Đặt vấn đề La hán (Siraitia grosvenorii) là cây thân thảo lâu năm đặc hữu ở tỉnh Quảng Tây – Trung Quốc thuộc họ bầu bí (Cucurbitacea), quả của nó thường được gọi là Luo hanguo – đã được sử dụng từ hàng trăm năm nay như một chất làm ngọt tự nhiên và là loại thuốc truyền thống để điều trị viêm họng, cũng như một phương thuốc chống ho, long đờm tự nhiên. Cho đến nay, người ta đã phân lập được hơn 100 hợp chất từ la hán bao gồm các triterpenoids, flavonoid, axit amin và polysaccharide (Gong et al., 2019) có vai trò quan trọng trong phòng chống khối u, chống oxy hóa, tăng cường khả năng miễn dịch, bảo vệ gan, hạ đường huyết và các tác dụng dược lý khác. La hán là cây thuốc có giá trị kinh tế cao cả về thực phẩm và dược liệu. Theo thống kê năm 1998, diện tích trồng cây Siraitia grosvenorii đạt 30.000 m2 cho sản lượng 110 triệu quả trị giá hơn 300 triệu NDT.
Số liệu thống kê năm 2010 cho thấy diện tích trồng là 120.000 m2, sản xuất 400 triệu quả trị giá hơn 1 tỷ NDT (Zeng et al. La hán được nhân giống bằng hạt và giâm hom, tuy nhiên việc giâm hom mất nhiều thời gian, đặc biệt la hán rất nhạy cảm với các bệnh virus như bệnh đốm lá, khảm, xoăn,… làm suy giảm giống cây trồng và giảm năng suất đáng kể. Tháng 7 – tháng 8 năm 2002, bệnh virus trên cây S. grosvenorri xuất hiện ở cả 9 thị trấn thuộc Vĩnh Phúc – Quảng Tây, Trung Quốc, 74.309 cây được phát hiện.
Kết quả cho thấy, cây bị nhiễm virus nặng chiếm tỷ lệ trung bình 52,8%, trong khi bệnh giảm ở các cây nuôi cấy mô chỉ là 13,9% (Wei et al. Tháng 9 năm 2013, các triệu chứng của bệnh đốm lá do nấm S. cucurbitacearum đã được quan sát thấy: 80% các khu vườn trồng S. grosvenorri ở thành phố Quế Lâm, cây bị bệnh nặng, rụng nhiều lá, dẫn đến các cây bị già sớm và không có quả (Jiang et al.
Nhân giống vô tính in vitro là phương pháp hiệu quả để tạo cây sạch bệnh đặc biệt là các bệnh về virus, lưu giữ được các đặc tính quý của cây mẹ do đồng 1 nhất về mặt di truyền, cho hệ số nhân giống cao, cung cấp giống một cách chủ động với số lượng cây lớn, phát triển ở quy mô công nghiệp. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh và ra rễ in vitro cây la hán quả (Siraitia grosvenorii)” nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây la hán làm cơ sở cho việc sản xuất một lượng lớn cây giống đáp ứng nhu cầu sản xuất. Mục đích Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh, ra rễ cây la hán. Yêu cầu - Xác định được môi trường nhân nhanh in vitro tốt nhất cho hệ số nhân giống cao.
- Xác định được môi trường ra rễ in vitro tốt nhất. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về cây la hán quả 2. Nguồn gốc và phân bố Cây la hán hay la hán quả có tên khoa học là Siraitia grosvenorii (Swingle) C.Zhang, thuộc chi Siraitia Merr.
Đặc điểm thực vật học La hán quả là cây thân thảo lâu năm dạng thân leo, dọc thân mọc nhiều tua cuốn có khả năng bám vào cây khác, có thể dài từ 3 – 5 m. Rễ phình to dạng hình thoi hoặc cầu. Thân và cành hơi cứng. Lá rụng theo mùa, đầu nhọn, dài 10 – 20 cm, rộng 3,5 – 12 cm; cuống lá dài 3 – 10 cm, phiến lá có hình trứng dài hay chóp nhọn, có màng, kích thước 12-23 x 5-17 cm.
