Đặt vấn đề Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] thuộc họ củ nâu, chi Dioscorea là một cây có củ truyền thống, còn được gọi với nhiều tên khác nhau là củ từ, từ lông, từ gai. Chúng có đặc điểm thân leo, là loài giàu tinh bột. Củ Khoai Từ giàu nguồn carbohydrate và chất xơ, hàm lượng chất béo ở mức thấp tốt cho nguồn dinh dưỡng [22]. Cùng với một số loài khác như Khoai Mỡ, củ Khoai Từ trở thành nguồn lương thực, thực phẩm có ý nghĩa quan trọng đối với người nông dân các quốc gia vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là các nước châu Phi [25].
Củ Khoai Từ là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp dược phẩm và y học, chất Diosgenin có trong củ Khoai Từ được sử dụng để tổng hợp Cortisone, Pregnenolone, progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen làm giảm cholesterol trong máu [37]. Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài Dioscorea đã được các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lên khá nhanh. Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượng nghiên cứu của họ. Kohmura và cs (1995) sử dụng lá non làm mẫu nuôi cấy [36].
Theo Alizadeh và cs (1998) [21]. Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu cấy là rễ [50]. Tor và cs (1998) dùng tế bào và protoplasts [49]. Nhiều tác giả như Mantell và Hugo (1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đã thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [29], [30], [32], [40].
Tuy nhiên, có rất ít công trình nghiêm cứu hoàn thiện nhân giống cây Khoai Từ bằng phương pháp in vitro được công bố. Hầu hết các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc tách chiết các hợp chất hữu cơ có hoạt tính hóa học và sinh học trong củ Khoai Từ Trong tự nhiên, Khoai Từ tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ. Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm được truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [49]. Nhân giống Khoai Từ bằng phương pháp truyền thống đã trở nên phổ biến đối với hầu hết người nông dân, song kỹ thuật nhân giống trên cho hiệu quả thấp.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống hiệu quả cao. Với phương pháp nhân giống invitro đảm bảo chủ động số lượng lớn cây giống, đồng đều, sạch bệnh. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi n 2 tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] bằng kỹ thuật in vitro”. Mục đích nghiên cứu Đưa ra quy trình tái sinh cây Khoai Từ [Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill] bằng kỹ thuật in vitro.
Yêu cầu đề tài - Xác định được môi trường tái sinh chồi từ đốt thân cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Xác định được nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số cytokinin (BA, Kinetin) tới khả năng nhân nhanh cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta). - Xác định được nồng độ một số Auxin đến khả năng ra rễ chồi cây Khoai Từ (Dioscorea esculenta).
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây Khoai Từ bằng kỹ thuật in vitro. + Kết quả nghiên cứu đạt được có thể bổ sung vào quy trình nhân giống danh mục cây trồng. - Ý nghĩa thực tiễn: Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây Khoai Từ bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm và dược liệu. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Tính toàn năng của tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lí học thực vật người Đức Haberlandt (1902) đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [16].
Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó. Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [10]. Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau.
Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. n 4 Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung.
Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống [3]. Phân hóa Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [12]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [3]. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Khử trùng mẫu và cấy khởi động Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Mẫu sau khi được vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [2].
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc độ nhân nhanh cao [2]. Tái sinh mẫu nuôi cấy Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng (auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấm men…vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa [2].
Giai đoạn nhân nhanh chồi Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi là then chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như: nước dừa, dịch chiết nấm men,…. kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [2]. Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.
Tạo cây hoàn chỉnh Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh.