid Tetrahydrofolic Acid folinic Nucleoprptein Hình 1.
Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí của A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp axít này. Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việc tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trong suốt thời gian dùng SAs. SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm chức hoá học: o 6.4 A OH O NH - R Ở ngoài mặt phẳng A.PAB Sulfamit Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có sẵn trong môi trường thì không bị SAs tác dụng.
Tế bào của người và động vật lấy axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên không bị ảnh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc trên vi khuẩn. H H HH H H H H N N N N (-) (-) (-) (-) S N R OS S N O R O S O O O O O anion sulfamit anion PAB 1. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ.
Tuy nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thông qua một quy trình bốn bước: - Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí. - Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào: Metronidazole làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điện tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vi khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó. Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation oxy hóa của pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt động như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ion hydro trong chu kỳ này.
Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hình thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào. - Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND. - Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính chất và công dụng khác nhau.
Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được nghiên cứu trong luận văn này. Sulfaguanidin (SGU) Công thức: O O S NH H2N HN NH2 Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol 96 o; không tan trong metylen clorit (CHCl3); không tan trong dung dịch có tính kiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vô cơ loãng. Nhiệt độ nóng chảy 189 – 193oC. SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không thể thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn.
Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn mạnh, được dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng phù, tăng huyết áp.