Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Chi lan Hài (Paphiopedilum) thuộc họ Lan (Orchidaceae) là một trong những nhóm thực vật có giá trị thẩm mỹ, khoa học và thương mại đặc biệt cao. Việt Nam được xác định là một trong những trung tâm đa dạng sinh học lớn của chi lan Hài với 22 loài mọc tự nhiên. Trong số đó, lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) là loài đặc hữu quý hiếm, phân bố chủ yếu tại các khu rừng nguyên sinh thường xanh trên núi đá vôi ở các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình, Sơn La, Quảng Bình và Thanh Hóa.
Trong bối cảnh môi trường sống tự nhiên bị thu hẹp do nạn phá rừng và tình trạng khai thác, thu hái quá mức để phục vụ thương mại, quần thể lan hài Giáp ngoài tự nhiên đang suy giảm nghiêm trọng và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng (được xếp vào nhóm Đang bị đe dọa tuyệt chủng theo tiêu chuẩn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế - IUCN). Về mặt sinh học, hạt lan hài không có nội nhũ nên tỷ lệ nảy mầm trong điều kiện tự nhiên rất thấp; phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống (tách nhánh) chỉ đạt tốc độ khoảng 1 cây/năm, không đáp ứng được yêu cầu bảo tồn và phát triển nguồn gen. Do đó, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) để nhân nhanh giống lan hài Giáp là một đòi hỏi cấp thiết từ thực tiễn.
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) từ đoạn thân non mang chồi ngủ bằng phương pháp in vitro.
Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định hiệu quả khử trùng của thủy ngân clorua ($\text{HgCl}_2$) ở các nồng độ và mốc thời gian xử lý khác nhau đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng 6-Benzyladenine (BA) đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân non mang chồi ngủ.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp giữa BA, Kinetin và Thidiazuron (TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Giáp.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ $\alpha$-Naphthalene acetic acid (NAA) và than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense).
- Vật liệu nghiên cứu: Các đoạn thân non, bánh tẻ mang chồi ngủ được thu thập từ vườn cây của Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
- Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Cơ sở lý thuyết
Nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học về tính toàn năng của tế bào thực vật do Gottlieb Haberlandt khởi xướng (1902), cùng các nguyên lý về sự phân hóa và phản phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, quá trình phát sinh hình thái cơ quan (tái sinh chồi, nhân chồi, cảm ứng ra rễ) chịu sự điều hòa trực tiếp của tỷ lệ phối hợp giữa hai nhóm phytohormone chính:
- Nhóm Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ): Đóng vai trò hoạt hóa quá trình phân chia tế bào, cảm ứng hình thành chồi bất định, giải phóng ưu thế ngọn và kích thích phát triển chồi nách.
- Nhóm Auxin (NAA, IBA, 2,4-D): Kích thích phân chia tế bào trụ bì, cảm ứng và kéo dài hệ thống rễ bất định.
Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
- Môi trường dinh dưỡng nền: Môi trường Murashige & Skoog (MS, 1962) bổ sung $30\text{ g/l}$ đường saccharose, $100\text{ mg/l}$ inositol, $150\text{ ml/l}$ nước dừa tự nhiên, $5{,}5\text{ g/l}$ agar tạo gel. Độ pH môi trường được điều chỉnh trong giới hạn $5{,}6 - 5{,}8$ trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ $121^\circ\text{C}$, áp suất $1{,}0\text{ atm}$ trong thời gian $15 - 20\text{ phút}$.
- Chất điều hòa sinh trưởng và phụ gia: Bổ sung tùy theo mục tiêu của từng thí nghiệm gồm BA ($0 - 5\text{ mg/l}$), Kinetin ($0 - 2\text{ mg/l}$), TDZ ($0 - 2\text{ mg/l}$), NAA ($0 - 2\text{ mg/l}$) và than hoạt tính ($0 - 2\text{ g/l}$).
- Điều kiện buồng nuôi cấy: Nhiệt độ phòng duy trì ổn định ở $22^\circ\text{C} - 25^\circ\text{C}$, cường độ chiếu sáng đạt $2000 - 2500\text{ lux}$, độ ẩm không khí $60 - 65%$, quang chu kỳ chiếu sáng $16\text{ giờ sáng} / 8\text{ giờ tối}$.
Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD). Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 bình, mỗi bình chứa 1 mẫu cấy (tổng số 30 mẫu cho mỗi công thức).
