MỞ ĐẦU 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây trồng. Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn. Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được phát hiện [1].
Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2]. Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống.
Hạt nảy mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không đa dạng. Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương. Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách.
Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên. Để cải thiện hệ số nhân giống cây Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang. Nuôi cấy 1 mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống và bảo tồn này.
Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền của bố mẹ. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang”. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang.
Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành ở các độ tuổi khác nhau. - Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành. - Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó khăn. Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”, có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế.
Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn. Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn”. Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành, nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt Lập, huyện Tân Yên. Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại.
Theo ông Nguyễn Văn Được, 72 tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ nhưỡng không hợp”. Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi dành. Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ. Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng.
Những căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ nhỏ dùng chút ít là khỏi [3]. Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae), chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ. 3 Đặc điểm nông sinh học: Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4 - 5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc; Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và vị ngọt mát. Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt.
Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm, cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng. Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục cụm hoa, dài 2,5-3 cm. Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12 cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy. Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai.
Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời. Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả. Bầu hình thuôn, dài bằng nhị. Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy.
Hạt 2-3, hình trứng, cỡ 1 cm. Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt. Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4]. Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô, thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5].
THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A, millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside D, khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol của dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ. Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn 95o củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin, medicarpin, homopterocapain [8]. Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn ether và ethyl acetat dịch chiết củ M. speciosa: docosanoic acid, tetracosane, octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin, maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và daucosterol.
Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin, rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có mặt trong cây [9]. Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược liệu [10]. Jun Cheno và cộng sự đã phân lập được 3 isoflavon glycosid từ thân loài Callerya nitida (Millettia nitida var. hirsutissima) gồm: formononetin 7- O-b-D-(6-ethylmalonyl)- glucopyranoside (hirsutissimiside A); 5- Omethylgenistein 7-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-b-D-glucopyranoside (hirsutissimiside B); retusin 7,8-di- O-b-Dglucopyranoside (hirsutissimiside C) [11].
Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein, auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12]. Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân loài Callerya reticulata var. reticulata (Millettia reticulata Benth. Theo Đỗ Tất Lợi, loài M.
speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14] 1.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA.
Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật.