Hoa đực là cụm hoa dạng chùm, có 6 – 10 hoa, cuống hoa dài 7 – 13 cm, cuống mảnh 5 – 15 mm; đài 5, dạng ống rộng hình chuông, thường có 3 vảy bắc mỏng, phân đoạn hình tam giác, đỉnh đài thuôn nhọn kích thước 4,5 x 3 mm, có 3 gân; tràng hoa màu vàng, thuôn dài, kích thước 10-15 x 7-8 mm, 5 gân, đỉnh nhọn. Hoa cái đơn độc, đài hoa và tràng hoa giống hoa đực nhưng lớn hơn, nhị lép, dài 2 – 2,5 mm, nhụy bầu thuôn dài kích thước 10-12 x 5-6 mm, màu vàng nâu đậm, mịn như nhung, gốc tròn tù, vòi nhụy 4 – 5 mm, đầu nhụy chẻ 3 mở rộng, bầu hạ 3 ô. Quả hình cầu, 6-11 x 4-8 cm, vỏ có màu xanh khi còn xanh và có màu nâu sẫm khi chín, sáng bóng, trên lớp vỏ vẫn giữ lớp lông nhung. Thịt quả màu trắng, mọng nước, có vị ngọt và mùi thơm, trong chứa nhiều hạt màu vàng nhạt, hình trứng rộng và dẹt, 15-18 × 10-12 mm, gốc hình tù, có 2 lớp cánh, lượn sóng, các cánh có rãnh.
Mùa hoa tháng 6 - tháng 8, mùa quả tháng 8 - tháng 10 (Flora of China Editorial Board of the Chinese Academy of Sciences, 2004). La hán quả - Siraitia grosvenorii (1. hạt) (Gong Xue et al. Thành phần hóa học Có hơn 100 hợp chất được phân lập từ la hán bao gồm : + 71 triterpenoids đã được phân lập từ quả bao gồm 56 cucurbitanes, 9 nor- cucurbitanes, 1 lanostane, and 5 oleananes.
+ 8 flavonoid đã được phân lập từ hoa, lá và quả (kaempferol ; kaempferol- 7-O-α-L-rhamnopyranoside ; grosvenorine ; kaempferitrin ; quercetin 3-O-β-D- glucopyranosyl 7-O-α-L-rhamnopyranoside ; 7-methoxy-kaempferol 3-O-α-L- rham-nopyranoside ; 7-methoxy-kaempferol 3-O-β-D-gluco-pyranoside ; afzelin). Các thành phần hóa học chính trong S. grosvenorii là triterpenoids, flavonoids và glycosides, trong khi các thành phần khác ít được báo cáo hơn. Cho đến nay, có 3 acid phenolic, 2 anthraquinones, 3 alkaloids ; 3 acid béo và một số hợp chất khác đã được phân lập và xác định (Gong et al.
Bộ phận sử dụng làm thuốc và công dụng của cây la hán quả Quả la hán đã được sử dụng làm thuốc trong hơn 300 năm kể từ khi được ghi nhận, có giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại thảo dược đầu tiên được sử dụng cho cả mục đích y học và thực phẩm ở Trung Quốc. 4 Theo ghi nhận trong Ủy ban Dược điển Trung Quốc (2015), S. grosvenorii có hiệu quả đáng kể trong điều trị ho, đau họng. Bencao Gangmu, là cuốn sách chuyên khảo nổi tiếng viết về y học cổ truyền Trung Quốc trong thời nhà Minh, là cuốn sách đầu tiên liệt kê các ứng dụng của loại cây này ở Trung Quốc.
Ghi chép về việc sử dụng S. grosvenorii làm thuốc long đờm để giảm đau họng, thanh nhiệt và làm ấm phổi có từ 2. Ngoài ra, nó còn được sử dụng như một chất làm ngọt tự nhiên với lượng calo thấp và độ ngọt cao so với đường sucrose (Lu et al. Chiết xuất quả la hán đã được báo cáo thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau như chống ho, chống các bệnh về tim, chống oxy hóa, tiểu đường, chống viêm và chống ung thư bên cạnh các hoạt động bảo vệ gan và điều hòa miễn dịch (Chun et al., 2014; Liu et al.
Trong số các thành phần mogroside, mogroside – V chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 0,5 – 1,4% có độ ngọt cao gấp khoảng 300 – 400 lần so với sucrose (Suzuki et al. Mogroside – V không chứa calo, cung cấp một chất thay thế hoàn hảo cho các bệnh nhân tiểu đường, người béo phì và những người đang ăn kiêng (Chen et al. Ngoài các hoạt động chống ung thư và chống oxy hóa, mogroside – V còn được chứng minh có liên quan đến việc điều chỉnh sự tiết insulin trong ống nghiệm (Takasaki et al., 2003; Takeo et al. Cơ sở khoa học của đề tài 2.
Cơ sở lý luận của phương pháp nhân giống in vitro Cơ sở lí luận của phương pháp nhân giống in vitro là tỉnh toàn năng (totipotence) của tế bảo. Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện phù hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
5 Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bảo riêng rẽ thông qua quá trình phát sinh hình thái (Ngô Xuân Bình, 2010). Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thế thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là tiến tình quy định biến đổi các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.
Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa tế bào trên cở sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Ngô Xuân Bình, 2010).
Quy trình nhân giống vô tính in vitro Quy trình nhân giống in vitro gồm 5 giai đoạn: Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị mẫu Cây mẹ phải là cây có phẩm chất vượt trội, ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, sạch bệnh đặc biệt là bệnh virus với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy in vitro.