- Quy trình khử trùng bề mặt mẫu: Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy, rửa xà phòng loãng, tráng nước cất; trong tủ cấy vô trùng (laminar air flow), mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn $70^\circ$ trong 30 giây, tráng 3-5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó ngâm trong dung dịch $\text{HgCl}_2$ theo nồng độ ($0{,}1%$; $0{,}15%$; $0{,}2%$) và thời gian ($5$, $10$, $15\text{ phút}$) xác định, tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng.
- Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập, tính toán các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ bật chồi, hệ số nhân chồi và tỷ lệ ra rễ. Xử lý thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0; độ tin cậy của sai khác giữa các nghiệm thức được đánh giá qua chỉ số $\text{LSD}_{0{,}05}$ và hệ số biến động $\text{CV}%$.
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Phần này trình bày tính cấp thiết của việc bảo tồn và phát triển giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) – một loài hoa quý hiếm bản địa của Việt Nam có nguy cơ tuyệt chủng cao. Tác giả xác định rõ mục đích nghiên cứu, 4 nhiệm vụ thực nghiệm cụ thể cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài trong việc cung cấp quy trình công nghệ nhân giống vô tính phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen thực vật.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Tác giả hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu và kỹ thuật nuôi cấy mô:
- Phân loại và sinh học lan Hài: Tổng quan 5 chi lan hài trên thế giới (Cypripedium, Mexipedium, Phragmipedium, Selenipedium, Paphiopedilum); phân tích hình thái thân, lá, cấu trúc bao hoa túi đặc trưng, cơ chế thụ phấn và quả nang chứa hạt không nội nhũ.
- Đặc điểm giống lan hài Giáp (P. malipoense): Lịch sử phát hiện và mô tả khoa học năm 1954 bởi S. C. Chen và Z. H. Tsi từ tiêu bản của K. M. Feng (1947); vùng phân bố tự nhiên tại Nam Trung Quốc và các tỉnh miền núi đá vôi phía Bắc Việt Nam ở độ cao $600 - 1200\text{ m}$; đặc tính sinh thái ưa ẩm mát, nhu cầu giá thể và dinh dưỡng khoáng.
- Hiện trạng bảo tồn: Thống kê phân hạng bảo tồn các loài lan hài Việt Nam theo danh mục IUCN; mạng lưới các khu bảo tồn thiên nhiên và vườn quốc gia đang lưu giữ loài (như Ba Bể, Na Hang, Hữu Liên, Pà Cò, Phong Nha).
- Cơ sở sinh lý học và tình hình nghiên cứu in vitro: Phân tích vai trò của thành phần khoáng đa-vi lượng, vitamin nhóm B, nguồn carbon hữu cơ, nước dừa, than hoạt tính, agar, độ pH và các phytohormone; tổng hợp các kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô lan hài trên thế giới (Bubeck 1973, Stewart 1975, Huang 1988, Lin 2000, Chen 2002) và tại Việt Nam (Dương Tấn Nhựt 2005-2007 về P. delenatii, Hoàng Thị Giang 2010 về P. hangianum).
Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết vật liệu mẫu cấy (đoạn thân mang chồi ngủ), danh mục hóa chất tinh khiết, trang thiết bị phòng thí nghiệm; mô tả sơ đồ khối của quy trình công nghệ và thiết kế chi tiết 6 công thức thí nghiệm thuộc 4 nội dung chuyên sâu từ giai đoạn khử trùng tạo mẫu sạch ban đầu, tái sinh chồi, nhân nhanh chồi đến cảm ứng tạo rễ.
Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Chương này tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được qua các bảng số liệu và biểu đồ:
1. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý $\text{HgCl}_2$ đến khả năng tạo mẫu vô trùng
Kết quả theo dõi sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy chất khử trùng $\text{HgCl}_2$ có tác động quyết định đến việc loại bỏ vi sinh vật nội sinh và bề mặt:
| Công thức | Hóa chất khử trùng | Thời gian (phút) | Số mẫu cấy (mẫu) | Tỷ lệ sống không nhiễm (%) | Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) | Tỷ lệ mẫu chết (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CT1 (Đ/c) | Nước cất vô trùng | 15 | 30 | 0,00 | 100,00 | 0,00 |
| CT2 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}1%$ | 5 | 30 | 16,67 | 83,33 | 0,00 |
| CT3 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}1%$ | 10 | 30 | 30,00 | 70,00 | 0,00 |
| CT4 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}1%$ | 15 | 30 | 43,33 | 40,00 | 16,67 |
| CT5 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}15%$ | 5 | 30 | 53,33 | 36,67 | 10,00 |
| CT6 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}15%$ | 10 | 30 | 60,00 | 16,67 | 16,67 |
| CT7 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}15%$ | 15 | 30 | 43,33 | 10,00 | 46,67 |
| CT8 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ | 5 | 30 | 66,66 | 16,67 | 16,67 |
| CT9 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ | 10 | 30 | 53,33 | 3,33 | 43,33 |
| CT10 | $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ | 15 | 30 | 33,33 | 0,00 | 66,67 |
Ghi chú thống kê: $\text{LSD}_{0{,}05} = 6{,}2$; $\text{CV}% = 8{,}1$. Xử lý bằng $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ trong 5 phút (CT8) cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất ($66{,}66%$). Kéo dài thời gian xử lý lên 15 phút ở nồng độ $0{,}2%$ làm tỷ lệ mô chết tăng vọt lên $66{,}67%$ do độc tính của ion thủy ngân.
2. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang chồi ngủ
Sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường MS nền có bổ sung BA ở các thang nồng độ khác nhau, khả năng cảm ứng bật chồi đạt kết quả như sau:
| Công thức | Nồng độ BA (mg/l) | Số mẫu cấy (mẫu) | Số mẫu bật chồi (chồi) | Tỷ lệ tái sinh chồi (%) | Đặc điểm hình thái chồi |
|---|---|---|---|---|---|
| CT1 (Đ/c) | 0,0 | 30 | 4 | 13,33 | Mới nhú, chiều cao chồi thấp |
| CT2 | 1,0 | 30 | 10 | 30,00 | Chồi xanh, ngắn, thân mập |
| CT3 | 2,0 | 30 | 19 | 63,33 | Chồi xanh, gầy, dài |
| CT4 | 3,0 | 30 | 16 | 53,33 | Chồi xanh, gầy, dài |
| CT5 | 5,0 | 30 | 11 | 36,67 | Chồi xanh, ngắn |
Ghi chú thống kê: $\text{LSD}_{0{,}05} = 5{,}05$; $\text{CV}% = 4{,}4$. Bổ sung $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l}$ cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt $63{,}33%$ (19/30 mẫu), vượt trội có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ($13{,}33%$). Nồng độ $\text{BA}\ 1{,}0\text{ mg/l}$ tạo chồi mập mạp, khỏe mạnh nhất.
3. Ảnh hưởng của BA phối hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
Các chồi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường MS nền bổ sung $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l}$ kết hợp Kinetin ($0 - 2{,}0\text{ mg/l}$), đánh giá sau 30 ngày:
| Công thức | Nồng độ BA (mg/l) | Nồng độ Kinetin (mg/l) | Số mẫu cấy (mẫu) | Tổng số chồi thu được | Hệ số nhân chồi (lần) | Chất lượng chồi |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CT1 (Đ/c) | 2,0 | 0,0 | 30 | 22 | 0,73 | Xanh, gầy, dài |
| CT2 | 2,0 | 0,5 | 30 | 31 | 1,03 | Xanh nhạt, mập |
| CT3 | 2,0 | 1,0 | 30 | 58 | 1,93 | Xanh nhạt, mập |
| CT4 | 2,0 | 1,5 | 30 | 56 | 1,63 | Xanh, gầy |
| CT5 | 2,0 | 2,0 | 30 | 40 | 1,33 | Xanh, gầy |
Ghi chú thống kê: $\text{LSD}_{0{,}05} = 0{,}6$; $\text{CV}% = 3{,}4$. Môi trường kết hợp $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l}$ cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt $1{,}93\text{ lần}$ (thu 58 chồi từ 30 mẫu ban đầu), chồi phát triển đồng đều, mập mạp.
4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA, Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi
Bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng có hoạt tính mạnh Thidiazuron (TDZ) vào môi trường tối ưu ($\text{MS} + \text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l}$), đánh giá sau 30 ngày:
| Công thức | BA (mg/l) | Kinetin (mg/l) | TDZ (mg/l) | Số mẫu cấy (mẫu) | Tổng số chồi thu được | Hệ số nhân chồi (lần) | Chất lượng chồi |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CT1 (Đ/c) | 2,0 | 1,0 | 0,0 | 30 | 58 | 1,93 | Xanh nhạt, mập |
| CT2 | 2,0 | 1,0 | 0,5 | 30 | 67 | 2,23 | Xanh đậm, mập |
| CT3 | 2,0 | 1,0 | 1,0 | 30 | 88 | 2,93 | Xanh đậm, mập |
| CT4 | 2,0 | 1,0 | 1,5 | 30 | 79 | 2,63 | Xanh, bé |
| CT5 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 30 | 70 | 2,33 | Xanh, bé |
Ghi chú thống kê: $\text{LSD}_{0{,}05} = 0{,}3$; $\text{CV}% = 2{,}4$. Sự kết hợp đồng thời cả ba cytokinin ($\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l} + \text{TDZ}\ 1{,}0\text{ mg/l}$) đã nâng hệ số nhân chồi lên mức cao nhất là $2{,}93\text{ lần}$ (88 chồi/30 mẫu cấy), chồi có màu xanh đậm và sinh trưởng tốt. Nâng nồng độ TDZ lên quá mức ($1{,}5 - 2{,}0\text{ mg/l}$) khiến chồi sinh ra bị nhỏ và giảm hệ số nhân.
Phần 5: Kết luận và kiến nghị
Tổng hợp toàn bộ các kết quả nghiên cứu thực nghiệm, khẳng định việc xây dựng thành công các thông số nồng độ chất khử trùng và chất kích thích sinh trưởng cho từng giai đoạn nuôi cấy giống lan hài Giáp. Đồng thời đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục hoàn thiện giai đoạn ra rễ và huấn luyện cây con thích nghi ngoài vườn ươm.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính đạt được
Khóa luận đã xác định được hệ thống thông số kỹ thuật cho các giai đoạn nhân giống in vitro giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense):
- Khử trùng mẫu khởi đầu: Sử dụng dung dịch $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao nhất ($66{,}66%$, tỷ lệ nhiễm $16{,}67%$, tỷ lệ chết $16{,}67%$). Hoặc xử lý bằng $\text{HgCl}_2\ 0{,}15%$ trong 10 phút đạt tỷ lệ mẫu sạch sống $60{,}00%$.
- Tái sinh chồi bất định: Môi trường nền $\text{MS} + 30\text{ g/l đường} + 100\text{ mg/l inositol} + 150\text{ ml/l nước dừa} + 5{,}5\text{ g/l agar}$ bổ sung $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l}$ cho tỷ lệ tái sinh chồi từ đoạn thân mang chồi ngủ đạt cao nhất là $63{,}33%$ sau 40 ngày nuôi cấy.
- Nhân nhanh chồi: Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng tối ưu nhất là $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l} + \text{TDZ}\ 1{,}0\text{ mg/l}$, đạt hệ số nhân chồi $2{,}93\text{ lần}$ sau 30 ngày nuôi cấy, chồi thu được mập, xanh đậm và có sức sống tốt.
Giải pháp và kiến nghị của tác giả
- Ứng dụng quy trình khử trùng và công thức môi trường nhân chồi đã thiết lập vào công tác nhân giống vô tính bảo tồn nguồn gen lan hài Giáp tại chỗ.
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về giai đoạn cảm ứng tạo rễ hoàn chỉnh bằng cách khảo sát nồng độ Auxin (NAA) kết hợp than hoạt tính nhằm nâng cao chất lượng bộ rễ.
- Thử nghiệm các loại giá thể (dớn, than củi, vỏ thông, xỉ than, đá vôi) và chế độ chăm sóc dinh dưỡng khi đưa cây con in vitro ra vườn ươm (ex vitro).
Đóng góp học thuật và thực tiễn
- Khóa luận cung cấp hệ thống dẫn liệu thực nghiệm có giá trị về phản ứng phát sinh hình thái của mô chồi lan hài Giáp đối với các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin.
- Khẳng định tính hiệu quả của việc kết hợp TDZ cùng BA và Kinetin trong việc gia tăng hệ số nhân chồi đối với chi lan Hài – một đối tượng vốn rất khó nhân nhanh trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế
- Mẫu mô thu thập từ cây trồng tự nhiên mang nhiều bào tử nấm và vi khuẩn nội sinh phức tạp; việc sử dụng chất khử trùng mạnh như $\text{HgCl}_2$ ở nồng độ cao hoặc thời gian dài dễ gây độc và làm tăng tỷ lệ chết của mẫu mô ($66{,}67%$ ở công thức $0{,}2%$ trong 15 phút).
- Nghiên cứu mới hoàn thành thực nghiệm chi tiết ở các giai đoạn khử trùng, tái sinh chồi và nhân nhanh chồi trong phạm vi thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp (6 tháng).
Hướng nghiên cứu tiếp
- Hoàn thiện và đánh giá định lượng các chỉ tiêu ra rễ (số rễ/chồi, chiều dài rễ) khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA và than hoạt tính.
- Nghiên cứu quy trình thuần hóa cây con ngoài vườn ươm, xác định loại giá thể và chế độ bón phân NPK thích hợp để nâng cao tỷ lệ sống của cây lan hài Giáp trước khi chuyển giao sản xuất.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn thiết thực cho các đối tượng và hướng nghiên cứu sau:
- Sinh viên, học viên và cán bộ nghiên cứu: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Sinh học thực vật, Lâm sinh và Bảo tồn đa dạng sinh học.
- Phần nội dung đáng tham khảo nhất:
- Quy trình xử lý khử trùng các loại mẫu thực vật khó vô trùng (đoạn thân có vỏ bọc chồi ngủ) từ cây tự nhiên bằng $\text{HgCl}_2$.
- Công thức phối hợp tỷ lệ nồng độ bộ ba Cytokinin ($\text{BA} + \text{Kinetin} + \text{TDZ}$) để nhân nhanh chồi các loài phong lan đơn thân khó tái sinh.
- Phần tổng quan tài liệu chi tiết về đặc điểm phân loại học, hình thái, sinh thái và hiện trạng bảo tồn chi Paphiopedilum tại Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
1. Vật liệu khởi đầu được sử dụng trong nghiên cứu này là gì?
Vật liệu nuôi cấy khởi đầu là các đoạn thân non, bánh tẻ có mang chồi ngủ của cây lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) được thu thập từ vườn cây của Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
2. Quy trình khử trùng nào cho hiệu quả tạo mẫu sạch sống tốt nhất?
Công thức tối ưu nhất là ngâm mẫu trong dung dịch $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ trong thời gian 5 phút (sau khi đã khử trùng sơ bộ bằng cồn $70^\circ$ trong 30 giây), cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất đạt $66{,}66%$, tỷ lệ nhiễm $16{,}67%$ và tỷ lệ chết $16{,}67%$.
3. Nồng độ BA bao nhiêu là thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi?
Nồng độ $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l}$ bổ sung vào môi trường MS nền là thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi, đạt tỷ lệ tạo chồi cao nhất là $63{,}33%$ sau 40 ngày nuôi cấy (so với đối chứng không bổ sung BA chỉ đạt $13{,}33%$).
4. Công thức môi trường nào mang lại hệ số nhân chồi lan hài Giáp cao nhất?
Hệ số nhân chồi cao nhất ($2{,}93\text{ lần}$, thu được 88 chồi từ 30 mẫu cấy sau 30 ngày) đạt được trên môi trường dinh dưỡng nền MS bổ sung đồng thời: $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l} + \text{TDZ}\ 1{,}0\text{ mg/l}$.
5. Thành phần môi trường dinh dưỡng nền được sử dụng xuyên suốt đề tài gồm những chất nào?
Môi trường nền gồm: Các khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin theo công thức Murashige & Skoog (MS, 1962), kết hợp $30\text{ g/l}$ đường saccharose, $100\text{ mg/l}$ inositol, $150\text{ ml/l}$ nước dừa tự nhiên và $5{,}5\text{ g/l}$ agar; độ pH được chỉnh ở mức $5{,}6 - 5{,}8$.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Phương Nhung đã nghiên cứu thực nghiệm thành công các công đoạn cơ bản trong quy trình nhân giống in vitro loài lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense). Đề tài đã xác định được công thức khử trùng mẫu hiệu quả bằng $\text{HgCl}_2\ 0{,}2%$ trong 5 phút, nồng độ $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l}$ tối ưu cho tái sinh chồi ($63{,}33%$), và tổ hợp $\text{BA}\ 2{,}0\text{ mg/l} + \text{Kinetin}\ 1{,}0\text{ mg/l} + \text{TDZ}\ 1{,}0\text{ mg/l}$ cho hệ số nhân chồi cao nhất ($2{,}93\text{ lần}$). Kết quả nghiên cứu là nguồn dẫn liệu khoa học chuẩn xác, đóng góp giải pháp kỹ thuật thiết thực cho công tác lưu giữ, nhân giống và bảo tồn nguồn gen lan hài quý hiếm của Việt Nam.